BIOLOGICAL PROPERTIES OF ENTEROCOCCI OF VARIOUS ORIGINS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Энтерококки, входящие в состав нормальной микрофлоры тела человека, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистых оболочек. В то же время, они являются представителями группы условно патогенных бактерий, способных вызывать инфекционно-воспалительные заболевания [7]. Вирулентный потенциал энтерококков, выделенных из клинического материала и кишечника, достаточно полно охарактеризован на фено- и генотипическом уровне [5, 6, 10, 17]. Вместе с тем, необходимым фактором сохранения жизнеспособности для большинства бактерий является способность усвоения ионов железа из железосодержащих молекул макроорганизма, в частности, лактоферрина и гемоглобина [16, 18]. Получен большой фактический материал по способности микроорганизмов использовать лактоферрин в качестве источника железа, за счет секреции сидерофоров либо удаления ионов железа непосредственно из данного гликопротеина при инактивации его протеазами [12, 15, 19]. Однако недостаточно изучено отношение бактерий рода Enterococcus к лактоферрину биотопов тела человека в норме и при патологии, отсутствует информация об антигемоглобиновой активности энтерококков. Цель исследования - изучение распространенности и выраженности антигемоглоби-новой и антилактоферриновой активности у энтерококков как представителей симбиотической микрофлоры кишечника и возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний у детей. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для исследования явились 95 штаммов энтерококков, выделенных из кишечника детей при обследовании на дисбиоз, 25 штаммов из мочи при инфекции мочевыводящих путей, 9 штаммов из очагов воспаления у новорожденных с кожными формами перинатальной ин- Праймеры, использованные в ПЦР, для идентификации энтерококков Вид энтерококка Праймер Последовательность 5'-3' Размер продукта реакции, п.о. E.faecalis FL1 FL2 ACTTAT GT GACTAACTTAACC TAATGGTGAATATTGGTTTGG 360 E.faecium FM1 FM2 GAAAAAACAATAGAAGAATTAT TGCTTTTTTGAATTCTTCTTTA 215 E.durans DU1 DU2 CCTACTGATATTAAGACAGCG TAATCCTAAGATAGGTGTTTG 295 E.casseliflavus CA1 CA2 TCCTGAATTAGGTTGAAAAAAC GCTAGTTTACCGT CTTTAACG 288 E.gallinarum GA1 GA2 TTACTTGCTGATTTTGATTCG TGAATTCTTCTTTGAAATCAG 173 фекционно-воспалитель-ной патологии (ИВП) при наличии воспалительных заболеваний урогенитального тракта у рожениц. Энтерококки выделяли путем посева исследуемого материала на среду Enterococcosel agar (BD, США). Штаммы идентифицировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием известных праймеров (табл.) по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы [14]. Синтез праймеров осуществлен компанией «Синтол» (Москва). Для обнаружения генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы, проводили мультиплексную ПЦР с 1 мкл лизата в термоциклере «Терцик» (ДНК Технология, Россия) по следующему протоколу: 1 цикл - 92°C, 4 мин; 30 циклов: 92°C, 30 сек; 55°C, 1 мин; 72°C, 1 мин; последний цикл включал элонгацию в течение 7 мин при 72°C. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, ТАЕ буферной системе. В качестве маркеров использовали GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс. Антигемоглобиновую активность (AHbA) определяли по [2], антилактоферриновую (АЛфА) по [3]. Статистическую обработку проводили с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стъюдента. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Полученные результаты показали, что доминирующим видом, выделяемым из всех биотопов, явился вид Enterococcus faecalis, который регистрировали в кишечнике в 46,2% случаев, в 68% высевали из проб мочи и в 100% из смывов с кожи новорожденных. На втором месте по частоте встречаемости оказался вид Enterococcus faecium, который в 37% случаев высевали из кишечника и в 32% - из проб мочи. Редкие виды энтерококков (E. durans, E. casseliflavus, E. gallinarum, E.hirae) были изолированы только из кишечника в 16,8% случаев. Антилактоферриновая и антигемоглобиновая активность были выявлены как у фекальных, так и клинических изолятов энтерококков. Анализ пенетрантности АЛфА показал, что данный признак выявлялся в 36,3% случаев у штаммов E. faecalis, выделенных из кишечника, в 41,1% - из проб мочи, в 77,8% - с кожи новорожденных. При этом значения антилактоферриновой активности E. faecalis составляли 27,2±13,2 нг/мл, 38,7±8,7 нг/ мл, 162,7±55,2 нг/мл, соответственно. При исследовании способности E. faecium к инактивации лактоферрина установлено наличие признака у 57% штаммов, выделенных из кишечника, и у 62,5% штаммов, выделенных из проб мочи, экспрессия признака составляла в среднем 41,8 ±1,0 нг/мл и 70,3±6,7 нг/мл, соответственно (p<0,05). Среди редко встречающихся видов энтерококков способность к инактивации лакто-феррина была обнаружена у 50% изолятов, выделенных из кишечника, из них 37,5% были идентифицированы как E. durans, 12,5% - E. hirae, среднее значение признака было равно 93,3±11,8 нг/мл и 167,4±10,4 нг/мл. При изучении AHbA среди выделенных штаммов было установлено наличие признака у 65,9% изолятов E. faecalis из кишечника, у 88,2% изолятов из мочи, у 100% - с кожи новорожденных. Выраженность признака составляла 6±0,7 г/л, 9±0,8 г/л, 14,5±2,8 г/л, соответственно. Все штаммы E. faecium, выделенные из мочи, и 62,9% культур, выделенных из кишечника, характеризовались AHbA со средним значением признака, равным 8,9±0,8 г/л и 4,7±0,6 г/л, соответственно (p<0,001). Установлено, что антигемоглобиновой активностью обладали также 75% штаммов, относящихся к редким видам энтерококков (E. durans, E. casseliflavus и E. hirae), при этом среднее значение выраженности AHbA составляло 10,8±3,0 г/л. Анализ частоты встречаемости комбинации обоих исследуемых признаков у энтерококков, выделенных из кишечника, показал, что изоляты E. faecalis, обладающие комбинацией АЛфА и AHbA, регистрировались в 25% случаев, изоляты E. faecium - в 42,9% случаев. В то же время, клинические изоляты E. faecalis характеризовались способностью к инактивации лактоферрина и антигемоглобиновой активностью в 50% случаев, а E. faecium, выделенные из проб мочи у больных с инфекцией мочевыводящих путей - в 100% случаев. Все выделенные из кишечника штаммы E. hirae также обладали комбинацией данных свойств, а E. durans - в 75% случаев. Однако корреляционный анализ не выявил наличия связи между антилактоферриновой и антигемоглобиновой активностью энтерококков различного происхождения. Таким образом, проведенные исследования выявили различия в частоте распространенности, уровне выраженности антилактоферриновой и антигемоглобиновой активности у изолятов энтерококков, выделенных у здоровых детей из кишечника и больных инфекционно-воспалительными заболеваниями. Наиболее часто данные свойства были характерны для штаммов E. faecalis, выделенных у новорожденных с кожными формами перинатальной ИВП, у них же определены самые высокие значения АЛфА и AHbA, а также комбинация обоих признаков. Сравнение изученных свойств у E. faecium, выделенных из кишечника у здоровых, и мочи при инфекции мочевыводящих путей, показало, что штаммы, обладающие антилактоферриновой и антигемоглобиновой активностью с высокими значениями признаков, и их комбинацией чаще выделялись из мочи больных. Комбинация АЛфА, AHbA была характерна и для энтерококков редких видов, выделенных из кишечника. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты свидетельствуют, что среди энтерококков, выделенных из фекалий и клинического материала, преобладает E. faecalis, что согласуется с другими исследованиями [13]. У бактерий рода Enterococcus различного происхождения выявлены антигемоглобиновая активность и способность к инактивации лактоферрина. Частота встречаемости и уровень выраженности изученных биологических свойств у E. faecalis кишечного и внекишечного происхождения нарастали в ряду: кишечник здоровых детей - больные с инфекциями мочевыводящих путей - новорожденные с кожными формами перинатальной ИВП. Установлено, что изоляты E. faecalis, выделенные от новорожденных с кожными формами перинатальной ИВП, характеризуются наиболее выраженными значениями АЛфА и AHbA. Вместе с результатами, полученными нами ранее, о широкой распространенности у данных штаммов факторов вирулентности как на фенотипическом, так и на генотипическом уровне [4] они свидетельствуют о выраженном патогенном потенциале, который обеспечивает их выживание при контакте с эффекторами иммунитета на этапе транслокации от матери к плоду и, очевидно, способствует развитию инфекционновоспалительного процесса у ребенка иногда еще в утробе матери [8]. Получены результаты о высокой частоте встречаемости АЛфА и AHbA у E. faecium, выделенных от больных с инфекциями мочевыводящих путей, при этом выраженность данных свойств была выше у клинических изолятов, чем у фекальных культур энтерококков. Эти данные согласуются с аналогичными результатами, полученными ранее [1], в которых было показано, что клинические изоляты энтерококков характеризуются более высокой частотой встречаемости факторов персистенции с высокими значениями признаков по сравнению с культурами, выделенными из кишечника. Важным моментом является факт обнаружения АЛфА и AHbA не только у E. faecalis и E. faecium, но и у изолятов редких видов энтерококков, выделенных из кишечника. Наличие этих свойств у E. hirae и E. durans в условиях здорового организма объяснимо, так как сорбируя из среды роста железо, эти бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам среды и иммунной системы хозяина, получают определенные преимущества в конкурентной борьбе [9, 11]. Данные о более выраженной экспрессии изученных биологических свойств у энтерококков, выделенных от больных, в сравнении со штаммами, выделенными от здорового контингента, могут быть использованы для дифференциации патогенных штаммов. С другой стороны, АЛфА и AHbA могут быть использованы как эффективные мишени для отбора препаратов-ингибиторов, пригодных для терапии энтерококковых инфекций.

About the authors

M. V Sycheva

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis; Orenburg State Agricultural University

O. L Kartashova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

References

Supplementary files