EFFECT OF ESCHERICHIA COLI SECRETED METABOLITES ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF HUMAN NEUTROPHILS AGAINST THE BACKGROUND OF ESTRIOL EFFECT

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Микробиота человека находится в динамическом взаимодействии с клетками организма хозяина. Изменения в иммунной системе, происходящие в течение беременности, с одной стороны, препятствуют отторжению плода, с другой - приводят к усугублению бактериально-опосредованных заболеваний слизистых матери [10]. Развитие инфекционного процесса в этот период чаще всего обусловлено супрессией функциональной активности фагоцитов бактериальными клетками [12] и (или) продуктами их жизнедеятельности, которые зависят от изменения видового и количественного соотношения микробиоты человека в ходе беременности [19]. Новый гормональный статус в период беременности также определяет состав резидентной вагинальной микробиоты и чувствительность женщины к инфекциям [2, 16]. Эстриол (Е3) синтезируется только во время беременности, т. к. является продуктом фетоплацентарной единицы, а его концентрация служит важным индикатором состояния плода [18]. Данный гормон способен оказывать иммуномодулирующее действие на функции нейтрофилов [7], т.к. эти клетки экспрессируют на своей поверхности рецепторы для эстрогенов [23]. Escherichia coli является комменсалом желудочно-кишечного тракта человека [14]. Кроме этого, при ряде патологий, таких как инфекции урогенитального тракта (пиелонефрит, бактериурия), в 70% случаев первопричиной является присутствие представителей вида E. coli [9]. Наличие данных бактерий в составе вагинальной микробиоты сопровождается повышенным риском прерывания беременности на ранних сроках [13]. Известно, что E. coli и их экзометаболиты [15, 21] модулируют функциональную активность нейтрофилов. Кроме того, E. coli, в зависимости от фазы роста культуры, способны избегать лизирующего действия компонентов комплемента [25]. В то же время, функциональная активность нейтрофилов, связанная с фагоцитозом, непосредственно зависит от гормонального фона, изменяющегося в процессе развития беременности [5]. Цель работы - изучить влияние экзометаболитов E. coli разных фаз развития культуры на фагоцитарную активность нейтрофилов, подвергнутых предварительному воздействию физиологических концентраций E3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штамм E. coli K12 (wt) использовали для получения внеклеточных метаболитов. Метаболиты отбирали в конце фаз адаптации (С1) и логарифмического роста (С2) культуры E. coli К12 (wt) путем фильтрации (диаметр пор 0,2 мкм, «Хийу Калур», Эстония) после культивирования при 37°С и 150 об/мин на LB бульоне (триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; NaCl - 10 г на 1 л среды). Твердая LB среда содержала 1,5% агар. Чувствительность клеток E. coli K12 к 30% H2O2 в присутствии экзометаболитов C1 и С2 определяли диско-диффузионным методом на LB-агаре (10 мкл H2O2 на диск с диаметром 12 мм). 100 мкл культуры E. coli K12 на разных фазах развития засевали на чашки Петри с LB-агаром. Часть клеток E. coli отмывали от экзометаболитов 0,89% NaCl. Через 24 ч определяли зону ингибирования роста бактерий. Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной венозной крови здоровых небеременных женщин (фолликулярная фаза, n=8) центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 и 1,112 г/мл). Нейтрофилы (106 кл/мл) инкубировали 1 ч при 37°С с Е3 в концентрации 2 нг/мл и 20 нг/мл, соответствующих I и III триместрам беременности [17]. Затем нейтрофилы отмывали от гормона, ресу-спендировали в растворе Хенкса, исходной питательной среде для бактерий (LB), супернатантах фаз адаптации и логарифмического роста культуры E. coli и выдерживали 30 мин при 37°C. Фагоцитарная система состояла из суспензии нейтрофилов (106 кл/мл), регидра-тированного сенсора E. coli lux+ (107 кл/мл) c lux-опероном Photorhabdus luminescens [1], опсонизированного пулом сывороток (10%). Уровень фагоцитоза оценивали по снижению биолюминесценции E. coli lux+, поглощаемых нейтрофилами. Оценку биолюминесценции проводили на многофункциональном планшетном ридере (Synergy H1, США) через каждые 10 мин в течение часа. Данные представлены в виде индекса фагоцитарной активности (ИФА), который вычисляли по формуле: ИФА=(Xl-X2)/Xl х100%, где Xi, - интенсивность исходного свечения сенсора фагоцитарной системы, Х2 - свечение в определенный момент времени [6]. Результаты обработаны по парному t-критерию Стьюдента с использованием программы Excel. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Первоначально оценивали способность экзометаболитов E. coli повышать выживаемость бактерий при воздействии H2O2. Установлено, что подобной активностью обладают только метаболиты E. coli логарифмической фазы роста (C2). Удаление супернатантов, содержащих С2, приводит к снижению выживаемости бактерий при действии H2O2. Таким образом, экзометаболиты логарифмической фазы роста оказывают протективный эффект по отношению к E. coli, что косвенно говорит об их способности влиять на фагоцитарную активность лейкоцитов, сопровождаемую кислородным взрывом. На следующем этапе эксперимента оценивали способность метаболитов разных фаз роста культуры E. coli влиять на фагоцитоз фракционированных нейтрофилов. Установлено, что экзометаболиты С1 не влияют на фагоцитарную активность ней-трофилов, а С2 достоверно ингибируют фагоцитоз на 40 - 60 мин наблюдения по сравнению с исходной питательной средой LB (рис. 1). Необходимо отметить, что среда LB усиливает фагоцитоз нейтрофилов из-за наличия в ней растворимого Р-глюкана, который активирует клетки врожденного иммунитета [20]. По-видимому, выявленное подавление фагоцитоза супернатантами более поздних фаз развития E. coli по сравнению с LB может быть связано с содержанием в их составе белков и (или) аутоиндукторов. Известно, что белок теплового шока (Hsp) 70 эукариот, гомологичный белку DnaK E. coli, блокирует кислородный взрыв нейтро-филов, индуцированный липополисаха-ридом или липотейхоевой кислотой, запускающих внутриклеточный сигналинг, приводящий к фосфорилированию мито-ген-активируемых протеинкиназ [26]. Поскольку синтез DnaK увеличивается в ответ на истощение питательных веществ [11], что характерно для фазы С2 (переход бактериальной культуры из экспоненциальной в стационарную фазу роста), можно полагать, что снижение фагоцитарной активности обусловлено бактериальными гомологами Hsp 70, а также цитотоксическим действием производных алкилоксибензолов [4], присутствующих в экзометаболитах фазы С2 [3]. Рис. 1. Влияние бесклеточных метаболитов разных фаз развития культуры E. coli К12 на фагоцитарную активность нейтрофилов. 1 - раствор Хенкса, 2 - среда LB, 3 - метаболиты фазы адаптации (С1), 4 - метаболиты экспоненциальной фазы (С2). * p<0,05 между С2 и средой LB , л p<0,05 между средой LB и раствором Хенкса. В период физиологически протекаю- Рис. 2. Влияние E3 на фагоцитарную активность при действии метаболитов E. coli. а - Среда LB, б - метаболиты фазы адаптации (С1), в - метаболиты логарифмической фазы (С2). * p<0,05 по сравнению с контролем; 2 и 20 нг/мл - концентрация E3. щей беременности происходит гормональная модуляция функциональной активности нейтрофилов. Предварительная обработка нейтрофилов Е3 в концентрации, соответствующей III триместру беременности, достоверно снижает фагоцитоз нейтрофилов на 50 - 60 мин, что подтверждает полученные нами ранее данные [7]. Последовательное воздействие E3 и супернатантов E. coli, моделирующее особенности фагоцитоза бактерий у беременных, показало, что на фоне высокой концентрации E3 (20 нг/мл) проявилось ингибирующее влияние ранних экзометаболитов С1, сходное по эффекту с воздействием С2. Следует отметить, что в исходной питательной среде для бактерий гормональная модуляции нейтрофилов нивелировалась (рис. 2). ОБСУЖДЕНИЕ Выявленный эффект E3 можно объяснить синергичным действием низкомолекулярных бактериальных аутоиндукторов, присутствующих в экзометаболитах С1 [8]. Речь идет, прежде всего, об аутоиндукторе 3 (AI-3) бактерий, который по химической природе сходен с катехоламинами млекопитающих [22]. Ранее было показано, что в составе метаболитов фазы адаптации E. coli K-12 на среде LB концентрация норадре-налина, дофамина и доксифенилаланина (предшественника катехоламинов) значительно превышает физиологические концентрации в периферической крови (250 и 800 нМ, соответственно), в отличие от метаболитов экспоненциальной фазы роста (С2) [8]. Известно, что катехоламины могут снижать активность фагоцитов только в высоких концентрациях [24], поэтому их действие может проявляться исключительно в ранних супернатантах (С1). Однако для нейтрофилов их эффект не достаточен. По-видимому, Е3 снижает порог чувствительности нейтрофилов к депрессивному действию AI-3, реализуя одновременно собственное угнетающее действие. Таким образом, нейтрофилы, находящиеся под воздействием Е3 в III триместре беременности, более уязвимы для экзометаболитов С1, что, по-видимому, может определять повышенную восприимчивость женщин к бактериальной инвазии в ранние сроки беременности.

About the authors

S. V Shirshev

Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm, Russia

I. L Maslennikova

Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm, Russia

I. V Nekrasova

Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm, Russia

References

Supplementary files