ADHESION OF CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE: THE ROLE OF SURFACE STRUCTURES AND FORMATION MECHANISM

Full Text

Главным фактором патогенности Corynebacterium diphtheriae, характеризующегося внеклеточным расположением в организме, является экзотоксин. Процесс токсинообразования и механизм его воздействия на человеческий организм хорошо изучены. Однако в настоящее время очень мало известно о начальном этапе развития дифтерийной инфекции - адгезии, которая является необходимым условием для размножения возбудителя дифтерии, увеличения численности его популяции и продукции токсина. Адгезия играет важнейшую роль в колонизации возбудителем слизистой оболочки зева, лежащей в основе здорового бактерионосительства, без искоренения которого невозможна полная ликвидация дифтерии [1]. В связи с этим, способность к адгезии рассматривается как один из ведущих факторов патогенности C. diphtheriae [38]. Адгезия представляет собой сложный многокомплексный процесс, обеспечивающий колонизацию микроорганизмами любых плотных субстратов, включая ткани человеческого организма и животных [5, 30, 35, 40, 45]. Прикрепление бактерий к эпителиальным клеткам - первый этап развития большинства инфекций. В основе специфического прикрепления бактерий к клеткам лежит сродство соответствующих адгезинов к субстратам, выполняющим функцию рецепторов [30, 40]. Патогенные бактерии имеют невероятно большое разнообразие молекул адгезии, которые позволяют им прикрепляться к различным компонентам поверхности клетки-хозяина и занимать определенные ниши в человеческом организме [40]. Процесс адгезии у возбудителя дифтерии имеет общие закономерности с таковым у других грамположительных бактерий. В реализации контакта микроорганизм-хозяин важную роль играет строение клеточной стенки бактерий и наличие пилей или фимбрий. Пили являются структурами, обеспечивающими адгезию, и обнаружены у таких грамположительных микроорганизмов, как представители рода Corynebacterium, Streptococcus, Actinomyces и др. [7, 18, 40, 49]. Кроме фимбрий или пилей существует множество неполимерных адгезинов, которые распознают различные структурные элементы поверхности тканей хозяина (рецепторы), в том числе, компоненты внеклеточного матрикса - коллаген, эластин, гликопротеины, гиалуро-новая кислота. Рецепторы клеток хозяина (углеводы или пептидные белковые фрагменты) имеют структуру, комплементарную адгезину, и находятся на поверхности эукариотической клетки [5]. Адгезивные гликопротеины человека, такие как фибронектин и фибриноген, могут присутствовать в секретах или плазме, быть ассоциированными с молекулами мембран и распознаваться многими различными видами патогенных бактерий [26]. Поверхностные белки являются ключевыми факторами запуска инфекционного процесса у большинства бактериальных патогенов. Более 40 лет назад Sjoquist J. [47] представил первые доказательства того, что поверхностные белки грамположительных бактерий обладают способностью прикрепляться к клеткам восприимчивого организма. Значительная часть грамположительных микроорганизмов посредством поверхностных белков, пилей или фимбрий связывается с мембранами клеток хозяина, уклоняясь от факторов врожденного и приобретенного иммунитета. Затем происходит колонизация возбудителями клеток человеческого организма и в ряде случаев межклеточное и внутриклеточное распространение в эпителиальных тканях и клетках иммунной системы хозяина [35]. Многие поверхностные белки (в том числе адгезины) у грамположительных бактерий ковалентно связаны с пептидогликаном клеточной стенки с помощью ферментов сортаз [15]. У большинства грамположительных микроорганизмов структуры пилей были описаны сравнительно недавно, а в последнее время стали известны механизмы сборки пилей [50]. Сборка пилей (фимбрий) у грамположительных бактерий может требовать наличия такого уникального фактора, как фермент транспептидаза [27, 36, 49, 54]. У многих грамположительных микроорганизмов вся клеточная поверхность, включая пили (фимбрии) и пептидогликан клеточной стенки, практически является адгезивной. С помощью фимбрий (или пилей) бактерии инициируют плотное взаимодействие возбудителя с клетками хозяина. В геномах этих бактерий обнаружены характерные кластеры фимбриальных генов, кодирующих синтез множества сортаз (транспептидаз) и транскрипционных регуляторов, координирующих экспрессию фимбрий в ответ на изменение условий внешней среды [8, 10, 12, 19, 29, 32, 34, 48, 52]. В настоящее время экспериментальные данные по изучению адгезии С. diphtheriaе на клетках хозяина ограничены, однако известно, что в этом процессе участвуют как непосредственно компоненты клеточной стенки, так и поверхностные структуры - пили (фимбрии), ковалентно связанные с пептидогликаном [30, 33]. Микроорганизмы рода Corynebacterium характеризуются сложным строением клеточной стенки, которая напоминает таковую у микобактерий [14, 17]. Цитоплазматическая мембрана С. diphtheriae покрыта слоем пептидогликана, ковалентно связаного с арабиногалактаном, который является дополнительным гетерополисахаридным слоем. Пептидогликан содержит диаминопимелиновую кислоту и связан с миколовыми кислотами, а также с производным миколовой кислоты - коринемиколатом [23]. Над поверхностным слоем пептидогликана расположен липид - димиколат трегалозы, названный корд-фактором. С этим полимером граничит слой миколовых кислот, липидоманнан и липоарабиноманнан. Верхний наружный слой клеточной стенки состоит из свободных полисахаридов, гликолипидов и белков, включая пили. Вся оболочка коринебактерий пронизана белками - коринебактериальными поринами [13]. Цитоплазматическая (или плазматическая) мембрана (ЦПМ) - основной диффузный барьер клеток С. diphtheriaе. Как и у других бактерий, ЦПМ С. diphtheriaе состоит из фосфолипидов, собранных в липидный бислой, который дополнительно содержит другие полярные липиды, жирные кислоты (насыщенная пальмитиновая и ненасыщенная деценовая) и большое разнообразие белков. Такая структура ЦПМ чрезвычайно важна для реализации процессов переноса и биоэнергетики клетки [13]. Основными фосфолипидами ЦПМ являются фосфа-тидилглицерол, дифосфатидилглицерол и фосфатидилинозитол. Состав жирных кислот может существенно изменяться в зависимости от условий окружающей среды (низкая температура или наличие остатка углерода). Жирные кислоты синтезируются путем последовательных циклов многоступенчатой реакции [43, 44]. Описано два различных типа синтеза жирных кислот (FAS - fatty acid synthesis). При реализации типа FAS-I задействован крупный многофункциональный белковый комплекс, типа FAS-II - минимум семь функциональных областей, необходимых для синтеза жирных кислот. Протеины FAS-I обнаружены у представителей семейства Corynebacteriасeae, в том числе и С. diphtheriaе. Тип FAS-II, обычно обнаруживаемый у многих бактерий, отсутствует у некоторых коринебактерий, в частности, у С. diphtheriaе [13]. Как и у других бактерий, гликановую часть макромолекулы пептидогликана составляют чередующиеся Р-1,4-связанные N-ацетилглюкозаминовые и N-ацетиловые единицы мурамо-вой кислоты. Образование поперечных связей между различными полимерами гликана происходит через пептидные связи. Пептидогликан у С. diphtheriaе «сшит» напрямую, как и у C. bovis, C. pseudodiphthericum, C. pseudotuberculosis, C. striatum, C. ulcerans и C. xerosis. Межпептидные мостики, которые можно обнаружить у других грамположительных бактерий, отсутствуют. Сложная архитектоника пептидогликана коринебактерий обеспечивает ригидность их клеточной оболочки и форму клеток [13]. В отличие от Escherichia coli или Bacillus subtilis, каркас клеточной стенки коринебактерий и родственных им таксонов состоит не только из пептидогликана, в нем имеется также слой арабиногалактана, ковалентно сшитый с пептидогликаном, который, в свою очередь, связан с миколовыми кислотами [13, 16, 40]. Арабиногалактан - гетерополисахарид, состоящий из D-арабинозы и D-галактозы. У C. glutamicum чередующиеся «сшитые» остатки D-галактозы образуют линейную цепочку примерно из 30 сахарных долей, соединенных с пептидогликаном связывающим агентом. Арабиногалактан у C. glutamicum состоит только из арабинозы и галактозы, а у C. diphtheriae включает и большое количество маннозы, у C. amycolatum и C. xerosis отличается дополнительным содержанием глюкозы [41]. В любом случае, арабиногалактан обеспечивает ковалентную связь не только с пептидогликаном, но и с наружной мембраной [13]. Миколовые кислоты и миколат трегалозы формируют второй барьер проницаемости, эквивалентный наружной мембране грамотрицательных бактерий, что является главной особенностью коринебактерий, нокардий и микобактерий. На эффективность этого барьера оказывает немалое влияние содержащаяся в нем миколовая кислота [21]. Внутренняя часть слоя миколовой кислоты коринебактерий сформирована, главным образом, миколовыми кислотами, связанными с арабиногалактаном; во внешнем слое преобладают трегалоза и глицерин-эстерифицированные миколовые кислоты. Кроме того, можно обнаружить незначительное количество свободных миколовых кислот. В коринебактериях обнаружены миколовые кислоты приблизительно с 30 атомами углерода (коринемиколаты), в нокардиях - с 50 (нокардиомиколаты), в микобактериях - с 70 - 90 (эумиколаты) [16]. По сравнению с линейными жирными кислотами фосфолипидов, миколовые кислоты являются длинноцепочечными а-разветвленными и P-жирными оксикислотами [31]. Слой миколовых кислот функционально эквивалентен наружной мембране грамотрица-тельных бактерий не только как физиологический барьер проницаемости, но и как важный компонент взаимодействия хозяин-паразит [13]. Составные элементы слоя миколовых кислот могут активировать систему врожденного иммунитета, способствуя экспрессии TLR, и ингибировать функцию макрофага [13]. Эти свойства были наилучшим образом показаны на примере Mycobacterium tuberculosis [25]. Димиколат трегалозы (корд-фактор), называемый также фактором жгутообразований, препятствует лизису микобактерий внутри макрофага хозяина, способствуя, в то же самое время, активации макрофага [25]. Относительно кори-небактерий данные не столь обширны, однако известно, что он способствует устойчивости к фагоцитозу и считается фактором патогенности C. diphtheriae. Корд-фактор, которым обладает возбудитель дифтерии, нарушает процессы дыхания и фосфорилирования клеток макроорганизма [22]. У коринебактерий, как и у других прокариот, липидный бислой клеточной оболочки не симметричен. Причиной асимметрии является введение гликоконьюгатов в ее внешний слой. Производные липидоманнана и липоарабиноманнана обнаружены у различных видов кори-небактерий [41], причем распределение липидоманнан- и липоарабиноманнан подобных веществ видоспецифично. У C. diphtheriae обнаружено практически равное распределение липидоманнан- и липоа-рабиноманнан производных [41]. В клеточной стенке C. diphtheriae обнаружен липоарабиноманнан массой 10 кД, получивший название CdiLAM. Основная структура CdiLAM C. diphtheriae схожа с липоарабиноман-наном микобактерий и несколько отличается от липоарабиноманнана нокардий и других коринебактерий. CdiLAM, расположенный на поверхности клеточной оболочки C.diphtheriae, способствует связыванию с эпителиальными клетками хозяина и, взаимодействуя с TLR2, активирует дендритные клетки и Т-хелперы [33]. CdiLAM, в отличие от нефимбриального адгезина 67-72, не связывается с эритроцитами человека, но взаимодействует с клетками Нер- 2. Обработка бактериальных клеток штамма Cdiphtheriae 241 IgG к CdiLAM полностью блокировала процесс их адгезии на Нер-2 клетках [33]. Кроме того, очищенный CdiLAM ингибировал присоединение С. diphtheriae к клеткам Нер-2. Следовательно, на основании поведения CdiLAM на клетках респираторного тракта его можно рассматривать как адгезин и потенциальный фактор вирулентности С. diphtheriae [13]. Нефимбриальный поверхностный белок - 67-72р, или DIP0733, кодирующийся одним геном, обнаружен у штаммов C. diphtheriae, лишенных фимбрий [14]. Белок 67-72p способен распознавать и специфически связываться с эритроцитами человека, вызывая их гемагглюти-нацию [46]. Обнаружение клеточного (а не фимбриального) адгезина объясняет, почему некоторые авторы не выявили пилей у штамма, обладающего гемагглютинирующей активностью [3]. Кроме того, белок 67-72p способен связываться и с клетками Hep-2 [33], причем присоединение к данной линии эпителиальных клеток блокируется анти-67-72р IgG. Интересно, что была установлена отрицательная корреляция между способностью C. diphtheriae к адгезии на клетках линии Hep-2 и эритроцитах: штамм с низкой гемагглютинирующей способностью показал высокую активность адгезии к Hep-2 клеткам, и наоборот [38]. Дифтерийные токси-генные штаммы, выделенные от больных, оказались более адгезивными (в отношении эритроцитов), чем носительские штаммы. Среди последних наиболее адгезивными оказались штаммы, выделенные при длительном ностельстве [2]. Установлено, что белок 67-72p способствует также инвазии C. diphtheriae в клетки Нер-2 и индуцирует их апоптоз [33]. Поверхностный белок DIP1281 вначале считался ассоциированным с инвазией. Белок DIP1281 является представителем группы NlpC/P60 - большого надсемейства, объединяющего несколько различных групп белков [9, 51], в том числе и предполагаемых протеаз, являющихся белками, связанными с инвазией. Он встречается у бактерий, бактериофагов, РНК-вирусов, эукариот, а также у различных представителей непатогенных и патогенных коринебактерий, в частности C. diphtheriae, С. efficiens, Cglutamicum и C. jeikeium [38]. Окрашивание бифлюоресцентными красителями и атомно-силовая микроскопия показали, что мутации DIP1281 вызывают изменение белковых структур клеточной поверхности и формирование цепей бактериальных клеток. DIP1281 не является ключевым фактором при отделении пептидогликанового слоя делящихся бактерий: разрушение цепей не снижает жизнеспособность бактерий. Функции DIP1281 ограничены наружной мембраной C. diphtheriaе [38]. Структурные повреждения, вызванные дефектом DIP1281, препятствуют адгезии соответствующих мутантов возбудителя дифтерии к эпителиальным клеткам хозяина и инвазии в них, что свидетельствует о его роли не только в инвазии, но и в адгезии[38]. Коринебактериальные порины - каналообразующие белки, способствующие транспорту питательных веществ в клетку. Наиболее хорошо порины изучены у Cglutamicum, где представлены в виде PorA-, PorB-, PorC- и PorH-белков. Гомологи этих белков обнаружены у C. diphtheriae, Corynebacterium callunae, C. efficiens [13]. Белковые нити на поверхности коринебактерий, известные как пили или фимбрии - наиболее хорошо изученный фактор адгезии, необходимый для последующей колонизации. Пили (фимбрии), ковалентно связанные с пептидогликаном клеточной стенки, являются главным структурным компонентом бактерий для прикрепления их к абиотическим и биотическим поверхностям. Среди представителей семейства Corynebacteriaceae пили впервые были обнаружены у C. renale [53], позже у С. diphtheriae [45, 49]. В геноме типового штамма С. diphtheriae NCTC13129, относящегося к эпидемическому клону Rossija/Sankt-Peterburg, представлены три различные генетические кластеры: spaABC, spaDEF, spaНGI. Каждый кластер кодирует синтез фимбрий соответствующих типов, представленных основными белками SpaА, SpaD и SpаH, формирующими ось фимбрий [48], Помимо основных белков, в состав пилей входят и другие (малые) субъединицы: SpaB, SpaC, SpaB, SpaF, SpaG и SpaI. SpaB равномерно распределяется вдоль стержня пиля, а SpaC, SpaF или SpaG располагаются на его конце. Штаммы C. diphtheriae характеризуются разнообразным набором пилей [37] с различными биофизическими свойствами. Между пилями разных типов имеются антигенные различия. Кластеры генов, кодирующих каждый тип фимбий, содержат гены сортаз (srt - surface protein sorting). Эти транспептидазы специфически катализируют ковалентное связывание фимбриальных протеинов между собой, а основание фимбрий - с клеточной стенкой бактерий. Для такого связывания в С-концевом участке молекулы белка имеется специфический сайт с аминокислотной последовательностью LPxTG (где «х» обозначает любую аминокислоту). Сортаза расщепляет данную последовательность и связывает белок с определенной аминогруппой другого мономера, образуя, таким образом, полимерную основу фимбрии. Для катализируемого сортазами «заякоривания» белка в клеточной стенке важную роль играет располагающийся следом за LPxTG-участком гидрофобный мембранный домен, а также концевая часть молекулы с положительным зарядом. Фиксация белка в клеточной стенке наступает в результате сортазозависимого расщепления LPxTG-последовательности между треонином (Т) и глицином (G) с последующим связыванием остатка треонина с аминогруппой пептидогликана [19, 20]. SpaA-тип фимбрий C.diphtheriae кодируется кластером генов spaA-srtА-spaB-spaC. Структурная основа пиля SpaA-типа состоит из большой SpaA-субъединицы, на боковой поверхности которой располагается малая субъединица SpaB, а на кончике пиля находится другая малая субъединица SpaC. Подобным образом устроены SpaD- и SpаH-пили. Наличие LPxTG-мотива как у больших, так и у малых фимбриальных субъединиц Cdiphtheriae делает возможным катализируемое сортазами закрепление их на бактериальной клеточной стенке в мономерной форме. Показано, что малые субъединицы фимбриальных протеинов (SpaB, -C, -E, -F, -G, -I) могут быть связаны не только с большими фимбриальными субъединицами (SpaA, -D, -H), но и непосредственно с клеточной стенкой [28, 29]. Следовательно, адгезивной у коринебактерий может являться вся поверхность клеточной стенки. Формирование пилей и скорость адгезии - не связанные процессы, и штаммы, их не имеющие, также могут прикрепляться к клеткам хозяина [38], что указывает на наличие факторов адгезии помимо пилей (CdiLAM, белок 67-72p и DIP1281). Адгезия каждого типа пилей контролируется минорным антигеном пилей, содержащим аминокислотную последовательность LPxTG и «заякоренным» в клеточной стенке корине-бактерий, и происходит строго индивидуально к разным типам эпителиальных клеток [48, 49]. Каждый тип пилей, предположительно, реагирует с соответствующими структурами (рецепторами) эпителиальных клеток, что позволяет С. diphtheriae колонизировать различные виды 8. ЖМЭИ 4 № 32 слизистых оболочек [50]. Наличие пилей различных типов у одного микроорганизма обусловливает их избирательную функциональную активность, тропизм к определенным клеткам и тканям. 113 Пили SpaA-типа обеспечивают взаимодействие Cdiphtheriae с фарингеальными эпителиальными клетками. Адгезия на эпителии гортани и бронхов происходит за счет пилей SpaD и SpaH типов [37]. Интересно, что при отсутствии SpaA-субъединицы и, соответственно, нитевидных выростов SpaA-типа коринебактерии остаются способными адсорбироваться на фарингеальных клетках, а в отсутствии малых субъединиц SpaB- и SpaC-типа - нет. Это объясняется тем, что большие субъединицы являются лишь структурными компонентами пилей, а малые - функциональными компонентами, играющими ключевую роль в адгезии. При исследовании адгезии возбудителя дифтерии в культуре клеток Нер-2 обнаружены две модели их взаимодействия: локализованная и диффузная. При локализованной модели коринебактерии формируют изолированные «микроколонии» на поверхности клеток Нер-2, тогда как при диффузной - хаотично располагаются по поверхности [39]. На начальных этапах инфекционного процесса минорные пилины Spa типа, ассоциированные с пилями и клеточной стенкой, формируют зону «тесной адгезии», участвуя, с одной стороны, в связывании с клеткой хозяина в составе пилей, с другой - находясь в составе клеточной стенки бактерии. Вначале с рецепторами эпителиальных клеток связываются концы пилей, затем - боковые субъединицы от верхушки до основания пилей по типу замка-«молнии» [29]. Впоследствии во взаимодействие вступают малые субъединицы, расположенные на клеточной стенке коринебактерий, что обеспечивает тесный контакт бактериальных адгезинов и человеческих клеток. Такая плотная адгезия играет важную роль в патогенезе, предотвращая диссоциацию бактерий, усиливая их взаимодействие с клетками хозяина и колонизацию. Процесс адгезии C. diphtheriae облегчается действием фермента нейраминидазы (сиали-дазы), разрушающей сиаловые кислоты на поверхности клетки хозяина, тем самым освобождая клеточную поверхность от слизи и интенсифицируя межклеточное взаимодействие. В дальнейшем токсин, связываясь со своим рецептором, проникает внутрь клетки хозяина и парализует ее жизнедеятельность посредством ингибирования синтеза белка. Клетка некро-тизируется, и таким образом формируется безопасное убежище для адгезированного возбудителя, где он может размножаться, колонизируя другие клетки хозяина [40]. При колонизации специфические белки пилей экспрессируются на поверхности вновь образующихся бактериальных клеток, что облегчает дальнейшее их прикрепление к клеткам хозяина [14, 29, 40]. В фагоцитирующих клетках, помимо этого, выживание C. diphtheriae может быть обусловлено и их способностью индуцировать апоптоз и некроз человеческих макрофагов [11]. Интересно, что как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы коринебактерий способны адгезироваться на поверхности макрофагов и вызывать их гибель. Способность C. diphtheriaе убивать нефагоцитирующие клетки может быть полезной для выживания штамма и инвазии в глубокие ткани. Индукция апоптоза и некроза при дифтерийной инфекции не всегда напрямую связана с продукцией дифтерийного токсина, а может быть обусловлена и действием поверхностных структур C. diphtheriaе и ферментов патогенности [6]. Токсигенные штаммы C. diphtheriae обладают более выраженными адгезивными свойствами, чем нетоксигенные. При исследовании процессов адгезии живых и убитых культур токси-генного штамма C. diphtheriae DSM43989 установлено, что наиболее высокой адгезивной активностью обладала убитая культура по сравнению с живой [39]. Это свидетельствует о том, что дифтерийный токсин оказывает повреждающее действие на рецепторы адгезинов клетки хозяина, нарушая тем самым адгезию возбудителя [40]. Нетоксигенные штаммы слабо адгези-руются, и только небольшое количество бактерий проникает внутрь клетки [28]. Известно, что коринебактерии могут вызывать не только дифтерию, нетоксигенные штаммы вызывают такие заболевания, как эндокардит, бактериемия, остеомиелит, абсцесс селезенки и септический артрит [42]. Эти системные инфекции предполагают не только прикрепление коринебактерий к эпителиальным клеткам (адгезию), но и проникновение их в более глубокие ткани (инвазию) и сохранение в них (персистенцию). Описаны случаи прижизненной бактериемии у больных дифтерией и выделения токсиген-ного возбудителя из крови и органов умерших, что могло быть свидетельством инвазивности С. diphtheriae [23]. Молекулярная основа инвазии коринебактерий остается неясной, однако выше уже указывалось на роль поверхностного белка DIP1281 в инвазии C. diphtheriaе в эпителиальные клетки [39]. Перспективным на сегодняшний день является поиск средств, способствующих снижению адгезивной и инвазивной активности C. diphtheriaе, препятствующих их колонизации и размножению. Снижение адгезии и колонизации бактерий на слизистых оболочках «входных ворот» может обеспечить прерывание инфекционного процесса на начальном этапе вплоть до его прекращения и является перспективным направлением в системе борьбы с дифтерийным бактерионосительством. Таким образом, процесс адгезии, обусловленный поверхностными структурами С. diphtheriaе, играет ключевую роль в последующей колонизации возбудителем слизистой оболочки зева. Персистенция С. diphtheriaе в организме при бактерионосительстве может быть связана с адгезинами, которые, как предполагают [4], участвуют в формировании биопленки. C учетом данных [33] о способности адгезинов С. diphtheriaе стимулировать действие факторов врожденного и приобретенного иммунитета перспективным в системе профилактики дифтерийного бактерионосительства является разработка новых вакцинных препаратов на основе адгезинов. Создание вакцин, формирующих иммунологическую защиту организма от адгезивной и инвазивной активности С. diphtheriaе, а также препятствующих их колонизации, позволило бы решить проблему дифтерийного бактерионосительства, справиться с которой существующими средствами вакцинопрофилактики невозможно.

About the authors

G. G Kharseeva

Rostov State Medical University, Rostov-on-Don, Russia

A. A Alieva

Rostov State Medical University, Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files