Assessment of neutrophil degranulation intensity and changes in neutrophil phenotype by FCᵧRIIIB expression level in blood of patients with COVID-19 and convalescents

Full Text

Введение

Новая коронавирусная инфекция COVID-19 (СoronaVirus Disease 2019), вызываемая РНК-содержащим вирусом SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome СoronaVirus 2), oказалась серьёзным вызовом для здравоохранения вследствие недостаточной изученности молекулярных механизмов её патогенеза. Полноценное понимание патофизиологических механизмов поражения при СОVID-19 сердечно-сосудистой системы на сегодняшний день не сформировано [1]. До конца не ясно, почему критически тяжёлая форма COVID-19 c грубыми нарушениями гемостаза, проявляющимися в виде диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови и острого респираторного дистресссиндрома, развивается в организме лишь у 5% пациентов, заражённых SARS-CoV-2 [2]. Мало изучен относительный вклад различных типов клеток иммунной системы в развитие характерных для COVID-19 инфекционных осложнений, и прежде всего это касается нейтрофильных гранулоцитов (НГ) — самой многочисленной и мобильной популяции лейкоцитов крови человека [3][4].

Повышенный интерес к изучению роли НГ в иммунои патогенезе СОVID-19 исследователи стали проявлять c конца 2020 г., что объясняют установлением способности SARS-CoV-2 оказывать на нейтрофилы прямое стимулирующее воздействие, запускающее в условиях in vitro процесс аутолизиса этих клеток с образованием ДНК-сетей нейтрофильных внеклеточных ловушек (Neutrophil Extracellular Traps — NETs) [5][6]. Эту способность подтверждают результаты многочисленных клинических исследований, и, согласно современной гипотезе, нетоз (NETosis) может играть в патогенезе новой коронавирусной инфекции ключевую роль [2].

По мнению российских специалистов, повышенное содержание NETs в мазках крови, окрашенных по Романовскому–Гимзе (более 16%), может служить критерием негативного прогноза течения COVID-19 и риска летального исхода [7]. Для быстрой детекции NETs, количественной оценки интенсивности дегрануляции нейтрофилов и характеристики изменённого пронетотического фенотипа этих клеток за рубежом начинают применять объективные проточно-цитометрические методы исследования лейкоцитов в микрообъёмах цельной крови пациентов. Эти методы не требуют разделения популяций лейкоцитов в градиенте плотности и позволяют быстро проводить иммунофенотипирование в суммарной лейкоцитарной популяции как лимфоцитов, так и гранулоцитов [8–10].

C помощью проточной цитометрии недавно установлено, что в крови пациентов с диагнозом COVID-19 появляется особая специфическая популяция нейтрофилов низкой плотности (Low Density Neutrophils — LDNs) со сниженной степенью гранулярности и сниженным уровнем экспрессии на клетку FcᵧRIIIb (CD16). Доля таких клеток (СD16^INT-LDNs), характеризующихся гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (интерлейкина (ИЛ)-6, ИЛ-8, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α)) и лейкоцитарных протеиназ, а также склонностью к спонтанному формированию NETs, нарастала в крови при негативном прогнозе COVID-19, достигая максимума перед смертью больного. При благоприятном прогнозе относительное содержание СD16^INT-LDNs в процессе терапии в крови снижалось. У реконвалесцентов клетки данной популяции присутствовали в крови в различном количестве [4], но причины этих различий не изучены. Цель настоящей работы — сравнить интенсивность дегрануляции нейтрофилов и экспрессию ими FcᵧRIIIb в крови больных COVID-19 и реконвалесцентов.

Материалы и методы

Оценку степени гранулярности лейкоцитов и их иммунофенотипирование в крови пациентов с диагнозом COVID-19, подтверждённым выявлением РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР, проводили летом 2020 г., в период 1-й волны эпидемии COVID-19 в Саратовской области.

Клинический материал (кровь) поступал в пробирках с гепарином из профильных медицинских организаций г. Саратова и г. Энгельса в течение 3 ч. Забор материала производили на основании письменного согласия пациентов на участие в исследовании, проводимом в рамках плановой научной тематики учреждения, одобренной локальным этическим комитетом РосНИПЧИ «Микроб».

Прогрессирование болезни до альвеолярной стадии с развитием индуцированной SARS-CoV-2пневмонии подтверждалось c помощью компьютерной томографии (КТ) и/или обзорной рентгенографии органов грудной клетки. У 34 (85%) из 40 обследуемых пациентов мужского (30%) и женского (70%) пола в возрасте 17–92 года (медиана 60 [минимум–максимум — 51–71]) с острым течением заболевания зарегистрированы КТ-признаки поражения лёгких различной степени (КТ1–КТ4). У пациентов из группы II доля лиц с показателями КТ2, КТ3 и КТ4 составляла 52,9, 41,2 и 5,9% соответственно. Среди больных из группы III доля лиц с показателями КТ1 и КТ2 составляла 76,5 и 23,5% соответственно. У реконвалесцентов (33 человека, 24% мужчин и 76% женщин в возрасте 30–65 лет (52 [46–58]) анализировали результаты КТ, полученные в острый период болезни. Документальное подтверждение проведённого КТ-исследования было представлено 19 (57,6%) добровольцами. Если у ранее перенёсших COVID-19 (группа V) в момент госпитализации в стационар доля лиц с КТ2–КТ3 составляла 53,8%, то среди пациентов, получавших амбулаторную помощь (группа VI), лишь у 6 добровольцев по результатам КТ установлены поражения лёгких 1-й и 2-й степени.

Иммунофенотипирование лейкоцитов проводили в микрообъёмах цельной крови с помощью процедуры Lyse/No-Wash («BD Bioscience»), исключающей потерю клеток и клеточного дебриса при окраске образцов флюоресцирующими реагентами [12][13]. Использовали два четырехцветных реагента меченых моноклональных антител Cyto-Stat CD45-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3-PC5 и CytoStat CD45-FITC, CD56-РЕ, CD19-ECD, CD3-PC5 («Bеckman Coulter») для быстрого определения в крови методом проточной цитометрии относительного содержания Т-лимфоцитов (СD45⁺CD3⁺CD19^–), B-лимфоцитов (СD45⁺CD3^–CD19⁺), Т-лимфоцитовхелперов (СD45⁺CD3⁺CD4⁺), цитотоксических Т-клеток (СD45⁺CD3⁺CD8⁺), NK-клеток (СD45⁺CD3^– CD56⁺) и NKT-клеток (СD45⁺CD3⁺CD56⁺). Индивидуальные значения иммунорегуляторных индексов вычисляли как отношение числа хелперов (индукторов) к числу цитотоксических Т-клеток (супрессоров). Повреждённые лейкоциты идентифицировали и подсчитывали в крови как клеточный дебрис — объекты с низким уровнем экспрессии на клетку общего лейкоцитарного антигена CD45 [13].

В гейте гранулоцитов крови с помощью одноцветного реагента CD16-FITC («Bеckman Coulter») идентифицировали нейтрофилы (СD16⁺-гранулоциты) и устанавливали долю НГ в суммарной гранулоцитарной популяции. Определяли средний уровень экспрессии FcᵧRIIIb (CD16) на поверхности нейтрофилов (Mean Fluorescence Intensity — MFI, в условных единицах — каналах цитометра), а также оценивали неоднородность (CV, %) отдельных клеток по данному параметру [4][14]. Степень гранулярности НГ определяли в условных единицах интенсивности бокового светорассеяния (Mean Side Scatter Intensity — MSSI) [3]. Дегрануляцию этих клеток в крови каждого обследуемого оценивали (в %) по отношению к среднему значению гранулярности (М) в контроле [15].

Для измерения интенсивности светорассеяния и иммунофлюоресценции отдельных клеток в потоке использовали проточный цитофлюориметр «DakoCytomation» с программным обеспечением «Summit v.4.3 Built 2445» [14]. Присутствие в исследуемых образцах цельной крови нейтрофилов, находящихся на стадии аутолизиса (нетоза), подтверждали результатами микроскопической детекции NETs в мазках крови («Olympus CX41»), окрашенных по Романовскому–Гимзе в соответствии с методикой [7]. Спонтанную и индуцированную конканавалином А продукцию цитокинов клетками крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов для детекции интерферона-γ (ИФН-γ), ФНО-α (ЗАО «Вектор-Бест») и ИЛ-17A («eBioscience»). Результаты учитывали на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Lazurit» («Dynex Technologies») при длине волны 450 нм [16].

Полученные данные статистически обрабатывали с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica 10.0» («StatSoft Inc.»). В исследуемых группах данные представляли в виде медианы (Me) и квартильных отклонений (Q₂₅–Q₇₅). Для расчёта межгрупповых ассоциаций использовали U-критерий Манна–Уитни. Связи между показателями оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Значение р < 0,05 считали статистически значимым.

Результаты

У пациентов с COVID-19 в острый период заболевания и в период реконвалесценции доля НГ в суммарной популяции гранулоцитов крови была выше, чем у относительно здоровых доноров. При этом у больных и перенёсших COVID-19 регистрировали снижение гранулярности этих клеток (дегрануляция), степень выраженности которой была максимальной в группе II — у пациентов на фоне пневмонии с дыхательной недостаточностью (табл. 2).

 

На рис. 1 представлены частотные распределения отдельных лейкоцитов по степени гранулярности и уровню экспрессии клетками общего специфического лейкоцитарного антигена (CD45), наглядно иллюстрирующие факт 48% дегрануляции нейтрофилов в крови одного из пациентов группы II. Кроме того, на рис. 1 хорошо видно, что в периферической крови больного COVID-19 содержится в 2,6 раза больше клеточного дебриса, чем у здоровых доноров. Визуальный микроскопический анализ мазков крови на присутствие NETs подтвердил известный факт активации в крови больных COVID-19 процесса аутолизиса НГ (нетоза).

У больных (в группах II, III, IV) и реконвалесцентов, относящихся к группе V, интенсивность дегрануляции нейтрофилов составила в сравнении с показателями у здоровых доноров в среднем 48,8, 28,1, 23,9 и 18,7% соответственно. Достоверные изменения по показателю гранулярности, а также по содержанию в крови клеточного дебриса частично сохранялись в крови реконвалесцентов группы V до 3 мес после перенесённого заболевания. У пациентов группы II интенсивность лейкоцитолиза в крови была в 1,8 раза выше, чем у лиц группы III, при отсутствии сдвигов по данному параметру у пациентов группы I (табл. 2). Сравнение данных в исследуемых группах выявило сильную обратную корреляционную связь между индивидуальными показателями сатурации (SpO₂) и интенсивности дегрануляции нейтрофилов периферической крови (r = –0,97; p = 0,00001), а также сильную прямую корреляцию между ЧСС и содержанием в крови клеточного дебриса (r = 0,8; p = 0,00016).

Средний уровень экспрессии FcᵧRIIIb (СD16) на поверхности НГ больных COVID-19 на фоне пневмонии с признаками дыхательной недостаточности (группа II) был в 3 раза ниже нормы. В периферической крови пациентов с пневмонией (группы II и III) появлялись НГ как с низким (CD16^LOW), так и, преимущественно, с промежуточным значением данного параметра (CD16^INT), которые отсутствовали в образцах цельной крови здоровых доноров группы I (рис. 2). В крови реконвалесцентов нейтрофилы с фенотипом CD16^INT присутствовали, но в сравнительно небольшом количестве. В результате степень неоднородности НГ у больных и ранее перенёсших COVID-19 пациентов различалась по уровню экспрессии CD16 на клетку (табл. 2), что регистрировали в виде различий в значениях коэффициентов вариации гистограмм, представленных в качестве примера на рис. 2. Между индивидуальными значениями CV и ЧДД была выявлена сильная прямая корреляционная зависимость (r = 0,85; p = 0,00001).

Отмечали подавление индуцированной секреции ИФН-γ клетками крови больных COVID-19, но не реконвалесцентов. Спонтанная продукция ФНО-α в кровь пациентов с тяжёлой формой пневмонии была выше, чем в кровь здоровых доноров и лиц групп III и IV. Однако после неспецифической Т-клеточной стимуляции этот провоспалительный цитокин присутствовал в крови больных COVID-19 и реконвалесцентов в меньшем количестве, чем в крови здоровых доноров. У всех больных, в отличие от реконвалесцентов, был зарегистрирован повышенный уровень индуцированной секреции клетками крови IL-17A (табл. 3).

 

Изменениям в нейтрофилах крови больных COVID-19 и реконвалесцентов, а также сдвигам в уровне секреции цитокинов сопутствовали изменения в относительном содержании некоторых основных субпопуляций лимфоцитов (табл. 4): снижалась доля Т-хелперов в группе II и повышалось относительное содержание цитотоксических Т-клеток в группе III; снижалась доля В-клеток в группах II, III и V, а также NK-клеток в группах II и III.

 

Обсуждение

Экспериментальные данные, полученные при выполнении настоящей работы, согласуются с современными представлениями о роли индуцируемой SARS-CoV-2 секреторной азурофильной дегрануляции нейтрофилов в патогенезе COVID-19 [3][5]. При новой коронавирусной инфекции чрезмерная дегрануляция НГ, сопутствующая интенсивному нетозу, нарушает регуляцию внеклеточной активности лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) её плазменным ингибитором α₁-антитрипсином (ААТ) [2][10]. Выраженный дисбаланс в системе ЛЭ–ААТ, характерный для всех пациентов с тяжёлой формой течения COVID-19 [17], приводит к развитию в организме «протеолитического шторма», тесно связанного с «цитокиновым штормом», и, как следствие, к интенсивному повреждению эндотелия сосудов, очень быстрому разрушению эластина лёгочной ткани и деградации ключевых белков плазмы крови, ответственных за регуляцию процесса коагуляции [18].

Поэтому мониторинг интенсивности дегрануляции нейтрофилов в крови, а также в назальной и лаважной жидкостях больных COVID-19 является актуальной медицинской проблемой, решаемой в настоящее время как с помощью биохимических методов определения внеклеточной активности ЛЭ [17][19], так и на основе альтернативных проточно-цитометрических методов оценки дегрануляции, обеспечивающих получение необходимой информации без использования длительного и трудоёмкого биохимического анализа [3][10]. В наших исследованиях применялся способ оценки дегрануляции НГ по интенсивности бокового светорассеяния, который даёт результаты, эквивалентные биохимическому анализу по уровню высвобождаемой из гранул активности ЛЭ [15], а также другому известному цитометрическому способу оценки данного показателя по экспрессии CD63 на клеточной поверхности [3].

Активность ЛЭ в плазме крови нами не определялась, но на основании выводов ранее проведённых L.A. Sklar и соавт. сравнительных цитометрических и биохимических исследований [15], а также анализа имеющихся литературных данных [20] причину нарушения дыхательной функции лёгких и тахикардию у пациентов из группы II можно объяснить дисбалансом в системе ЛЭ–ААТ. Чем выше интенсивность дегрануляции НГ и, как следствие, концентрация ЛЭ в плазме, тем выше вероятность развития при COVID-19 тяжёлых инфекционных осложнений, приводящих к летальному исходу [10][17]. Причём вероятность эта резко увеличивается при врождённом дефиците ААТ, когда концентрация ингибитора ЛЭ в плазме в 10 раз ниже нормы. Носителей такой врождённой патологии в США и странах Европы около 5%, что, видимо, неслучайно совпадает с относительным количеством зарегистрированных в этих странах случаев развития критически тяжелой формы COVID-19 [21]. У пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом и синдромом диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови, у которых на фоне гипоксии развивалась множественная недостаточность органов, концентрация ЛЭ в крови более 593 пг/мл, что в 12 раз превышает значение данного показателя, характерное для здоровых доноров [10].

Наличие в аминокислотной последовательности S-белка SARS-CoV-2 специфических сайтов расщепления сериновыми лейкоцитарными протеиназами (ЛЭ и протеиназой 3) является особенностью возбудителя COVID-19, отличающей его от SARS-CoV [22]. Высокую скорость распространения наиболее опасных для людей штаммов SARSCoV2 объясняют повышенной чувствительностью их S-белка к расщеплению ЛЭ на этапе проникновения вируса в клетки организма-хозяина [23]. Поэтому регистрация интенсивной дегрануляции НГ в крови пациентов с диагнозом COVID-19 может быть аргументом в пользу выбора стратегии лечения коронавирусной инфекции, основанной на использовании препаратов ингибитора ААТ [24][25] и других ингибиторов ЛЭ [2][10][18]. При решении актуальной проблемы комплексной кардиологической и респираторной реабилитации реконвалесцентов [11] результаты определения и сравнительного анализа индивидуальных показателей интенсивности дегрануляции могут быть использованы для прогнозирования постинфекционных осложнений.

Неоднородность нейтрофилов крови больных COVID-19 по уровню экспрессии FcᵧRIIIb (СD16) на клетку некоторые исследователи объясняют миграцией в кровяное русло незрелых форм НГ (клеток с фенотипом СD16LOW) из костномозгового резерва [8]. Однако результаты более поздних исследований S. Morrissay и соавт. [4], а также наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в крови пациентов с диагнозом COVID-19, наряду с клетками, имеющими фенотип СD16^LOW, циркулируют преимущественно нейтрофилы с фенотипом CD16^INT. Согласно S. Morrissay и соавт., это функционально зрелые НГ, активируемые SARS-CoV-2 в кровяном русле, которые относятся к особой провоспалительной (пронетотической) популяции LDNs [4]. Установлено, что CD16^INT-LDNs, присутствующие как в периферической крови, так и в лаважной жидкости пациентов с тяжёлым и среднетяжёлым течением COVID-19, играют существенную роль в развитии системного воспаления и коагулопатии.

По данным Z. Paraskova и соавт., активированные нейтрофилы больных COVID-19 продуцируют в плазму крови больше молекул ФНО-α и ИЛ-6, чем мононуклеары, и являются, возможно, основным источником этих двух цитокинов при «цитокиновом шторме» [3]. В пользу предположения чешских учёных свидетельствует повышенная спонтанная продукция ФНО-α в кровь пациентов из группы II, зарегистрированная в настоящей работе на фоне повышенной доли в крови НГ и существенно сниженного относительного количества Т-лимфоцитов-хелперов. Кроме того, результаты нашей работы согласуются с хорошо известным фактом сниженной продукции ИФН-γ Т-клетками больных COVID-19 [26][27]. При стимуляции Т-лимфоцитов в крови пациентов с ковидной пневмонией повышался в условиях in vitro уровень продукции в плазму ИЛ-17, а не ИФН-γ, что подтверждают выводы работы S. De Biasi и соавт. [28].

Рецептор FcᵧRIIIb выполняет на поверхности НГ крови человека важную физиологическую функцию распознавания IgG в составе иммунных комплексов антиген–антитело и является, как известно, молекулярным триггером нетоза [29] при сепсисе и системных аутоиммунных заболеваниях, связанных с воспалением сосудов и тромботическими осложнениями (васкулиты, болезнь Кавасаки, фосфолипидный синдром, красная волчанка и др.) [30–32]. В патогенезе таких болезней существенную роль играют аутоантитела к продуктам распада нейтрофилов, входящим в состав NETs [2], которые присутствуют в крови больных COVID-19 и стимулируют процесс образования тромбов в сосудах различных органов путём активации аутолизиса НГ и секреции в плазму ДНК-сетей NETs [33]. Нетоз запускается, вероятно, через рецептор FcᵧRIIIb, т.к. склонность к аутолизису циркулирующих в крови клеток популяции CD16^INT-LDNs на сегодняшний день при COVID-19 достоверно установлена и коррелирует с гиперкоагуляцией [4]. При наличии в организме переболевших COVID-19 стимулирующих нетоз аутоантител повышается вероятность развития постинфекционных осложнений, связанных с нарушением регуляции процесса внутрисосудистой коагуляции [2], и литературные данные подтверждают распространённость таких нарушений среди реконвалесцентов [11].

Сложность идентификации и изучения популяции LDNs, появляющейся в крови пациентов с жизненно опасными инфекционными осложнениями, определяется тем, что морфологически LDNs мало отличаются от мононуклеаров. При градиентном центрифугировании лейкоцитов крови эти клетки попадают не во фракцию, где должны аккумулироваться нейтрофилы, а во фракцию лимфоцитов и моноцитов более низкой плотности [30][34].

Иммунофенотипирование лейкоцитов в образцах цельной крови пациентов решает эту проблему путём идентификации и дифференцирования клеток популяции LDNs по их пронетотическому фенотипу CD16INT. Однако в работах зарубежных исследователей [4][30] для этого применялся протокол окраски, согласно которому после процедуры лизиса эритроцитов в FACS Lysing Solution («ВD Bioscience ») лейкоциты осаждались из лизирующего раствора центрифугированием, чтобы отделить целые неповреждённые клетки от клеточного дебриса. На проточном цитометре исследовались лейкоциты, ресуспендированные в фосфатно-солевом буфере. В таких условиях исключалась возможность детекции в крови нейтрофилов, находящихся на стадии аутолизиса (нетоза), несмотря на то что факт повышенного содержания NETs в крови больных COVID-19 в настоящее время установлен и имеет большое значение с точки зрения прогнозирования исхода инфекционного процесса [7].

В нашей работе применялся другой протокол окраски лейкоцитов в образцах цельной крови человека (Lyse/No-Wash), согласно которому окрашенные реагентами лейкоциты не осаждаются из FACS Lysing Solution центрифугированием, а исследуются на цитометре непосредственно в этом растворе, разработанном для оптимального лизиса в крови только эритроцитов с одновременной фиксацией лейкоцитов присутствующим в FACS Lysing Solution формальдегидом. Применение Lyse/No-Washпротокола позволило регистрировать повышенное содержание клеточного дебриса в крови больных COVID-19 и реконвалесцентов, связанное, по данным Д.В. Кассиной и соавт. [7] и Y. Zuo и соавт. [33], с активацией нетоза в кровеносных сосудах. Результаты сравнительных клинических испытаний двух протоколов свидетельствуют о том, что они не различаются по чувствительности и разрешающей способности [13]. Однако в случае выбранного нами протокола выше производительность и информативность анализа (с точки зрения возможности контроля показателей лейкоцитолиза и цитотоксичности), а также полностью исключаются любые клеточные потери, что важно учитывать при стандартизации цитологических исследований в клинических условиях.

Заключение

Характер изменения изученных в работе показателей у пациентов с COVID-19 в острый период болезни и в период реконвалесценции подтверждает возможный механизм развития осложнений при этом заболевании, связанный с нарушением баланса между активностью высвобождаемой из гранул НГ эластазы и её плазменным ингибитором α₁-антитрипсином.

About the authors

A. L. Kravtsov

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Author for correspondence.
Email: kravzov195723@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9016-6578

Aleksandr L. Kravtsov — D. Sci. (Biol.), leading researcher,
Department of immunology

Saratov

Россия

S. A. Bugorkova

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7548-4845

Svetlana A. Bugorkova — D. Sci. (Med.), Deputy head, Department
of immunology

Saratov

Россия

S. N. Klyueva

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5550-6063

Svetlana N. Klyueva — Cand. Sci. (Biol.), Researcher, Department
of immunology

Saratov

Россия

A. Yu. Goncharova

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9994-7936

Anastasia Y. Goncharova — Cand. Sci. (Med.), Researcher, Department of immunology

Saratov

Россия

V. A. Kozhevnikov

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7267-7027

Vitaly A. Kozhevnikov — junior researcher, Department of immunology

Saratov

Россия

E. A. Chumachkova

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6866-0169

Elena A. Chumachkova — Researcher, Department of epidemiology

Saratov

Россия

S. A. Portenko

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8334-9173

Svetlana A. Portenko — Cand. Sci. (Biol.), Head, Department of diagnostics of infectious diseases

Saratov

Россия

S. A. Scherbakova

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1143-4069

Svetlana A. Scherbakova — D. Sci. (Biol.), Deputy director for scientific and anti-epidemic work

Saratov

Россия

References

Supplementary files