EXCRETION OF EXTRACELLULAR MEMBRANE NANOVESICLES BY AEROMONAS

Full Text

Грамотрицательные бактерии Aero-monas hydrophila и Aeromonas salmoni-cida широко распространены в окружающей среде и способны вызывать инфекционный процесс у рыб, амфибий, моллюсков и человека. Инфицирование человека бактериями рода Aeromonas приводит к развитию таких воспалительных заболеваний, как менингит, пневмония, перитонит, ко-ньюнктивит, остеомиелит, гнойный артрит, миозит, холецистит, эндокардит, инфекции уха, горла и носа и др. [2]. Патогенность этих бактерий определяется продукцией большого количества факторов патогенности включая липазу, хитиназу, желатиназу, гемолизины, цитолитический энтеротоксин, аэролизин, термостабильный и термолабильный энтеротоксины [1, 9]. Процессы развития инфекционного процесса при заболеваниях, вызванных аэромонадами, недостаточно изучены, а механизмы выделения токсинов и их взаимодействия с клетками организма-хозяина неизвестны. В работах последнего десятилетия показано, что ряд грамотрицательных бактерий выделяют со своей внешней поверхности в окружающую среду внеклеточные мембранные нановезикулы (ВМН), содержащие компоненты периплазмы. Установлено, что ВМН ряда бактерий могут содержать факторы вирулентности. Так, например, ВМН Escherichia coli содержат токсин ClyA [8], Helicobacter pylori - VacA [5], Pseudomonas aeruginosa - Cif и PQS [6], Shigella dysenteriae - шига-подобный токсин [4]. Полагают, что ВМН патогенных бактерий являются средствами доставки факторов патогенности в ткани эукариот [3, 8]. За последние два года в ряде работ был проведен протеомный анализ ВМН с использованием методов двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Установлено, что изолированные везикулы содержат более ста различных белков и среди них такие белки внешней мембраны бактерий и периплазмы, как липопротеин AcfD, белок рецептора TolC, антиген внешней мембраны, фосфолипаза A1, каналообразующий белок tsx, предшественник порина LC, цитолетальные разрыхляющие токсины, протеаза, глу-тамин-связывающий белок, b-глюко-зидаза, белок-переносчик липопротеина, цитотоксичная металлопротеаза и др. [7]. Целью работы является исследование продукции внеклеточных мембранных нановезикул. В работе использовали бактерии 4 штаммов A.hydrophila: 342-1 (апатоген-ный штамм) и три патогенных: Е 8-8, Н 336 и Н 1-6-05 из коллекции НИИ ПЗК РАСХН (Москва) и эталонный штамм A.salmonicida A-450 из коллекции Университета Гвелфа (Канада). Бактерии A. hydrophila выращивали на агаризованной среде LB в течение 20 часов при 37°С, а бактерии A. salmonicida A-450 - на трип-тозном соевом агаре при 22°С. Применяли методы электронной микроскопии: ультратонкие срезы и негативное контрастирование. Для морфологической характеристики мелкие колонии всех штаммов размером 0,5 мм заливали расплавленным агаром, вырезали скальпелем и фиксировали в растворе 0,5% глутаральдеги-да и 2,5% формальдегида и затем в 1 % р-ре OsO4. После обезвоживания заливали в смолу LR White (Fluka) и проводили полимеризацию при УФ-облучении. Ультратонкие срезы контрастировали с помощью уранилацетата и цитрата свинца по Рейнольдсу. Негативное контрастирование проводили с помощью 2% ура-нилацетата или молибдата аммония. Материал просматривали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Zeiss Libra 200. С целью получения изолированных ВМН культуру A. salmonicida A-450 выращивали в триптозном соевом бульоне при температуре 22°С до ранней стационарной фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием и супернатант фильтровали через целлюлозоацетатные фильтры с порами 0,45 и 0,22 мкм. После ультрацентрифугирования при 150 000 ( g осадок ВМН ресуспендировали в 50 мМ буфере HEPES (pH 6.8) и хранили при -20°C. Проведено также изучение пристеночной микрофлоры различных отделов кишечника крыс. С помощью электронной микроскопии на поверхности клеток популяции бактерий A.hydrophila и A.salmonicida выявлены мембранные нановезикулы размерами от 20 до 200 нм в диаметре. На некоторых участках в препаратах можно наблюдать процесс отпочковывания везикул от бактериальной клетки. При использовании культуры A.salmonicida получены препараты изолированных ВМН. Установлено, что эти везикулы гетерогенны по размерам (от 20 до 200 нм). На ультратонких срезах кишечника крыс обнаружены бактерии разных видов. В непосредственной близости от клеток бактерий выявлены скопления гетерогенных мембранных нановезикул. Отдельные от клеток (свободные) нановезикулы были также обнаружены в виде цепочек из нескольких пузырьков, проникающих через гликокаликс и микроворсинки апикальной поверхности эпи-телиоцитов. Учитывая данные, представленные в литературе [4, 5, 8] о содержании в ВМН грамотрицательных бактерий различных факторов патогенности, мы предполагаем, что мембранные нановезикулы, выделяемые патогенными бактериями A. hydrophila и A. salmonicida, являются одним из элементов механизма патогенеза при инфицировании организма. Кроме того, выделение ВМН бактериями является еще одним типом секреции (помимо известных и изученных шести типов секреции белков из клетки). Тот факт, что ВМН продуцируют как патогенные, так и апатогенные штаммы бактерий может говорить также о том, что функция этих везикул не ограничивается только транспортом факторов патогенности. Возможно, ВМН также представляют собой средство коммуникации грамотрицатель-ных бактерий с другими клетками прокариот и эукариот.

About the authors

K. A Lusta

Research Institute of Human Morphology

Moscow, Russia

Yu. E Kozlovsky

Research Institute of Human Morphology

Moscow, Russia

References

Supplementary files