ACTIVITY OF B AND D FACTORS OF COMPLEMENT ALTERNATIVE PATHWAY IN CHILDREN WITH ATOPIC DERMATITIS

Full Text

Недавно обнаружено участие комплемента в гомеостатическом взаимодействии кожи хозяина и микробиома [7]. Полученные данные выдвигают на первый план ранее непризнанную роль комплемента в здоровом состоянии кожи. Комплемент может, в частности, быть ответственным за поддержание различных наборов микробов на нашей коже, что может играть роль при кожных заболеваниях. При изучении статуса комплемента при различных заболеваниях чаще всего исследуют состояние классического пути активации системы. Однако в последнее время было подтверждено, что за развитие патологического процесса очень часто ответственность несет альтернативный путь активации и нарушение его регуляции. Так, например, обстоит дело с развитием атеросклероза сосудов и ишемических заболеваний, при астме, ревматоидном артрите, поражении почек в волчаночном нефрите, гломерулонефрите и атипичном гемолитико-уремическом синдроме [14]. Об участии в патологическом процессе при атопическом дерматите компонентов комплемента классического пути активации свидетельствуют многочисленные работы, приведенные в обзоре Логунова О.В. и др. [2], а также собственные исследования авторов [4]. Однако роль альтернативного пути комплемента до сих пор остается не выясненной. На этот счет имеющиеся в литературе сведения противоречивы. Так, в работе Takematsu H. и Tagami H. [13] утверждается, что при атопическом дерматите, рассматриваемом как воспалительное заболевание кожи, не происходит активации комплемента ни по классическому, ни по альтернативному пути. Тем не менее, имеются указания на то, что среди детей с атопией часты случаи функциональных дефектов альтернативного пути комплемента, которые не зависят от пола и возраста ребенка, сезона обследования, типа атопического синдрома и уровня IgE [12]. Кроме того, концентрация регулирующего альтернативный путь фактора I значительно повышена в плазме крови детей с атопическим дерматитом [11]. Атопия может быть определена как генетически детерминированный и экологически зависимый синдром, в котором первичной иммунологической аномалией является производство аллерген-специфических IgE [6]. Известно, что IgE является хорошим активатором альтернативного пути [8] и, кроме того, фактор B альтернативного пути, синтезируемый и секретируемый кератиноцитами (эпителиальными клетками кожи) [15], может играть важную роль в локальных воспалительных реакциях, а также напрямую взаимодействовать с компонентом C3, который также продуцируется кератиноцитами человека [5]. Все эти факты послужили основанием изучить активность факторов B и D альтернативного пути комплемента при атопическом дерматите у детей до лечения и после лечения. В литературе и практике отсутствуют современные методы определения функциональной активности основных факторов альтернативного пути B и D, в то время как простое количественное определение этих белков бывает недостаточно информативным. Наиболее популярные методы анализа содержания белков в сыворотке крови основаны на иммуноферментном подходе, в котором осуществляется иммуно-химическое связывание интересующего белка как антигена на антителах к нему, сорбированных на микропанели, с последующим определением количества связанного белка с помощью иммунохимического узнавания антителами, конъюгированными с ферментом, измеряемая активность которого пропорциональна количеству этого белка. Однако в случае факторов B и D, являющихся протеазами, определение их количественного содержания в крови является малоинформативным, поскольку именно функциональная активность ответственна за все процессы каскада активации альтернативного пути. Новым подходом в использовании иммуноферментного метода была замена первой иммунохимической стадии, а именно связывания тестируемого белка на микропанели с антителами к нему, стадией активации альтернативного пути, завершающейся ковалентным связыванием фрагмента C3b компонента C3 с активатором, сорбированным в лунках микропанели. Обнаружением связанного C3b традиционным методом с помощью конъюгата с пероксидазой IgG к C3 завершается анализ. Активность факторов B и D определялась в условиях, когда активация альтернативного пути проводилась при дефиците этих факторов в разбавленной испытуемой сыворотке при избыточном содержании других компонентов системы. Это осуществлялось введением в реакционную смесь реагентов RB или RD, представляющих собой нормальную сыворотку крови человека, искусственно лишенную активности тестируемых факторов, как это делается при определении гемолитической активности этих факторов [1]. Таким образом, количество связавшегося компонента C3 определялось функциональной активностью факторов B или D, находящихся в условиях относительного дефицита. Другой инновацией было использование лизоцима в качестве активатора альтернативного пути вместо традиционного зимозана или агрегированного IgA. Оказалось, что лизоцим обладает хорошей способностью активировать комплемент по альтернативному пути. Разработке методов определения функциональной активности факторов B и D альтернативного пути комплемента и применению их для определения активности этих факторов в сыворотках крови детей с атопическим дерматитом до и после лечения посвящена эта работа. 17 2. ЖМЭИ 3 № 31 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали 96-луночные плоскодонные микропанели с повышенной сорбционной емкостью (Биомедикал, Россия), Твин-20 (Sigma, США), этиленгли-коль-бисф-аминоэтиловый эфир)- ^^№,№-тетрауксусную кислоту (EGTA) (Sigma, США), пероксидазу хрена (Диаэм, Россия), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Medac, Германия), лизоцим (Ферейн, Россия), козьи поликлональные IgG к компоненту C3 человека (Sigma, США). Реагенты RB или RD получали методами, описанными для гемолитического определения [1]. Объектом исследования являлись дети в возрасте от 6 месяцев до 18 лет, больные атопическим дерматитом, проходившие обследование в отделении аллергологии Областной детской клинической больницы им.Н.Н.Силищевой г. Астрахань. Было проведено полное клинико-лабораторное обследование соответственно стандартам диагностики атопического дерматита с неосложненным течением заболевания и при наличии вторичного инфицирования у 20 детей в возрасте от 6 мес до 7 лет. Лечение среднетяжелого атопического дерматита как при наличии, так и при отсутствии вторичной инфекции проводилось соответственно стандарту [3] с использованием антибиотиков: линкомицина, сумамеда, рулида, мази тридерм и антигистаминного препарата тавегила, согласно инструкциям по применению и в соответствии с возрастом больного. Для раздельного определение функциональной активности факторов B и D растворяли активатор альтернативного пути комплемента - аптечный препарат лизоци-ма в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10 - 100 мкг/мл и вносили по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-лу-ночной микропанели. Закрывали крышкой и оставляли на ночь при 4°С. Три раза отмывали микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М №С1, 10 мМ этиленгликоль-бисф-аминоэтиловый эфир)-^^№,№-тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl2 (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушали путем стряхивания остатка жидкости. Для фактора В в лунки микропанели вносили по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента RB (RB - сыворотка человека, лишенная фактора B с сохранением активности остальных компонентов и факторов комплемента, получаемая, например, прогреванием ее в течение 30 мин при 50°C [1]), и анализируемую пробу, содержащую фактор B с неизвестной активностью. Для фактора D в лунки микропанели вносили по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента RD (RD - сыворотка человека, лишенная фактора D с сохранением активности остальных компонентов и факторов комплемента, получаемая, например, хроматографической сорбцией фактора D на колонке с CM-сефадексом C-50 из сыворотки крови человека [1]), и анализируемую пробу, содержащую фактор D с неизвестной активностью. Далее для факторов B и D раздельно после инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М №С1 и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносили по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента СЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После ИЧц-ЗД 8. MfAth P. Wfl# Рис. 1. Определение активности фактора B Рис. 2. Определение активности фактора D иммуноферментным методом. иммуноферментным методом. инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносили по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15 - 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением свето-поглощения при 450 нм. Функциональную активность препаратов факторов В и D рассчитывали по стандартной кривой (рис. 1, 2). РЕЗУЛ ЬТАТЫ Разработанные новые методы иммуноферментного анализа для определения функциональной активности факторов B и D альтернативного пути активации комплемента в сыворотке крови человека показали высокую чувствительность и надежность. Калибровочные графики (рис. 1 и 2) в обоих случаях представляли собой линейные зависимости с коэффициентами корреляции R2, равными соответственно 0,995 и 0,996. В обоих методах в качестве стандарта использовался пул не менее 10 сывороток здоровых людей. Предполагалось, что активность факторов в этих сыворотках составляла 100%, а среднее содержание бралось из источников литературы. Содержание активного фактора B в стандартной сыворотке принимали за 200 мкг/ мл в соответствии с данными работы [9]. Содержание активного фактора D в стандартной сыворотке принимали за 2 мкг/мл [10]. Для изучения возможного участия альтернативного пути комплемента при атопическом дерматите была определена активность факторов B и D разработанными методами в сыворотках крови 20 больных детей до и после проведения стандартной терапии. Как следует из полученных данных, активность обоих факторов, выраженная в концентрациях активного белка, до лечения была существенно ниже нормы: для фактора B - 85±19 мкг/мл при норме 200 мкг/мл, а для фактора D - 1,50±0,65 мкг/ мл при норме 2,0 мкг/мл. Проведенное лечение достоверно (p<0,004) повышало активность фактора B до значения 104±20 мкг/мл, а фактора D до 2,14±0,63 мкг/мл, то есть, до нормального уровня. ОБСУЖДЕНИЕ Разработка методов определения функциональной активности факторов B и D создает инструмент для изучения функционирования альтернативного пути системы комплемента при различных патологических состояниях организма. Характеристика комплементарного статуса больного, основанная на определении количественного содержания компонентов и факторов комплемента, не информативна по причине неадекватности. Действительно, в острой фазе заболевания происходит потребление компонентов комплемента, связанное с их инактивацией в ходе развивающегося каскада реакций. При этом часто наблюдается индуцированный повышенный биосинтез израсходованных компонентов. Потерявшие активность компоненты могут надолго задерживаться в кровотоке из-за нарушений их клиренса. Если определять просто концентрацию интересующих нас компонентов, то суммарное значение активных и неактивных белков не будет отражать истинное состояние активности комплемента. Создание современных методов определения функциональной активности главных факторов альтернативного пути поможет мониторировать процессы выздоровления или отягощения состояния больного. Первым таким примером явилось изучение статуса альтернативного пути при лечении атопического дерматита у детей, проведенное в этом исследовании. Как уже отмечалось выше, не было однозначного ответа относительно роли альтернативного пути в этой патологии. В одних работах такая роль отрицалась, в других имелись лишь косвенные свидетельства об изменении количества (не активности) белков, имеющих отношение к системе. Сделанное в этой работе наблюдение снижения активности факторов B и D при заболевании и повышение или даже восстановление активности после проведенной терапии указывает, с одной стороны, на существование активации альтернативного пути комплемента в ходе болезни и, с другой стороны, на возможность использования таких анализов в диагностических и прогностических целях.

About the authors

N. V Gora

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

L. V Kozlov

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

O. V Logunov

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

O. A Bashkina

Astrakhan State Medical Academy

Astrachan, Russia

O. V Rubalsky

Astrakhan State Medical Academy

Astrachan, Russia

V. A Aleshkin

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files