CONTENT OF SOME PRO- AND ANTI-INFLAMMATORY CYTOKINES IN BLOOD SERA OF LEPTOSPIROSIS PATIENTS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Лептоспирозы - зооантропонозная инфекция, протекающая в виде острого лихорадочного заболевания, характеризующаяся признаками капилляротоксикоза, выраженной интоксикацией, поражением почек, печени, центральной нервной системы, развитием геморрагического синдрома. Лептоспироз относится к категории наиболее распространенных и тяжело протекающих зоонозов [5, 8]. Возбудителями являются бактерии рода лептоспир (Leptospira), входящие в семейство спирохет (Spirochaetaceae). В настоящее время идентифицировано более 250 серовариантов патогенных лептоспир [2, 14]. В Российской Федерации лептоспирозы продолжают оставаться в ряду широко распространенных зоонозных инфекций человека, что обусловлено наличием практически на всех территориях природных и хозяйственных очагов как в сельской местности, так и в городах [1]. Полиморфизм клинических проявлений лептоспирозов и отсутствие патогномо-ничных симптомов болезни приводят к поздней диагностике, нерациональному лечению, что является одной из причин высокой летальности при этой инфекции, достигающей на некоторых территориях Российской Федерации 20% [2, 4]. Патогенез лептоспирозов сложен и на данный момент мало изучен. Лептоспиры обладают множеством механизмов, которые позволяют им уклоняться от иммунной системы хозяина и вызывать инфекцию [3]. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются основными «датчиками» вторжения патогенных микроорганизмов [7]. Установлено, что липополисахарид лептоспир взаимодействует с TLR2, а не с TLR4 в отличие от большинства грамотрицательных бактерий. Неспособность комплекса TLR2/TLR4 на поверхности клеток моноцитарно-макрофагального ряда человека распознавать липополисахарид лептоспир рассматривается как одна из возможных предпосылок высокой восприимчивости человека к лептоспирозной инфекции и более тяжелого ее течения [3, 9, 17]. Цитокины оказывают плейотропные биологические эффекты на различные типы клеток, главным образом, участвуя в формировании и регуляции защитных реакций организма. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с паттерн-распознающими рецепторами (мембранными Toll-рецепторами) с последующим синтезом провос-палительных цитокинов. Синтезируясь в очаге воспаления, цитокины воздействуют практически на все клетки, участвующие в развитии воспаления, включая грануло-циты, макрофаги, фибробласты, клетки эндотелия и эпителия, а затем на Т- и В-лимфоциты. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом, действуя в обоих направлениях. Изменения в иммунной системе являются важным звеном в патогенезе лептоспи-розов, особую роль при этом отводят цитокинам. Предполагается, что тяжесть и исход лептоспирозной инфекции зависят от вида продуцируемых цитокинов и их концентрации. Широко обсуждается наличие связи между высоким уровнем TNF-а и риском развития серьезных кровотечений и летальных исходов, о значении соотношения IL-10/TNF-a как раннего биомаркера тяжести течения болезни. Однако работ по изучению роли цитокинов в иммунопатогенезе лептоспирозов немного, и часто их результаты противоречивы [14 -16]. Цель работы - изучение содержания некоторых про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных лептоспирозом в динамике инфекционного процесса и роли этих цитокинов в иммунопатогенезе заболевания. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Нами были обследованы 50 пациентов, больных лептоспирозом, с подтвержденным диагнозом. У всех больных обнаружены специфические антитела к лептоспирам с помощью реакции микроагглютинации [6]. От данных пациентов было получено 86 сывороток, из них 24 сыворотки для оценки динамики продукции цитокинов по трем точкам (1 - 7 день болезни, 8 - 14 и 15-21 день болезни). У 34 больных (68,6%) возбудителем являлась Leptospira icterohaemorrhagiae, у 13 (25,6%) - L.canicola, у 3 пациентов (5,8%) - L.grippotyphosa. У большинства пациентов лептоспироз протекал в тяжелой форме. В опытную группу вошли лица от 21 до 83 лет (18% женщин, 82% мужчин), средний возраст составил 44,0+14,1 года. Сыворотки хранили при температуре -80°С и размораживали однократно для проведения исследования. Контрольную группу составили 14 практически здоровых людей (группа сопоставима с исследуемой группой по полу и возрасту). Во всех сыворотках крови определяли уровень цитокинов. Для анализа на мультиплексном анализаторе «MagPix» («Millipore», США), основанном на технологии хМАР компании Luminex (США) с использованием магнитных частиц «Milliplex Mag», была выбрана панель из 9 аналитов. В исследуемую панель вошли следующие цитокины: TNF-a, МСР-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, ^-1Яа, IL-12(р70), IFN-y. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ MS Excel, Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.). Для описания полученных результатов использовали стандартные методы непараметрической статистики, так как распределение наших данных не соответствовало законам распределения Гаусса (тест Shapiro-Wilk, р<0,002 для всех исследуемых аналитов). При статистической обработке результатов значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимали за значение нижней границы. Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю Уровень цитокинов в сыворотке крови больных лептоспиро-границу чувствительности, то его зом и в контрольной груте (Me [25; 75 перцентиль]) концентрацию принимали равной верхней границе. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Цитокины, пг/млКонтрольная группа (n=14)Больные (n=86)(р) TNF-a4,63 [3, 2; 7, 2]11,91 [7, 97; 19, 63]р<0,0001 MCP-163,7 [13, 45; 219, 9]536,1 [313, 2; 709, 4]р=0,003 IL-83,2 [3, 2; 3, 2]79,47 [29, 85; 280, 4]р=0,01 IL-63,2 [3, 2; 3, 2]2,838 [0, 82; 9, 94]p>0,05 IL-43,2 [3, 2; 3, 2]3,2 [3, 2; 7, 13]p>0,05 IL-1Rb16,44 [3, 2; 20, 62]15,49 [9, 00; 31, 19]p>0,05 IL-12 (p70)3,2 [2, 85; 3, 28]2,84 [1, 85; 5, 74]p>0,05 IL-103,2 [3, 2; 3, 2]5,34 [3, 2; 12, 71]р=0,049 IFN-y3,2 [3, 2; 11, 8]5,4 [2, 57; 12, 58]p>0,05 Содержание цитокинов в сыворотке крови больных лептоспиро-зом представлены в табл. В группе больных лептоспиро-зом по сравнению с контрольной группой выявлен достоверно повышенный уровень IL-8, IL-10, MСP- 1, TNF-a (p<0,05). В результате исследования нами не установлены гендерные различия в уровне цитокинов, а также не найдено корреляции между возрастом пациента и продукции цитокинов при лептоспирозе. В ходе исследования установлено, что высокие значения МСР-1 встречались в основном у лиц с иктерогеморрагическим лептоспирозом при тяжелом течении заболевания. На первой неделе болезни содержание провоспалительных цитокинов TNF-a и MCP-1 по сравнению с контрольной группой было выше, более чем в 2 и в 5 раз соответственно. На второй неделе содержание этих цитокинов резко снижается, приближаясь к показателям у здоровых лиц. На третьей неделе болезни уровень TNF-a и MCP-1 вновь возрастает, более чем в 2,5 раза и превышает показатели, зарегистрированные на первой неделе. У этих же больных содержание противовоспалительных цитокинов IL-10 и IL-1Ra на первой неделе болезни также было значительно выше, чем в контрольной группе (в 3 и 1,5 раза соответственно). На второй неделе содержание данных цитокинов также как и провоспалительных снижается до уровня контрольной группы. Однако на 3 неделе в отличие от TNF-a и MCP-1 уровень IL-10 и IL-1Ra практически остается на том же уровне. Эти тенденции не были подтверждены статистически в связи с небольшим количеством данных. Проведен корреляционный анализ полученных результатов содержания цитоки-нов в сыворотке крови, выявлены корреляционные связи между TNF-a и MСP-1(r=0,51; p=0,02), TNF-a и IL-^а (r=0,49; p=0,03), такие же по направленности, но более сильные связи были обнаружены и в группе контроля (r=0,69 для обоих случаев; p=0,04 и р=0,01, соответственно). Также в основной группе была выявлена корреляционная связь между IL-12^70) и IFN-y (r=0,55; р=0,01), не характерная для группы контроля. ОБСУЖДЕНИЕ В ходе нашего исследования выявлен достоверно повышенный уровень IL-8, IL-10, TNF-a (p<0,05) в группе больных лептоспирозом по сравнению с контрольной группой, что подтверждают данные литературы [4, 13], причем сведения о высоком содержании MСP-1 выявлены впервые. Повышенное содержание про-воспалительных цитокинов является необходимым для контроля инфекции, однако их избыток вызывает повреждение тканей, что является, в частности, одной из причин развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания при леп-тоспирозе. Повышение уровня хемокина MCP-1 связано с распознаванием цитотоксических белков лептоспир рецептором TLR2 на поверхности эпителиальных клеток. В нашем исследовании максимальные значения данного хемокина наблюдали у пациентов с лептоспирозом, вызванным L.icterohaemorrhagiae при тяжелом течении болезни, что может свидетельствовать о большом количестве цитотоксических белков у данного сероварианта возбудителя. Наблюдая за динамикой цитокинов при лептоспирозе, мы пришли к выводу, что уровень большинства провоспалительных цитокинов увеличивается к 3 неделе болезни при снижении концентрации IL-10 и IL-^а (противовоспалительных цитокинов), что совпадает с развитием поздних осложнений болезни и свидетельствует о незавершенности процесса воспаления.

About the authors

O. A Petrova

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

N. A Stoyanova

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

N. K Tokarevich

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

N. A Arsentieva

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

N. E Lyubimova

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

A. V Semenov

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

A. A Totolyan

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files