Competence of mosquitoes  Culex pipiens f.  molestus as carriers of West Nile virus under various temperature conditions

Elena V. Molchanova; Молчанова Елена Владимировна; Dmitry N. Luchinin; Лучинин Дмитрий Николаевич; Anastasiya Y. Machneva; Мачнева Анастасия Юрьевна; Arina D. Gerasimova; Герасимова Арина Дмитриевна; Anna V. Nesgovorova; Несговорова Анна Владимировна; Natalya V. Boroday; Бородай Наталья Владимировна; Natalya G. Plehanova; Плеханова Наталья Геннадьевна; Artem А. Baturin; Батурин Артем Александрович

doi:10.36233/0372-9311-287

Competence of mosquitoes Culex pipiens f. molestus as carriers of West Nile virus under various temperature conditions

Authors: Molchanova E.V.¹, Luchinin D.N.¹, Machneva A.Y.¹, Gerasimova A.D.¹, Nesgovorova A.V.¹, Boroday N.V.¹, Plehanova N.G.¹, Baturin A.А.¹
Affiliations:
1. Volgograd Plague Control Researsh Institute
Issue: Vol 99, No 5 (2022)
Pages: 540-544
Section: ORIGINAL RESEARCHES
Submitted: 30.05.2022
Published: 07.12.2022
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1230
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-287
ID: 1230

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. The Culex pipiens mosquito is one of the proven vectors of the West Nile virus (WNV). Culex pipiens f. molestus (Cx. p. f. molestus) is a synanthropic, autogenous, widespread form of the species that can feed on a broad range of hosts, including humans. The temperature of the habitat of insects affects the potential for virus transmission, which determines the likelihood of them carrying the pathogen of West Nile fever.

The goal is an experimental study of the temperature of the habitat of larvae on the competence of mosquitoes Cx. p. f. molestus as carriers of WNV.

Materials and methods. We used a strain of the WNV (WNV_Volg601/18 genotype 2) and a laboratory culture of mosquitoes Cx. p. f. molestus. The concentration of the virus was detected by plaque formation using Vero cells. Insects were infected orally at the larval stage, with subsequent incubation at 20, 22 or 28ºC. 72 hours after the emergence of all adults from the pupae, the mosquitoes were immobilized by cold, the sex of imago was determined, the salivary glands were isolated from the females, and the presence of WNV in glandes and its titer were detected.

Results. The titer of WNV sufficient to transmit the pathogen through the insect biting was observed in the salivary glands of insects kept at a temperature of 22 and 28ºC, with the virus titer rising with the temperature increasing. No virus was detected in the salivary glands of female insects kept at a temperature of 20ºC.

Conclusion. Thus, it appears that the habitat temperature is an important factor limiting the replication and content of WNV in the salivary glands of Cx. p. f. molestus.

Keywords

West Nile virus, Culex pipiens f. molestus, C6/36, competence

Full Text

Введение

Вид комаров Culex pipiens (Diptera, Culicidae) состоит из 2 морфологически идентичных биотипов: pipiens (Linnaeus, 1758) и molestus (Forskål, 1775), различающихся по физиологии и поведению [1].

В Европе Culex pipiens f. molestus (Cх. p. f. molestus) впервые появился в 1920-х гг. Приспособленность Cх. p. f. molestus к существованию в условиях городского жилища привела к расширению ареала его обитания на север. В 1960-х гг. комары заселили города европейского Севера. С 1980-х гг. началось проникновение этих насекомых в Сибирь и на Дальний Восток [2]. Наличие Cх. p. f. molestus отмечено практически во всех населённых пунктах России умеренной зоны [3]. Широкое распространение данного вида обусловлено его высокой экологической пластичностью, способностью личинок развиваться в разнообразных естественных и искусственных водоёмах, выдерживать высокую степень загрязнения воды, а имаго — питаться на широком круге хозяев [4].

Комары Cx. pipiens — один из основных видов — переносчиков вируса Западного Нила (ВЗН) [5, 6]. Несколько исследований определили векторную компетенцию этого вида для ВЗН [7, 8]. Температура среды обитания насекомых влияет на потенциал их вирусофорности, чем определяет их компетентность как переносчиков.

В связи с тем, что Cх. p. f. molestus часто встречается в подвалах городских построек, способен питаться на широком круге хозяев, в том числе на человеке, синантропная форма при условии вирусофорности позволяет поддерживать передачу патогена в ряду поколений, что ведёт к формированию очага лихорадки Западного Нила (ЛЗН), активного в течение всего года.

При исследованиях, проведённых в Волгоградской области в 2012 г., комары Cх. p. f. molestus были обнаружены как в открытых городских биотопах, так и в окрестностях Волгограда: на их долю пришлось 19,4 и 34,2% вида Cx. pipiens соответственно. Широкое распространение формы molestus может привести к ухудшению эпидемиологической ситуации в регионе, поскольку самки указанной формы обладают значительно более высоким уровнем антропофилии, чем самки pipiens [9].

Целью данной работы было изучение влияния температуры среды обитания личинок на компетентность комаров Cх. p. f. molestus как переносчиков ВЗН.

Материалы и методы

Комары

Лабораторная культура комаров Cх. p. f. molestus была получена из Института медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е.И. Марциновского.

Имаго комаров содержали в вольерах (0,5 × 0,5 × 0,5 м), обтянутых сеткой, личинок — в эмалированных кюветах с отстоянной водой. Взрослых особей кормили 6% раствором глюкозы, личинок — измельчённым кормом для котов («Kitekat», «Mars Inc.»). Насекомых содержали при 20–22ºC с циклом день : ночь 12 : 12 ч и относительной влажности 60%.

Вирус

В экспериментах использовали штамм ВЗН Volg_601/18 2 генотипа, выделенный из комаров Cх. modestus Fic., отловленных на территории Волгоградской области (штамм депонирован в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-959; полногеномная последовательность в GenBank: MN619800).

Клеточные культуры

Клеточную культуру C6/36, полученную из Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, культивировали в среде С-46 при 25ºС и атмосферном воздухе.

Клеточную культуру Vero выращивали в среде DMEM («БиолоТ») с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma-Aldrich»), 1% L-глутамина («Gibco») и 1% антибиотика/антимикотика («Sigma-Aldrich») при 37ºС, 5,5% СО₂ и 70% влажности.

Концентрацию вирусного изолята определяли методом бляшкообразования (количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 1 мл) с использованием линии клеток Vero.

Заражение комаров ВЗН

Все манипуляции проводили в помещениях лаборатории, соответствующих уровню биологической безопасности BSL-3¹.

По 100 экземпляров личинок комаров 4-й стадии вносили в 3 флакона, содержащих по 50 мл культуральной среды с клетками С6/36, заражёнными ВЗН в титре 1 × 10³ БОЕ/мл (погрешность ± 0,09 × 10³ БОЕ/мл). Флаконы помещали в индивидуальные эксикаторы, которые затягивали марлей вместо крышки и ставили в термостаты на весь последующий цикл превращения и вылета имаго при температуре 20, 22 или 28ºC и относительной влажности 60%. В течение 1 нед наблюдали за окукливанием и выходом имаго.

Через 72 ч после вылета всех имаго из куколок эксикаторы из термостатов помещали в холодильник (4ºC) на 6–8 ч, обездвиженных холодом насекомых собирали, определяли их пол.

Определение компетентности комаров как переносчиков ВЗН

Для определения наличия ВЗН и его титра у самок комаров выделяли слюнные железы, помещали их в стерильную пластиковую пробирку, ресуспендировали в 100 мкл ледяной культуральной среды DMEM («БиолоТ») с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma-Aldrich»), 1% L-глутамина («Gibco») и 1% антибиотика/антимикотика («Sigma-Aldrich»). Аликвоты образцов десятикратно титровали до концентрации 1 × 10^–5 и заражали ими монослой клеток линии Vero в 96-луночном планшете («Хеликон»). Культуральные планшеты инкубировали при 37ºС, 5,5% СО₂ и 70% влажности в течение 14 дней. Культуральную среду из лунок, где наблюдался апоптоз клеток, исследовали на наличие РНК ВЗН методом ОТ-ПЦР.

Идентификация вируса

Окончательное подтверждение наличия РНК ВЗН в культуральной среде клеток линии Vero, заражённых материалом слюнных желёз комаров, осуществляли методом ОТ-ПЦР согласно прилагаемой к набору «АмплиСенс WNV-FL» инструкции.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили в программе «Microsoft Excel 2010». Вычисляли средние арифметические значения, ошибки средних величин и доверительные интервалы. Данные представлены в виде M ± m при уровне значимости р ≤ 0,05.

Результаты

Известно, что продолжительность цикла развития Cх. pipiens составляет до 1 мес. После выхода из яйца личинка питается бактериями, одноклеточными организмами, личинками других комаров посредством фильтрации воды и проходит 4 стадии метаморфоза. В стадии куколки насекомое не питается, живёт в среднем около 2–5 дней и превращается в имаго. Продолжительность цикла развития комаров находится в прямой связи с температурой окружающей среды и при её повышении сокращается. В наших исследованиях период развития Cх. p. f. molestus от яйца до имаго при их инкубации в условиях температуры атмосферного воздуха 20, 22 или 28ºC составил 28, 26 и 21 день соответственно.

Для изучения влияния температуры среды обитания на компетентность комаров Cх. p. f. molestus как переносчиков ВЗН насекомых заражали перорально на 4-й личиночной стадии с последующей инкубацией при 20, 22 или 28ºC атмосферного воздуха и анализом концентрации патогена в слюнных железах сформировавшихся взрослых самок.

Личинок комаров помещали в культуральную среду с клетками С6/36, заражёнными ВЗН Volg_601/18 в титре 1 × 10³ БОЕ/мл (погрешность ± 0,09 × 10³ БОЕ/мл). Предполагалось, что благодаря своим особенностям личинки будут питаться инфицированными клетками, что и обусловит их пероральное заражение вирусом.

В результате работы обнаружено, что количество образовавшихся самок в каждой группе было статистически одинаковым, не зависело от температуры их содержания и равнялось 40 (20ºC), 44 (22ºC) и 42 (28ºC) экземплярам. В слюнных железах у насекомых, развивающихся при 20ºC, вирус не был обнаружен, при 22ºC ВЗН был выявлен у 7 самок, при 28ºC — у 19. Частота заражения ВЗН составила 0% при 20ºC, 15,9% при 22ºC и 45,2% при 28ºC.

Из всех комаров Cх. p. f. molestus, в которых был обнаружен вирус, его концентрацию можно было определить только у 3 насекомых, содержащихся при 22ºC, и у 15, которые инкубировались при 28ºC. У остальных экземпляров ВЗН детектировали только молекулярно-генетическим методом.

Средний титр ВЗН в слюнных железах 3 самок, развивающихся при 22ºC, составил 1,3 × 10² БОЕ/мл, при 28ºC — 5,0 × 10⁴ БОЕ/мл (погрешность ± 0,005 × 10³ БОЕ/мл).

Обсуждение

В настоящем исследовании установлено отсутствие вируса в слюнных железах у заражённых ВЗН комаров при их развитии при температуре воздуха 20ºC. В образцах слюны самок насекомых, содержащихся при 22ºC, вирус обнаруживался, что указывает на возможность его трансмиссивной передачи. Вероятно, нижней границей температуры, при которой Cх. p. f. molestus становится компетентным переносчиком вируса, является 22ºC. Аналогичные результаты были представлены в работе A.J. Folly и соавт. по изучению условий, ограничивающих заражение и системную диссеминацию вируса японского энцефалита у комаров Cx. pipiens [10]. Однако возможно, что при таких условиях насекомым требовался более длительный период для накопления ВЗН. Так, в ряде исследований показано, что при относительно низких температурах инкубационный период увеличивается до 15–22 дней в зависимости от конкретной комбинации вида комара и штамма ВЗН [11, 12].

Согласно данным литературы, повышение температуры среды обитания насекомых приводит к увеличению скорости репликации вируса, сокращению инкубационного периода и быстрому формированию высокой концентрации патогена в слюнных железах насекомых [13]. В нашей работе средний титр ВЗН в слюнных железах 3 самок, развивающихся при 28ºC, составил 5,0 × 10⁴ БОЕ/мл, что говорит не только о пероральном заражении личинок, но и о высокой скорости репликации патогена, т.к. исходный титр заражения ВЗН культуральной среды с клетками С6/36 был на порядок ниже (1 × 10³ БОЕ/мл).

Таким образом, температура среды обитания является одним из ключевых факторов, ограничивающих репликацию и концентрацию ВЗН в слюнных железах комаров Cх. p. f. molestus.

¹ СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».