FREQUENCY OF OCCURRENCE OF ivyC AND pliC LYSOZYME INHIBITORS GENES IN CLINICAL KLEBSIELLA STRAINS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Секреты организма человека, включая слюну и слезы, содержат лизоцим в концентрациях до 50 мкг/мл-1. Лизоцим является также одним из бактерицидных компонентов, освобождающихся при дегрануляции нейтрофилов. К лизоциму чувствительны как грам-положительные, так и грам отрицательные бактерии, мишенью для которого служит пептидогликан [3, 6, 11]. Устойчивость бактерий к лизоциму связана со способностью бактерий синтезировать ингибиторы лизоцима, модифицирующих пептидогликан [2, 8, 12]. В настоящее время у грамотрицательных бактерий описано наличие нескольких типов ингибиторов лизоцима: С (conventional), G (goose) и I (invertebrate), обозначенных как IvyC (inhibitor of vertebrate lysozyme of c-type), Mli C (membrane bound lysozyme inhibiotor of c-type), РИС (periplasmic lysozyme inhibitor of c-type), PliG (periplasmic lysozyme inhibitor g-type) и Plil (periplasmic invertebrate of i-type) [10, 12 - 14, 20]. Описана кристаллическая структура ингибитора лизоцима С-типа белковой природы, выделенного у бактерий Escherichia coli, представленного димером в виде петли с 5 аминокислотными остатками, важными для проявления бактерицидного эффекта. Консервативные участки димера были гомологичными для бактерий E.coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexnreri и Burkholderia cepacia. Мутанты E.coli, дефектные по гууС гену, становились чувствительными к действию лизоцима за счет формирования пор в бактериальной клеточной стенке [10]. На изогенных мутантах, полученных на основе штамма APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli) с помощью сайт направленного транспозонового мутагенеза, исследована вирулентность исходных бактерий и полученных нокаутных по mliC, гууС и pliG генам мутантов при подкожном введении однодневным цыплятам и оценке чувствительности бактерий к бактерицидному действию сыворотки крови. Мутант mliC характеризовался выраженным снижением резистентности к бактерицидному действию сыворотки и вирулентности in vivo. Мутанты ivyC и pliG сохраняли вирулентность и уровень сывороточной устойчивости. Двойные ivyC-pliG мутанты по вирулентности и резистентности к сыворотке были близки дикому штамму [18]. Данные, полученные Abergel Ch. et al. [10] и Vanderkelen L. et al. [18], позволили авторам отнести ингибиторы лизоцима к факторам патогенности грамотрицательных бактерий. Ранее нами у клинических штаммов K.pneumoniae была обнаружена конъюгативная плазмида размером 60 мДа, в состав которой одновременно входили гены, контролирующие антилизоцимную (Alz) активность и полиантибиотикоустойчивость [1]. Конъюгативная плазмида pAlz-60 экспрессировалась в широком круге «хозяев» семейства Enterobacteriaсeae [4]. Антилизоцимный фактор был выделен в гомогенном виде и охарактеризован как конкурентный ингибитор лизоцима [2]. Штамм K.pneumoniae АВ-86, обладающий высокой антилизоцимной активностью (до 10 - 20 мкг/мл), был депонирован под № 151 в музее культур ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва). Штамм K.pneumoniae 151, несущий плазмиду Alz-60, и турбидиметрический способ определения антилизоцимной активности были защищены патентом РФ [4]. Позже нами было установлено, что бактерии штамма ^pneumoniae 151, характеризующегося высоким уровнем антилизоцимной активности, обладают одновременно ivyC и pliC генами [5]. Цель работы - выявление частоты встречаемости генов ivyC и pliG у штаммов клеб-сиелл различного происхождения. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа была проведена в 2012 - 2013 гг. на базе лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва) и Республиканской инфекционной клинической больницы (Казань). Исследованы 129 штаммов, из них K.pneumoniae (n=115) и K.oxytoca (n=14). Штаммы были разделены на 2 группы: 1 группа - 62 штамма клебсиелл, из которых 39 изолированы в Казани и 23 штамма выделены от детей с клебсиеллез-ной инфекцией в Москве. Казанские штаммы (n=39) были представлены изолятами от детей раннего возраста, получавших стационарное лечение по поводу клебсиеллезной (n=8), респираторной (n=17), ротавирусной (n=5) и гнойно-воспалительной инфекции периода новорожденности (n=9). Вторая группа штаммов (n=67) была представлена изо-лятами от детей, проходивших амбулаторное лечение по поводу дисбактериоза кишечника в Казани (n=37) и Москве (n=30). Выявление хромосомного ivyC и плазмидного pliQ генов проводили с помощью ПЦР, используя пары праймеров для ivyC гена - CGCGCAGACGGTGAAACT и TGA GGGCGGCAAACAGC (размер ампликона 227 н.п.) и pliC гена - CCTCTAT CGTTCTGCTTGCTTTGA и TGCTCAGGATGTCTTCGTTCTTTT (размер ампликона 288 н.п.) соответственно, описанные а работе Н.Б.Перуновой и др. [8]. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» в следующем режиме: 94°С - 10 мин; (94°С - 30 сек, 56°С - 30 сек, 72°С - 30 сек) 30 циклов; 72°С - 7 мин. Амплификацию проводили при использовании 25 мкл реакционной смеси, содержащей: смесь dNTP, специфические праймеры (14 pmol/мкл, Taq-полимеразу (5ед/мкл), буфер для Taq-полимеразы, деионизированную воду, исследуемый образец ДНК. На смесь наслаивали 30 мкл минерального масла для предотвращения испарения. В качестве образца для ПЦР использовали бактериальные взвеси в 1 мл дистиллированной воды, приготовленные из колоний бактериальных культур, выросших на плотных питательных средах. Для выделения ДНК использовали термический лизис. Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 1,8% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиум бромида (0,5 мкг/мл) и визуализацией в УФ-лучах на трансиллюминаторе «Флуоскоп-2». В качестве маркера использовали маркер длин фрагментов pUC19 ДНК/Mspl (ЗАО «Силекс»). В качестве контроля использован штамм K.pneumoniae № 151, обладающий одновременно хромосомным ivyC и плазмидным pliC генами [5]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием точного критерия Фишера (F-критерий). РЕЗУЛЬТАТЫ В ПЦР га специфическими праймерами протестировано на наличие хромосомного ivyC и плазмидного pliQ генов 129 клинических штаммов рода Klebsiella, принадлежащих к двум видам: Kpneumoniae (n=115) и K.oxytoca (n=14). Детерминанты хромосомного ivyC гена ингибитора лизоцима выявлены в 40,3% случаев (52 штамма из 129), плазмидного pliC гена в 6,9% (9 из 129) случаев соответственно. При оценке частоты генов по группам штаммов было показано, что удельный вес хромосомного ivyC гена у штаммов клебсиелл, выделенных от 39 больных детей Казани, составил 46,6% случаев (18 из 39). Московские штаммы, изолированные от детей с острой клебсиеллезной инфекцией, обладали хромосомным геном ivyC в 95,5% случаев (22 из 23), при этом 9 штаммов из 22 одновременно несли ivyC и pliC гены. Среди 67 суммарных казанских и московских штаммов клебсиелл, изолированных от детей с явлениями дисбактериоза кишечника, обнаружен только хромосомный ivyC ген в 61,2% случаев (41 из 67 штаммов). У одного штамма Kpneumoniae и одного K.oxytoca из 41одновременно выявлены ivyC и pliC гены. Частота встречаемости ivyC и pliC генов ингибиторов ли-зоцима у штаммов клебсиелл различного происхождения представлена в табл. Частота встречемости ivyC и pliC генов ингибиторов лизоцима у 129 штаммов клебсиелл различного происхождения ШтаммыЧастота встречаемости генетических детерминант ivyC, % (n)pliC, % (n) Всего исследованных40,3 (52)6,9 (9) (n=129) Клинические штаммы: Казань (n=39)46,6 (18)4,2 (2) Москва (n=23)95,5 (22)26,0 (6) Всего: 6264,5 (40)12,7 (8) Дисбиозные штаммы: Казань (n=37) Москва (n=30) Всего: 6761,2 (41)1,4 (1) При анализе подборки казанских штаммов были выявлены отличия в частоте встречаемости гена ivyC у штаммов K.pneumoniae в зависимости от популяционного уровня бактерий в кишечнике. В то же время, не выявлено достоверных различий в частоте выделения ivyC+ штаммов клебсиелл у детей с различной степенью выраженности диареи и бессимптомных носителей. Штаммы K.pneumoniae, выделенные от детей с массивным (до 7,0 - 8,0 lg КОЕ/мл) обсеменением кишечника, чаще обладали ivyC и pliC генами. Высокая численность бактериальных клеток клебсиелл могла быть связана с формированием бактериальной биопленки [9]. Повторное бактериологическое исследований образцов фекалий 46 детей (из 67 ранее обследованных на дисбактериоз кишечника), проведенное через 2 месяца после первичного бактериологического анализа, позволило констатировать персистенцию K. pneumoniae в кишечнике в 54,3% случаев ( у 25 из 46 детей). В этой группе бактериовыде-лителей, как правило, обнаруживали ivyC+ штаммы клебсиелл. Относительный риск развития персистенции при наличии ivyC гена у штаммов K.pneumoniae составил OR=3,48 (0,99 до 12,22). ОБСУЖДЕНИ Е В настоящее время отмечается значительный рост заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами, в том числе и различными видами клебсиелл. Высокая восприимчивость к клебсиеллезу отмечается у детей раннего возраста, имеющих незрелую кишечную экосистему и иммунитет. Наиболее патогенными представителями рода Klebsiella являются K.pneumoniae и K.oxytoca, вызывающие инфекции респираторного, желудочно-кишечного тракта, инфекции мочевых путей, сепсис и инфекции другой локализации [3, 16]. Выявлена способность клебсиелл формировать бактериальные биопленки, способствующие длительной персистенции возбудителя и хронизации гнойно-воспалитльных процессов [3, 9]. Клебсиеллы входят в число основных возбудителей нозокомиальных инфекций у педиатрических больных и, в первую очередь, у новорожденных детей. Доказана роль K.oxytoca в развитии антибиотико-ассоциированного геморрагического колита [15]. Естественным резервуаром обитания K.pneumoniae и K.oxytoca в человеческом организме является желудочно-кишечный тракт, который при определенных ситуациях становится источником эндогенного или экзогенного инфицирования клебсиеллами хозяина, а также контактных с ним лиц. K.pneumoniae и K.oxytoca достаточно часто выявляются в составе кишечной микрофлоры здоровых детей. По результатам ранее проведенных нами исследований, колонизация кишечника K.pneumoniae у здоровых детей первого полугодия жизни выявлена в 24,2 - 33,3%, K.oxytoca - в 3 - 4% случаев с последующим снижением частоты выделения K.pneumoniae до 6,6 - 12,3% в возрастной группе 1 - 3 лет [7]. Персистенции клебсиелл в различных экологических нишах обусловлена их способностью синтезировать мощную полисахаридную капсулу и ряд ингибиторов факторов естественной резистентности человека и, в первую очередь, лизоцима [3, 16]. Лизоцим является ключевым эффекторным звеном врожденной системы иммунитета человека и представляет собой гидролитический фермент, способный разрушать пептидогликановый слой клеточной стенки бактерий и вызывать лизис микробной клетки [19]. Ингибиторы лизоцима эффективно защищают бактерии от разрушающего воздействия лизоцима и, таким образом, способствуют колонизации и развитию инфекции. В данной работе приведена частота встречаемости хромосомного ivyC и плазмидного pliO генов ингибиторов лизоцима у штаммов клебсиелл, выделенных у детей с различной патологией и в случае дисбактериоза кишечника. Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой частоте встречаемости хромосомного ivyC гена у штаммов X.pneumoniae, равной 40,3% (52 из 129), в то время как у бактерий K.oxytoca данный ген обнаружен в единичных случаях, что может объяснить редкую частоту выявления K.oxytoca в составе кишечного микробиоценоза. Анализ данных проведенного исследования показал, что массивное обсеменение кишечника K.pneumoniae (8,0 lg КОЕ/мл) достоверно чаще вызывали штаммы, обладающие одновременно ivyC и pliC генами. Полученные данные свидетельствуют о том, что гены ингибиторов лизоцима обеспечивают штаммам K.pneumoniae селективные преимущества в кишечном микробиоценозе и способствуют избыточному росту бактериальных клеток, колонизации и, по-видимому, формированию бактериальной биопленки. Проведенные нами ранее исследования на изогенных парах штаммов клебсиелл, отличающихся по наличию конъюгативной плазмиды рAlz-60, выявили роль ингибитора лизоцима в персистенции бактерий в организме лабораторных животных и замедлении срока переваривания Alz+ трансконьюгантов перитонеальными макрофагами в сравнении с Alz- клетками в 2 раза. Первые сохранялись в фагоцитах 10 - 12 часов, в то время как бактерии, не обладающие антилизоцимной активностью, погибали в течение 5 - 6 часов от момента инфицирования культуры перитонеальных макрофагов морской свинки [1 - 3]. Выявленная в данной работе персистенция в течение 2 месяцев (срок наблюдения) при дисбактериозе кишечника клебсиелл, обладающих хромосомным ivyC геном, подтверждает роль ингибиторов лизоцима в длительном их сохранении в организме ослабленных детей с дисбиотическим состоянием.

About the authors

S. V Fialkina

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

V. M Bondarenko

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

I. B Rabaev

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

I. V Nikolaeva

Kazan State Medical University, Russia

D. R Semenova

Kazan State Medical University, Russia

References

Supplementary files