CONTEMPORARY CONCEPTION OF IMMUNE RESPONSE ACTIVATION MECHANISM BY CONJUGATED POLYSACCHARIDE VACCINES

Full Text

Инкапсулированные бактерии, такие как Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis и Haemophilus influenzae тип b, являются широко распространенными патогенами, вызывающими тяжелые заболевания, такие как сепсис, пневмония и менингит. Особую опасность эти патогены представляют для пациентов с иммунодефицитными состояниями, пожилых и детей [37]. Капсулы бактерий понижают эффективность фиксации комплемента и опсонизации бактерий, что блокирует фагоцитоз микроорганизмов [38]. Вместе с тем, экзополисахариды бактерий (ЭПС), формирующие капсулу, как правило, иммуногенны и могут быть использованы как антигены для создания вакцин [34, 58]. Согласно классической концепции, ЭПС относятся к так называемым Т-независимым (Ti) антигенам, иначе говоря, антигенам, в распознавании которых принимают участие только В-лимфоциты [16]. Согласно этой концепции считается, что экзополисахариды бактерий не процессируются антиген-презентирующими клетками [36]. Независимость иммунного ответа к ЭПС от Т-клеток постулирована на основании того, что при иммунизации такие антигены индуцируют главным образом IgM изотипа и в меньшей степени изотипа IgG2 без значительного переключения изотипов и при отсутствии индукции IgG1 и IgG3 [4, 34, 37]. Формирование T-клеточной памяти при иммунизации Ti-антигенами не происходит, вторичный иммунный ответ отсутствует, а В-клеточная память существенно отличается от таковой для белковых антигенов. В результате при иммунизации неконъюированным ЭПС иммунный ответ не развивается у детей до 18 месяцев, а также при иммунодефицитных состояниях [22, 20]. Эффективность защиты от инфекции при иммунизации полисахаридными вакцинами у старших возрастных групп также остается под вопросом и требует дополнительных исследований [30]. Уместно отметить, что наличие иммунологической памяти к Ti антигенам, в частности, к ЭПС было обнаружено сравнительно недавно [18]. Способность усиливать иммуногенность полисахаридных антигенов (ПС) за счет Td антигенов впервые была обнаружена Эвери и Гобелем в 1929 году. Было показано, что слабая иммуногенность ЭПС типа 3 S. pneumoniae может быть усилена путем химической конъюгации полисахарида с белковыми носителями [8]. Однако практическое использование обнаруженного феномена стало возможным почти 60 лет спустя, когда в клиническую практику впервые были введены конъюгированные вакцины для профилактики инфекции H. influenzae (Hibvaccines) [55]. В дальнейшем, были разработаны высокоэффективные конъюгированные вакцины для профилактики стрептококковой (S. pneumoniae тип 3) и менингококковой (N. meningitidis) инфекций [50]. Конъюгированные полисахаридные вакцины обеспечили многократное снижение заболеваемости и смертности от указанных инфекций, особенно в детском возрасте [12]. Успех в модификации иммунного ответа к ЭПС различных патогенов, выраженный в значительном повышении эффективности вакцинации, тем не менее, не способствовал глубокому пониманию механизма активации и модификации иммунного ответа к полисахаридным антигенам при их конъюгации с белками. Согласно традиционным воззрениям на механизм модуляции иммунного ответа гликоконъюгатны-ми вакцинами взаимодействие конъюгата с В-клеточным рецептором вызывает его интернализацию, процессинг и презентацию белковых Т-клеточных эпитопов CD4+ T-лимфоцитам в контексте MHCII. Было показано, что ковалентная конъюгация ПС критична для развития Т-зависимого иммунного ответа [53]. Таким образом, белок-носитель стимулирует CD4+ Т-лимфоциты, которые, в свою очередь, стимулируют B-лимфоциты, специфичные к гликозидной части антигена путем соответствующего межклеточного взаимодействия [22, 20]. Также было показано, что взаимодействие B7-CD28 и CD40-CD40L между B- и Т-клетками в дополнение к взаимодействию TCR-MHCII необходимо для модификации иммунного ответа к конъюгату по сравнению с неконъюгированным ЭПС, в частности для переключения изотипа IgM-IgG [22] и индукции смешанного Th1/Th2 цитокинового ответа и иммунологической памяти [29, 30, 39]. Разработка гликоконъюгатных вакцин, доступных в настоящее время в клинике, велась, главным образом, на основе эмпирических методов, а не углубленного анализа иммунного ответа и изучения структурно-функциональных основ его индукции к олигосахаридным и к композитным, конъюгированным антигенам. Поскольку в рамках классической модели иммунного ответа к конъюгированным антигенам считается, что активация Т-лимфоцитов происходит исключительно за счет белкового компонента конъюгата, в качестве белковых антигенов, как правило, использовали высокоиммуногенные бактериальные белки. К ним относятся дифтерийный и столбнячный анатоксины, белки внешней мембраны менингококков и некоторые другие [48, 49]. Основанием для использования этих антигенов является их применение в календарных прививках и, как следствие, предсуществующий иммунный ответ, который может дополнительно усиливать ответ на полисахаридеые антигены, конъюгированные с этими носителями. На основании описанной парадигмы разработка конъюгированных вакцин велась практически до самого последнего времени. Постепенно накапливались данные о том, что классическая модель, описывающая отличия иммунного ответа к белковым гликоконъюгатам по сравнению с неконъюгированными полисахаридами, может оказаться недостаточной для описания ряда экспериментальных данных, полученных при изучении иммунного ответа к конъюгированным вакцинам [4]. Например, несмотря на то, что для синтеза менингококо-вой конъюгированной вакцины в качестве носителей для различных вариантов вакцины использовались высокоиммуногенные бактериальные антигены (дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, белок внешней мембраны OMP N. meningitidis), иммунный ответ при вакцинации различными вариантами конъюгатов значительно варьировал. В частности, конъюгат с OMP был в достаточной степени иммуногенным после единственной вакцинации, тогда как конъюгаты с другими партнерами требовали двух и более вакцинаций для обеспечения сравнимого иммунного ответа [4, 20, 48]. Протективный эффект конъюгата с дифтерийным анатоксином в ряде популяций был значительно ниже, чем в случае других конъюгатов [24]. Авидность антител, индуцированных конъюгированными вакцинами на основе различных белковых партнеров, также варьирует [3]. Кроме того, оказалось, что эффективность иммунного ответа, индуцированного к каждому из семи различных серотипов капсульного антигена пневмококков, существенно варьировала, несмотря на то, что все серотипы ЭПС конъюгировались с одним и тем же белком (CRM197) и реакция конъюгации с каждым из серотипов ЭПС проводилась по отдельности, исключая конкуренцию между ними за белковый носитель [11, 52]. Анализ эффективности процессинга белкового антигена с использованием Т-клеточной гибридомы к CRM197 показал, что эффективность презентации одного и того же эпитопа CRM197 значительно меняется в зависимости от серотипа пневмококкового ПС антигена, с которым конъюгирован белковый носитель. Важно также заметить, что наиболее эффективно презентировался неконъюгированный CRM197, тогда как конъюгация с различными серотипами пневмококкового ЭПС снижала эффективность презентации в разной степени. При этом отмечалось, что поскольку место ковалентной связи белкового носителя и полисахарида расположено достаточно произвольно в аминокислотной последовательности белкового носителя и может отличаться в индивидуальных молекулах конъюгата, достаточно сложно объяснить различия в иммунном ответе к разным серотипам патогена тем, что структура полисахарида может каким-то образом влиять на эффективность процессинга и презентации CRM197 [35]. Кроме того, было показано, что первичная иммунизация конъюгированной Hib-вакциной обеспечивала вторичный (бустерный) иммунный ответ даже в том случае, если белковый партнер для конъюгации в случае первой и второй иммунизаций имел совершенно разную природу (CRM197 и столбнячный анатоксин), свидетельствуя о том, что развитие иммунного ответа к гликоконъюгату при повторной иммунизации зависит, по меньшей мере, не только от повторной экспозиции одного и того же сильного белкового антигена [21]. Каким же образом полисахаридный компонент вакцины может модулировать вторичный иммунный ответ? Первые данные, свидетельствующие о индукции Т-хелперных лимфоцитов, специфичных к полисахаридному компоненту конъюгированных вакцин, были получены в работе Muthukkumar S., Stein K. [42]. Авторы, указывая на ранее известные факты идентификации CD4+ T-лимфоцитов, специфичных к углеводным антигенам, и другие многочисленные известные примеры активации различных подклассов T-лимфоцитов под действием углеводных компонентов антигенов [6, 7, 23, 42] получили при иммунизации мышей конъюгатом полисахарида пневмококка со столбнячным анатоксином клоны Т-лимфоцитов, отвечавшие на стимуляцию полисахаридным антигеном. Оказалось, что для активации этих CD4+ T-клеток необходим прямой контакт с антигенпрезентирующими клетками, в то время как инкубация препаратов антигенпрезентирующих клеток и T-лимфоцитов, разделенных мембраной, проницаемой только для молекул белка и низкомолекулярных факторов, не активировала T-клетки. Авторам не удалось точно определить механизм контактной активации CD4+ T-лимфоцитов, специфичных к углеводному компоненту конъюгата, были лишь получены данные о том, что активация не ингибируется антителами, специфичными к MHCII на поверхности АПК. Уместно отметить, что химическая связь между углеводным и белковым компонентами конъюгированной вакцины может быть, во-первых, весьма устойчивой (зачастую это амидная связь), а во-вторых, структура этой связи такова, что клетка, которая, как правило, обладает значительным набором как гликозидаз, так и протеаз, эволюционно не приспособлена к расщеплению искусственно созданных ковалентных связей белок-полисахарид. Поэтому связывание MHCII с пептидом, несущим фрагмент неотщепленного олигосахарида, может приводить к презентации последнего на поверхности клетки и влиять на активацию клеточного иммунного ответа. Эта гипотеза была высказана в работе [31]. Используя дифференциальное мечение флюоресцентными красителями углеводного и белкового компонентов конъюгированной пневмококковой вакцины, авторы с использованием конфокальной микроскопии показали, что при узнавании профессиональными АПК (дендритными клетками) полисахаридный компонент конъюгата интернализуется и впоследствии ко-локализуется с MHCII на поверхности клеток, тогда как неконъюгированный ЭПС не способен к интернализации. Дополнительное доказательство локализации полисахаридного компонента вакцины на поверхности АПК было получено при окрашивании антителами, специфичными к полисахариду пневмококков типов 14 и 19, в то время как неконъюгированные молекулы полисахарида при окрашивании специфическими антителами на поверхности клеток не выявлялись. При инкубации клеток с блокаторами эндосомбрефелдином А и хлорохином локализации окрашенного полисахарида на мембране АПК не наблюдалось. Полученные данные свидетельствовали о том, что полисахаридный компонент конъюгированных вакцин интернализо-вался АПК, процессировался в эндосомах и ко-локализовался с пептидным компонентом на поверхности АПК [31]. Здесь уместно отметить, что существует отдельный класс полисахаридов, несущих как положительно, так и отрицательно заряженные группы и в силу этого называемых цвиттерионными полисахаридами, которые процессируются АПК и презентируются MHC без необходимости конъюгации с антигенами-партнерами [15]. В 2011 году были получены первые прямые данные о том, что презентация углеводной части конъюгированных антигенов необходима для развития модифицированного иммунного ответа, наблюдаемого при иммунизации гликоконъюгатами в сравнении с неконъюгированными полисахаридами. Авторы показали, что при первичной иммунизации неконъюгированным белковым компонентом вакцины (овальбумином или столбнячным анатоксином) и последующей иммунизацией конъюгированной вакциной иммунный ответ к ЭПС остается таким же, как и при однократной иммунизации конъюгированной вакциной. Напротив, вне зависимости от типа белкового партнера при конъюгации последовательная иммунизация конъюгатами приводила к развитию Т-зависимого иммунного ответа, характерного для ревакцинации гликоконъюгатными вакцинами. Это наблюдение противоречит классической модели активации Т-лимфоцитов конъюгированной вакциной. Было показано, что углеводный компонент конъюгатов презентируется на поверхности клеток и ко-преципитируется моноклональными антителами, специфичными к MHCII. В последующих экспериментах было обнаружено, что при иммунизации мышей конъюгатами ЭПС менингококков со столбнячным анатоксином небольшая часть полученных Т-клеточных антигенспецифических клонов реагировала не на анатоксин, а на углеводную часть антигена. С другой стороны, CD4+ T-лимфоциты, полученные из мышей, трансгенных по TCR, специфичному к эпитопу овальбумина (OVAp), эффективно активировались в присутствии АПК, презентирующихOVAp, и неэффективно - в случае взаимодействия с OVAp, конъюгированным с полисахаридом (уровень активации составил 3 % от значения, полученного для неконъюгированного пептида). Этот результат указывает на маскирование OVAp олигосахаридным компонентом, презентирующимся вместе с пептидом на поверхности АПК. Полученные данные показали наличие механизма распознавания Т-лимфоцитами полисахаридных антигенов [5]. В последующих экспериментах были идентифицированы CD4+ Т-лимфоциты, специфичные к углеводному компоненту конъюгата (Tcarb). Для обогащения популяции Tcarb животных иммунизировали последовательно одним и тем же полисахаридом, но конъюгированным к различным белковым носителям (столбнячному анатоксину и овальбумину). Точно так же определялась и специфичность полученных Т-лимфоцитов - клетки, активируемые обоими типами конъюгатов, при этом Т-клетки, специфичные к пептидным эпитопам элиминировались, а пролиферировали только лимфоциты, узнающие углеводный компонент антигена [7]. Таким образом, были получены доказательства прямой индукции клеточного иммунитета к ПС, входящим в состав конъюгированных вакцин. Необходимым компонентом активации CD4+ T-лимфоцитов углеводным компонентом, не несущим цвиттерионов, является существование пептид-углеводных молекул, пептидная часть которых связывается с MHCII, а углеводная распознается T-лимфоцитами. Авторы исследований [4, 6, 7, 23, 25, 32] отмечают, что в данной модели нет ничего принципиально нового: многие вирусные патогены, а также собственные клетки организма, в том числе опухолевые, продуцируют гликопротеины, которые распознаются как чужеродные антигены, при этом роль углеводного компонента в распознавании процессированных гликопротеинов, в частности, опухолевых и вирусных антигенов Т-лимфоцитами, является решающей. Иначе говоря, Т-клеточный ответ к химически сконструированным гликоконъюгатам может напоминать активацию иммунной системы под действием фрагментов природных гликопротеинов, презентированным APC в контексте MHCII. Общие и различающиеся элементы Т-клеточного иммунного ответа к природным и искусственным гликоконъюгатам еще предстоит определить. Следует, отметить, что, несмотря на описанную идентификацию CD4+ Т-лимфоцитов, активируемых углеводными антигенами, методология анализа их специфичности не разработана и данные о характере взаимодействиястакими антигенами комплексов TCR-MHCII отсутствуют. Несмотря на фактическое отсутствие структурной модели распознавания синтетических гликопептидных антигенов, авторам удалось сконструировать конъюгат ЭПС S. pneumoniae с пептидом, представляющим собой Т-клеточный эпитоп овальбумина, который индуцировал иммунный ответ к патогену почти на два порядка более эффективно по сравнению с классическим конъюгатомстолноразмерным белком практике [5]. Рассмотренные выше исследования открывают новые направления в разработке и оптимизации вакцин к бактериальным ЭПС. В частности, помимо очевидной в свете новой информации необходимости углубленного анализа взаимодействия Т-лимфоцитов с углеводными антигенами возникают интересные вопросы относительно дизайна гликоконъюгатов. Необходимо отметить, что хотя механизм презентации природных гликопептидных антигенов активно изучается, особенно с целью разработки противоопухолевых вакцин [32] и средств терапии аутоиммунного ревматоидного артрита [51], детальная структурно-функциональная картина взаимодействия АПК, презентирующих гликопептиды CD4+ T-лимфоцитам, в настоящее время еще не создана. Новая информация, полученная в этой области, может привести к созданию еще более эффективных гликоконъюгатных вакцин, в частности, за счет использования комбинаторных методов и рационального дизайна. Помимо внедрения указанных технологий, широко используемых в медицинской химии, интересным направлением повышения эффективности гликоконъюгатных вакцин может стать применение новых молекулярных адъювантов [27]. Некоторые бактериальные белки являются высокоэффективными адъювантами, например, фла-геллин FliC является эффективным активатором как TLR5+CD11+ антигенпрезен-тирующих клеток, так и Т-лимфоцитов [41]. Конъюгат FliC c коровым О-полисахари-дом Salmonella enteritidis имел выраженный протективный эффект в экспериментах по защите лабораторных животных от сальмонеллеза [57]. Холерный токсин, часто используемый в экспериментальных конъюгированных вакцинах в качестве белкового партнера [56], активирует СD8+ T-лимфоциты по нестандартному пути [47], что может быть использовано для усиления адъювантного эффекта и вовлечения дополнительный ветвей иммунного ответа при создании конъюгированных вакцин. Использованию альтернативной ветви иммунной системы для индукции протек-тивного ответа к полисахаридным антигенам посвящено исследование, в котором ЭПС S. pneumoniae конъюгировали не с белком, а с альфа-галактозилцерамидом (a-GC). Последний представляет собой гликолипид, распознаваемый неполиморфным антигенпрезентирующим белком CD1d, экспрессирующимся на поверхности так называемых инвариантных НК Т-клеток (INKT). Эти клетки фактически являются не истинными НК-клетками, а Т-лимфоцитами, несущими на поверхности антиген НК-клеток [13]. Взаимодействие Т-клеточных рецепторов на поверхности INKT c комплексом CDM-гликолипид вызывает быструю активацию этих клеток и секрецию цитокинов [33]. В результате конъюгат ЭПС с a-GC индуцирует иммунный ответ, аналогичный ответу на конъюгат ЭПС с белковыми антигенами, иммунологическую память и переключение изотипов [54]. Еще одним хорошо охарактеризованным адъювантом небелковой природы бактериального происхождения является монофосфорил-липид А (MPLA), который представляет собой липидный «детоксифицированный» домен бактериального липополисахарида, практически лишенный пирогенности [1]. При этом, однако адъювантные свойства MPLA сохраняются и могут быть использованы для активации иммунного ответа к углеводным антигенам. В настоящее время гликоконъюгаты MPLA используются для создания противоопухолевых терапевтических вакцин [14], однако не просматривается никаких ограничений для использования MPLA в качестве адъюванта в составе конъюгатов с бактериальными ЭПС и другими полисахаридными антигенами. То же самое справедливо и для конъюгатов между неионными и цвиттерионными полисахаридами, хотя фундаментальные основы иммунного ответа к таким конъюгатам еще предстоит изучить [19]. В заключение следует отметить, что несмотря на значительный прогресс в понимании механизма презентации углеводных антигенов в конъюгированных вакцинах детали этого механизма остаются недостаточно изученными. Необходимы структурнофункциональные исследования взаимодействия комплексов природных и синтетических гликопептидов с MHCII и TCR [6]. Не исключено, что свое слово скажет комбинаторная химия: комбинаторные подходы к исследованию презентации гли-копептидовв области аутоиммунных [25] и онкологических [32] заболеваний могут быть использованы для повышения эффективности существующих конъюгированных вакцин и создания эффективных гликоконъюгатных антигенов для других патогенов. На данный момент, эмпирический подход все еще широко используется в разработке конъюгированных вакцин, и его ограничения видны на примере неудач с разработкой вакцины с использованием ЭПС Staphylococcus aureus [9] или достаточно ограниченных достижений в создании конъюгированной брюшнотифозной вакцины [26]. Не решена проблема иммунной интерференции [4, 17, 28], имеющая отношение не только к полисахаридным конъюгированным вакцинам и заслуживающая отдельного анализа. Прогресс в создании структурно гомогенных гликоконъюгатов и молекул с заданными свойствами на основе знаний о механизме индукции иммунного ответа, опирающийся как на успехи в химическом [44], так и биологическом [10, 40, 43] гликоинжиниринге, позволит создать высокоэффективные конъюгированные вакцины нового поколения. Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках соглашения о субсидии от 27июня 2014года № 14.604.21.0067.

About the authors

A. V Kolesnikov

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology, Research Institute of Engineering Immunology

Obolensk, Moscow Region; Lyubuchany, Moscow Region, Russia

A. V Kozyr

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

I. G Schemyakin

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

I. A Dyatlov

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

References

Supplementary files