FROM MOLECULAR TO GENOMIC AND METAGENOMIC EPIDEMIOLOGY

Full Text

В 2013 году исполнилось 40 лет с момента выхода статьи Э. Килберна «Молекулярная эпидемиология гриппа» [1]. Ретроспективная оценка последующих событий показывает, что статья породила два мало связанных друг с другом процесса: дебаты о том, имеет ли право на жизнь само понятие «молекулярная эпидемиология» и процесс неуклонного роста работ и научных сообщений по этой проблеме. По состоянию на 17.11.13 в базе данных PubMed Central США зарегистрировано 94 336 публикаций, посвященных молекулярной эпидемиологии. Это, безусловно, огромное число, поскольку оно составляет почти 1/5 от всей массы публикаций по проблемам молекулярной биологии, зарегистрированных на тот же период времени. В числе этих публикаций - три объемистые монографии, вышедшие только за последние три года [8, 30, 40] и самая последняя коллективная акция - специальный выпуск журнала Eurosurveillans в двух томах по теме «Молекулярная эпидемиология человеческих патогенов» [10]. В историческом аспекте не только инфекционная, но еще две отрасли эпидемиологии - экологическая эпидемиология и эпидемиология рака заявляют, что в их рамках тоже независимо и одновременно возникла молекулярная эпидемиология и создала хотя и пересекающиеся, но самостоятельные области исследований [14]. Однако единого мнения по этому вопросу нет, и J.S.Dorman [9] отстаивает иную точку зрения, причем сразу по двум аспектам. Он считает, что исторических источников было два - инфекционная эпидемиология и эпидемиология рака и образовали они одну молекулярную эпидемиологию, единую для всех областей эпидемиологии. Несмотря на возрастающий поток публикаций, общепринятого (или коллегиально утвержденного) определения этой области исследований до сих пор нет, хотя существует международная рабочая группа по молекулярной эпидемиологии. Тем не менее, есть много авторских определений, наиболее типичные из которых приводятся ниже в хронологическом порядке. Одно из первых - определение P.A.Schulte et al. соредактора первой обстоятельной монографии по данной проблеме [42]: «Молекулярная эпидемиология - это использование биологических маркеров или биологических измерений в эпидемиологических исследованиях». Оценка этой формулировки совершенно однозначна - молекулярная эпидемиология трактуется как методическое направление, не более того. Но уже в 1997 году O.Shpilberg et al. делают важное уточнение на основании накопленных к тому времени знаний: «Молекулярная эпидемиология использует молекулярные методы, чтобы определить болезнь и ее доклинические стадии, определить количественную меру воздействия патологического фактора и идентифицировать гены восприимчивости» [43]. Гены восприимчивости - ключевое понятие этого определения. Еще одно ключевое понятие, важное для инфекционной эпидемиологии, нашло отражение в определении B.R.Levin et al.: «Цели молекулярной эпидемиологии состоят в идентификации микропаразитов, определении их источников, их биологических связей и путей передачи, а также генов, ответственных за их вирулентность, за пригодные для вакцин антигены, за лекарственную устойчивость» [25]. Таким образом, к концу 90-х годов ХХ века гены восприимчивости человека и гены патогена, хотя и в разных определениях, но были четко обозначены как атрибуты молекулярной эпидемиологии. По всей вероятности, наиболее радикальное определение молекулярной эпидемиологии дает J.S.Dorman: «Молекулярная эпидемиология - наука, которая изучает роль генетических и внешнесредовых факторов риска, выявленных на молекулярном и биохимическом уровне, в этиологии, распространении и контроле болезней» [9]. Здесь ключевое слово - наука как определение статуса молекулярной эпидемиологии. Однако совсем иначе трактует этот статус «Эпидемиологический словарь» под редакцией Джона Ласта: «Молекулярная эпидемиология - использование методов молекулярной биологии в эпидемиологических исследованиях ... - это, на самом деле, скорее уровень и метод измерений, чем некая дисциплина с самостоятельным научным содержанием» [1, 26]. Подобных суждений было немало на рубеже веков, в весьма образной форме они нашли отражение в специальной статье D.Hunter [21]: «Разделы эпидемиологической активности, классифицированные согласно методам исследования, более коротко-живущи, чем разделы, классифицированные по типам болезней или типам воздействий на организм. Будет ли существовать что-то, названное «молекулярная эпидемиология» через 20 лет? Вероятно, лучший ответ «Нет». Молекулярные методы полностью растворятся в общепринятых разделах эпидемиологии». Это предсказание, любопытное со всех точек зрения, заслуживает комментария с современных позиций при дальнейшем изложении материалов данной статьи. Методы молекулярной эпидемиологии, вызывающие столь эмоциональные суждения, быстро пополнялись и развивались в течение последних 20 лет. Методики первого этапа: риботипирование, пульс-электрофорез, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК, различные варианты ПЦР, ПЦР со случайными праймерами, сполиготипирование, VNTR-типирование (анализ вариабельных тандемных повторов нуклеотидов) - все это - различные методы генотипирования патогенов, задававшие тон в исследованиях 90-х годов ХХ века и начале нулевых годов XXI века [14]. Весь этот период можно смело назвать генотипическим периодом молекулярной эпидемиологии инфекционных болезней. Главное достоинство методов генотипирования - более высокая дискриминирующая (разрешающая) сила по сравнению с серотипированием, фаготипированием, ферментотипировнием, при идентификации патогенов и вытекающая отсюда возможность точнее, быстрее и достовернее определять источники, пути передачи патогена и раскрывать эпидемиологические связи, т.е. диагностировать очаги и вспышки инфекционных болезней. Иными словами, решать традиционные задачи эпидеми-логии, известные со времен К.Сталлибрасса. Отсюда следует непреложный вывод, что молекулярная эпидемиология генотипического периода - это действительно методическое направление эпидемиологии инфекционных болезней. Заслуги этого направления перед наукой и практикой огромны. Риботипирование, к примеру, позволило построить новую номенклатуру коринебактерий дифтерии и взять под контроль распространение, импорт-экспорт и передачу этого возбудителя в очагах в ходе эпидемии дифтерии в Восточной Европе в 90-х годах XX века [37]. Метод пульс-электрофореза широко использован при расшифровке заболеваний с пищевым путем передачи, дал возможность внедрить практически глобальную сеть микробиологического мониторинга распространения сальмонелл и других патогенов [44]. Сполиготипирование принесло первые впечатляющие данные о масштабах разнообразия микобактерий туберкулеза и создало основу для резкого улучшения эпидемиологической и клинической диагностики туберкулеза, включая дифференциацию случаев реинфекции, суперинфекции и рецидивов [7]. Однако при тонком различии патогенов методические подходы генотипического этапа молекулярной эпидемиологии оставляли одно «но». Как методы-маркеры или «отпечатки пальцев» они оставляли открытым вопрос о механизмах формирования разнообразия патогенов - о структуре и функции генов, стоящих за генотипами, хотя это принципиально важно для анализа и прогноза инфекционного и эпидемического процессов. Поэтому два фактора: неудовлетворенность исследователей и возросшие методические возможности молекулярной биологии неуклонно вели дальше - сначала к однолокусному секвенированию (лимитированному сиквенсу отдельных генов или фрагментов генов); затем - к мультилокусному секвенированию ДНК (как правило, 7 генов «домашнего хозяйства» бактерий); и наконец, к сиквенсу полного генома патогенов - сначала в вирусологии, а затем и в бактериологии [6, 11, 15, 31, 51]. Тем самым было положено начало геномному подходу в разработке проблем эпидемиологии. Начался переход от «детекторного», или формального маркирования патогенов к «функциональному» подходу, который учитывает функцию и роль генов в патологии и передаче. Коллективным результатом исследований этого периода стали новые фундаментальные знания, генерированные молекулярной эпидемиологией совместно с молекулярной микробиологией. Новая концепция о биоразнообразии, динамике и эволюции микробных популяций: понятие о клональных, панмиктических, смешанных биологических видах микроорганизмов) [45]. Понятие «супрагеном» или «пангеном» вида, обозначающее полный набор генов, присущих виду («коровый геном», «необязательный геном», «мобилеом») [32]. Понятия «вирулом», «токсом», «резистом» (комплексы генов, ответственных за вирулентность, токсигенность, антибиотикорезистентность) [12, 52]. Открытие многообразия некультивируемых видов бактерий и вирусов (до 100 млн видов) [27]. Эволюционная история видов - филодинамика, филогеография, позволившие заглянуть в прошлое патогенов на миллионы лет назад [36, 38]. Первые знания о механизмах инициации новых эпидемических процессов (преодоление межвидового барьера, селекция «успешных» генетических линий, генетические превращения патогена по ходу эпидемической волны) [5, 16, 17, 41]. В течение более чем 100 лет после основания медицинской микробиологии события, связанные с возникновением патогена (инициальная фаза) и механизмы этого явления не рассматривались в эпидемиологии. Патоген, по существу, подразумевался как некая постоянная данность, которую, начиная с К.Сталлибрасса, могли не включать в эпидемиологические построения (в состав элементов и движущих сил эпидемического процесса). Знания о генетических механизмах (событиях), ведущих к возникновению и глобальной диссеминации новых патогенов, стали накапливаться именно в геномный период изучения микроорганизмов. Генерировав и усвоив представленные выше фундаментальные достижения, молекулярная эпидемиология вступила в следующий - геномный период своего развития. Она сформулировала и активно пополняет новую систему знаний, которая придает ей собственное научное содержание, превращая из методического направления в самостоятельную отрасль эпидемиологии. Первое, что надо особо подчеркнуть - эта отрасль не вытесняет и не замещает другие направления, но расширяет содержание современной эпидемиологии. Второе, что также необходимо отметить - появление новых отраслей эпидемиологии подтверждает ту общую истину науковедения, что всякая развивающаяся наука подвержена дифференциации и/или интеграции [3]. Интегрируясь с молекулярной биологией и геномикой и формируя свою новую отрасль, эпидемиология в очередной раз демонстрирует потенциал роста и способность отвечать на вызовы времени. Согласно доступным материалам литературы специальные науковедческие исследования по анализу структуры и дифференциации эпидемиологии не предпринимались. Тем не менее, сложились устойчивые, идентифицируемые специалистами [9, 26, 46] области исследований и разработок, которые могут считаться отраслями эпидемиологии: теоретическая, прикладная, полевая, описательная, аналитическая, экспериментальная, экологическая, политическая, поведенческая, онкологическая, генетическая, молекулярная. Положение молекулярной эпидемиологии в этом строю отраслей схематически и предельно упрощенно можно представить следующим образом: если традиционная эпидемиология оперировала преимущественно антигенными вариантами патогена и уровнем популяционного иммунитета населения, то молекулярная эпидемиология - генотипами (в будущем их заменят более конкретные генетические варианты патогенов) и генетическими механизмами предрасположенности населения к инфекциям. Тем самым, молекулярная эпидемиология вносит самостоятельный вклад в изучение биологической составляющей эпидемического процесса. Методическая база молекулярной эпидемиологии - секвенирование полного генома. Полногеномный сиквенс, к примеру - это условие, без которого нет и не может быть эпидемиологии возникающих инфекций. В том числе: расшифровки SARS [18], идентификации пандемичных штаммов вируса гриппа [2, 19, 20], расшифровки современных эшерихиозов включая Escherichia coli OW:^ и других инфекций [13, 22, 47] . Энтерогеморрагический эшерихиоз О104:Н4 преподал, может быть, самый поучительный урок по теме идентификации патогенов. E. coli O104^4, вызвавшая высоколетальную эпидемическую вспышку в странах Европы в 2011 году (4075 случаев, 908 больных с гемолитико-уремическим синдромом, 50 летальных исходов [13, 22]), первоначально была идентифицирована по данным MLST, т.е. по семи генам «домашнего хозяйства», и этот MLST-тип (ST678) оказался полностью идентичным штамму, который уже возникал в Германии в 2001 году. Но попытки найти какие-либо эпидемиологические связи новой вспышки со штаммом 2001 года не дали результатов. Ситуация обрела ясность, когда был выполнен полногеномный сиквенс ДНК этого патогена. При этом обнаружены существенные отличия указанных штаммов по плаз-мидному профилю и структуре целого ряда хромосомных генов, не относящихся к генам «домашнего хозяйства». Независимое ретроспективное исследование [22] открыло поразительную картину быстрой изменчивости E. coli O104^4 - в 167 (!) генах штамма 2011 года были найдены отличия рекомбинационного характера от известных штаммов MLST-типа ST678, изолированных в предыдущие годы. В хромосомной ДНК и плазмидном наборе оказалось 14 генов, кодирующих факторы патогенности и анти-биотикорезистентности, заимствованные от патогенов других биологических видов. Это - шигаподобный токсин-2, энтеротоксин Set 1, факторы колонизации, адгезии, плазмиды мультирезистентности к антибиотикам. Приобретение этих генов и превратило эшерихию в высоколетальный эпидемический штамм. Эта драматическая история, как и все последние ситуации с реассортацией генома вируса гриппа, окончательно утвердили специалистов в следующей мысли, которая была выражена во многих статьях: «Необходима смена парадигмы - переход от одиночных признаков (например, генотипа) при характеристике патогена к полной расшифровке генома вирусных и бактериальных патогенов для целей клинической и эпидемиологической практики» [39, 48, 49]. Дальнейшие события после подведения итогов вспышки эшерихиоза O104^4 развивались быстро: в ноябре 2011 года Евро СDС был организован митинг экспертов по теме: «Прорыв в молекулярной эпидемиологии патогенов человека - как его перевести в практику общественного здравоохранения» - со специальным акцентом на освоении секвенирования следующего поколения [39]. Обсуждались все вопросы - от научных до финансовых. Специально рассмотрен, но оставлен открытым вопрос о понятии «тип» (генотип, MLST-тип) с учетом последних достижений геномики. Оставлен открытым потому, что многими экспертами было высказано суждение, что, вероятно, пришло время отказаться от понятия «тип». На смену придут другие термины на основе геномной вариабельности, возможно, геномные линии, клоны или геномные варианты, когда критерии для их дифференциации будут определены. В отчете о митинге согласованное мнение экспертов сформулировано следующим образом: «Встреча подтвердила огромные научные возможности полногеномного секвенирования для лучшего понимания патогенности, эволюции и распространения патогенов человека и его перспективность для надзора за болезнями. Евро СDС будет соединяющим мостом между научными и санитарно-эпидемиологическими организациями, чтобы совместно ответить на общие вызовы» [39]. В ноябре 2012 года в Европейской системе эпидемиологического надзора уже стартовал первый пилотный проект «MSS - молекулярная служба надзора» - сеть лабораторий на территории 13 стран Евросоюза, которая работает в режиме «on line», выполняя полногеномный сиквенс и поставляя его результаты в общедоступную для участников базу данных обо всех выделяемых штаммах четырех видов патогенов: сальмонелл, E. coli, листерий, мультирезистентных микобактерий туберкулеза [34]. В ноябре 2012 года опубликована статья с названием, которое говорит само за себя: «Объединяющая информационная система на геномной базе для модернизации глобального мониторинга болезней, обмена информацией и ответа» [4]. Статья подписана 20 специалистами из 9 стран (что подчеркивает массовость движения), в ней дается прогноз, что в течение ближайших 5 - 10 лет такая система глобального мониторинга будет построена (допускается возможность организации нескольких центров в мире). Глобальные связанные системы баз данных о геномах циркулирующих патогенов, по мнению авторов, обеспечат «более эффективное выявление, предупреждение и контроль эндемичных, возникающих и других вспышек инфекционных болезней во всем мире». В январе 2013 года вышло два тома журнала «Euro Surveillance», издаваемого Евро CDC, где представлено 16 статей (обзорных и оригинальных), посвященных теории и опыту практического применения геномного подхода и полногеномного сиквенса в эпидемиологическом расследовании десятков инфекционных форм. Авторами активно используется новое понятие «геномная эпидемиология» [33, 48], которое, безусловно, займет свое место в специальной литературе. В связи с этим, возникает вопрос, не прав ли был D.Hunter [21] в том, что молекулярная эпидемиология не переживет и 20 лет? Учитывая продолжающийся и нарастающий поток публикаций по этой проблематике и впечатляющие результаты, может быть дан однозначный ответ, что молекулярной эпидемиологии уход со сцены не грозит. Точно также, как появление геномики не упразднило молекулярной биологии, появление геномной эпидемиологии не упраздняет эпидемиологии молекулярной. Речь может идти о явлении совсем иного порядка - о дифференциации молекулярной эпидемиологии в результате ее развития. И едва эта первая дифференциация произошла, в дверь уже стучится вторая дифференциация молекулярной эпидемиологии. Это будет, несомненно, выделение новой ветви на основе новой дисциплины - метагеномики, которая буквально ворвалась недавно в медицину, симбиологию и экологию. Термин «метагеномика» предложен в 1998 году [23] для описания новой области исследований, которая может определять всю совокупность геномов в любой конкретной среде обитания, будь то внешняя среда или биологическая среда макроорганизма и что особенно важно - без культивирования бактерий и вирусов. Алгоритм исследования при этом выглядит следующим образом: все микробное сообщество (бактерии, вирусы, простейшие), присутствующее в изучаемом образце (например, в мазке из зева человека или воде водоисточника), подвергается экстракции ДНК, амплифицируется, подвергается полногеномному шот-ган секвенированию, после чего идет компъютерная сборка генов и реконструируется полный набор геномов, присутствующих в образце [54]. Идентификация может быть выполнена с заданной разрешающей способностью, то есть на разную таксономическую глубину - до семейства, рода, вида, клона, квазивида или любого иного генетического варианта. Результат, в зависимости от программного обеспечения, выражается в виде дендрограммы, диаграммы или таблицы с количественным содержанием ДНК или РНК таксонов, идентифицированных в образце. Объем информации при каждом одиночном анализе будет огромен, об этом говорят результаты уже состоявшихся проектов. Консорциум американского проекта «Микробиом человека» обнаружил в микробиоте человека 5177 микробных таксономических профилей по гену 16s рРНК, 11 174 первичных биологических вида, при этом секвенировано 800 референс-штаммов из состава микробиома [50]. Тем самым, получен первичный материал для дальнейших сравнительных исследований. По имеющимся прогнозам полное число видов бактерий и вирусов, населяющих все среды и ткани человека, может достигать 40 тысяч [28]. Они укрывают массу полезных, но и множество потенциальных и безусловных патогенов. Все это микробное сообщество, также как микробиомы почвы, водоисточников, производственной и бытовой среды человека, может быть подвергнуто эпидемиологическому анализу и надзору. Техника для высокопроизводительного секвенирования уже используется в отдельных научных центрах в целях так называемой метагеномной диагностики, позволяя получать полную информацию об инфицировании пациента бактериями, вирусами и простейшими «в одном протоколе за один прием» [29, 35]. Наглядным примером такой диагностики является метагеномный анализ вирома, т.е. совокупности вирусов у детей первого года жизни с лихорадкой неясного генеза [53]. Первое, что показали авторы этой статьи - метагеномный анализ выявляет 15 родов вирусов, не обнаруживаемых с помощью ПЦР. И второе - очевидную разницу результатов у здоровых и лихорадящих детей. В крови не лихорадящих обнаружены только аннеловирусы (вероятно, комменсалы), тогда как в группе лихорадящих - 8 родов вирусов в крови, в том числе: астровирусы, энтеровирусы, флавовирусы, по-лиомавирусы и др. В отделяемом из носа картина оказалась более сложной, спектр обнаруженных вирусов шире, но разница между здоровыми и лихорадящими младенцами была также очевидна. Этиологическая роль каждого из этих вирусов, обнаруженных у лихорадящих детей, несомненно, будет уточнена в ближайшем будущем, и диагноз «лихорадка неясного генеза» уйдет в прошлое. Под влиянием подобных работ придется еще раз сменить диагностическую парадигму: совершить переход от поиска одного конкретного «целевого» патогена к обзору всех возможных патогенов в образце материала от больного или из внешней среды. Метагеномика, тем самым, дает уникальный шанс освоить один универсальный согласованный подход взамен многих разнородных методов индикации, идентификации и генотипирования патогенов. Клинической и эпидемиологической диагностике предстоит переходный период, когда одновременно будут работать методы, основанные и на генотипическом, и на геномном и метагеномном подходах [48]. Далее и параллельно пойдет период научного осмысления новой, небывалой по объему и разнообразию информации и переход на стандартные геномные и метагеномные технологии по принципу разумной достаточности, т.е. полнота анализа может варьироваться в зависимости от места, времени и эпидемической ситуации. Нерешенных проблем на этом пути - непочатый край. В самом первом приближении, они могут быть представлены в виде следующего перечня: Определить и построить библиотеки супрагеномов микроорганизмов актуальных видов; Выстроить геномную номенклатуру штаммов; Понять значение генов с неизвестной сегодня функцией; Научиться прогнозировать эволюцию патогенов; Определить значение генетического полиморфизма человека для предрасположенности к инфекциям; Выявить ассоциации некультивируемых микроорганизмов с болезнями; Оценить вероятных патогенов по критериям Хилла; 7. ЖМЭИ 3 № 31 97 Построить общедоступные интегрированные базы геномных данных; Построить общедоступные интегрированные базы метагеномных данных; Разработать протоколы геномного и метагеномного мониторинга по принципу разум ной достаточности; Разработать программное обеспечение для пользователей метагеномными данными; Создать персональные метагеномные паспорта человека; Создать метагеномные паспорта сред обитания человека; Разработать практическую систему эпидемиологичекого надзора на основе геномных и метагеномных подходов. Если этот метагеномный подход будет внедрен в практику эпидемиологического надзора (а это всего лишь вопрос времени), профилактическая медицина впервые сможет создать систему упреждающего - дозорного надзора не только за известными, но и потенциальными патогенами и получит возможность своевременного парирования риска, используя непрерывную информацию о циркуляции всего многообразия бактерий и вирусов в популяции населения и во внешней среде.

About the authors

A. B Zhebrun

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files