Characterization of virulent Escherichia coli strains isolated from patients with urological infection

Full Text

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) — широко распространённые бактериальные инфекции, ежегодно поражающие в мире 150 млн человек [1]. Доминирующий возбудитель ИМП — уропатогенные Escherichia coli (uropathogenic Escherichia coli — UPEC), которые вызывают 90% внегоспитальных и 50% госпитальных урологических инфекций [2]. В России в 2018 г. E. coli были ведущим возбудителем ИМП в разных субпопуляциях пациентов — от 71 до 80% [3]. Около 50–60% взрослых женщин имеют хотя бы один эпизод ИМП в течение жизни [4]. UPEC-инфекции зачастую вызваны множественно резистентными E. coli, в частности, глобальным доминирующим клоном UPEC сиквенс-типа ST-131, несущим β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) [5]. У продуцентов БЛРС были идентифицированы гены bla_CTX-M (до 100% штаммов), bla_SHV (~63%), bla_TEM (~11%) [6]. Фенотип множественной резистентности ассоциирован с наличием также генетических детерминант, определяющих устойчивость к аминогликозидам (aac, aad, ant, aph), сульфаниламидам (dfr) и фторхинолонам (мутации в хромосомном гене gyrA), а также наличием интегронов класса 1 [7]. К генетическим детерминантам, ассоциированным с проявлением патогенных свойств UPEC, относятся гены адгезинов, токсинов, рецепторов сидерофоров, факторов противодействия иммунной системе макроорганизма, транспортёров капсул 2-й и 3-й групп, колицина V и островов патогенности [6]. В России все штаммы UPEC, выделенные в 2017–2018 гг., несли гены, ответственные за синтез сидерофоров (irp2, iuc, iroN), устойчивость и персистенцию (ompT) и факторы адгезии (fimH, iha) [8].

Штаммы UPEC характеризуются высокой степенью генетической гетерогенности, поэтому важное эпидемиологическое значение имеет молекулярно-генетическая характеристика, позволяющая определить принадлежность штаммов к филогенетическим группам (A, B1, B2, D, E и F), О-группам и сиквенс-типам. Штаммы UPEC, выделенные в разных регионах мира, преимущественно относятся к филогруппам B2 и D, серогруппам O8, O15, O25 и O75, сиквенс-типам ST131, ST69, ST73, ST10, ST127 и ST140 [9–11]. В России описаны штаммы UPEC филогенетических групп A, B1, B2, D, E и F [10][12] и серогрупп О1, О2, О6, О7, О8, О16, О25 и О75 [13, 14]. Публикации о сиквенс-типах штаммов UPEC, выделенных в России, отсутствуют.

Для определения вирулентности штаммов UPEC в последнее время широко используется хорошо охарактеризованная модель личинок большой восковой моли Galleria mellonella [5][15]. Адекватность использования данной модели обеспечивается наличием у личинок элементов иммунной системы (гемоциты гемолимфы, антимикробные пептиды и факторы опсонизации), аналогичных элементам иммунной системы человека [16]. Наибольшей вирулентностью для личинок G. mellonella обладали штаммы UPEC наиболее распространённых в мире генетических линий: ST69, ST73 и ST127, а также серогрупп О2 и О6 [15].

Целью данной работы была характеристика штаммов E. coli, выделенных от пациентов с внегоспитальными ИМП в ходе пилотного одноцентрового исследования в Ярославле, в том числе определение фенотипов и генотипов антибиотикорезистентности, идентификация генов вирулентности, оценка уровней вирулентности на модели личинок G. mellonella, определение принадлежности к филогенетическим группам, О-серогруппам и сиквенс-типам.

Материалы и методы

Биоэтические требования

Использованные в данном исследовании материалы не содержат персональных данных пациентов. В соответствии с требованиями Биоэтического комитета РФ каждый пациент подписывал информированное согласие при поступлении в лечебное учреждение на проведение лабораторных исследований.

Штаммы, условия культивирования и хранения

Штаммы E. coli (n = 20) выделены из образцов мочи от пациентов урологического отделения Инфекционной клинической больницы № 1 г. Ярославля при поступлении в лечебное учреждение, в рамках пилотного одноцентрового клинического исследования в декабре 2016 г. – январе 2017 г. Культуры E. coli выращивали на питательной среде ГРМ 1 (ФБУН ГНЦ ПМБ) в аэробных условиях при 37°C. Хранение культур осуществляли в 20% растворе глицерина при –70°C.

Видовая идентификация

Видовую идентификацию бактерий осуществляли с помощью высевов на дифференциально-диагностические питательные среды «Агар Эндо-ГРМ», «Агар Клиглера-ГРМ», «Железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной» и «Ацетатный агар» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия), с последующим подтверждением на приборе «MALDITOF Biotyper» («Bruker»).

Чувствительность к антимикробным препаратам

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) 17 антимикробных препаратов (АМП) 6 функциональных классов: β-лактамов (ампициллин, ампициллин/сульбактам, амоксициллин/ клавуланат, цефуроксим, цефотаксим, цефтазидим, азтреонам и меропенем), фторхинолонов (ципрофлоксацин, левофлоксацин и норфлоксацин), аминогликозидов (гентамицин), фосфомицинов (фосфомицин), нитрофуранов (фуразолидон, фурацилин и нитрофурантоин) и полимиксинов (колистин) («Sigma-Aldrich») определяли методом микроразведений в бульоне в соответствии с рекомендациями EUCAST Breakpoint tables v 9.0¹. В качестве стандартного использовали штамм E. coli ATCC25922, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Категорию резистентности штамма определяли в соответствии с [17].

Детекция генов антибиотикорезистентности и вирулентности

Гены, кодирующие β-лактамазы bla_TEM, bla_SHV, bla_CTX-M, bla_OXA-48 и bla_NDM, а также интегроны классов 1 и 2 выявляли методом ПЦР со специфичными праймерами [18]. Острова патогенности UPEC I₅₃₆, II₅₃₆, III₅₃₆, IV₅₃₆, I_J96, II_J96, I_CFT073 и II_CFT073 и гены, кодирующие факторы вирулентности UPEC, — фимбрии типа 1 fimH, P фимбрии papGI, papGII, papGIII, S фимбрии sfaS, F1C фимбрии focG, AFA/Dr адгезин afa/draBC, основной белок курли волокон csgA, гемолизин hlyA, цитотоксический некротический фактор cnf1, уропатогенный специфический белок usp, рецепторы сидерофоров сальмохелина iroN, иерсиниабактина fyuA и аэробактина iutA, протеазу внешней мембраны ompT, липопротеин наружной мембраны traT, транспортёры капсулы 2-го типа kpsMTII и 3-го типа kpsMTIII, основной белок колицина V cvaC — определяли методом ПЦР со специфичными праймерами [8][19].

Определение вирулентности штаммов

Идентификация филогенетических групп

Принадлежность штаммов UPEC к филогенетическим группам E. coli A, B1, B2, D, E и F определяли с помощью детекции генов, кодирующих геминовый рецептор внешней мембраны chuA, гипотетический протеин yjaA, анкирин-повторяющий белок А arpA, триптофансинтетазу α-SU trpA и эстеразу TspE4.C2, согласно [21].

Определение серологических О-групп

Серологические О-группы определяли методом ПЦР со специфичными праймерами на гены кластера липополисахаридов wzx_О1, wzx_О4, wzx_О16, wzx_О18, wzy_О2, wzy_О6, wzy_О15, wzy_О25, wzy_О75, wzy_О11, wzt_О9 и wzt_О89 [22].

Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ)

Сиквенс-типы штаммов E. coli определяли с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования 7 генов «домашнего хозяйства»: аденилаткиназы adk, фумаратгидратазы fumC, ДНК-гиразы gyrB, изоцитратдегидрогеназы icd, малатдегидрогеназы mdh, аденил-сукцинатдегидрогеназы purA и АТФ/ ГТФ-связывающего мотива гена recA с последующим определением аллельного профиля на сайте Уорикского университета (Великобритания)² [23].

Секвенирование нуклеотидных последовательностей

Последовательности ПЦР-продуктов секвенировали в ООО «СИНТОЛ» на генетическом анализаторе «ABI Prizm 3130xl» с использованием наборов для секвенирования «BigDye v3.1» и анализировали с помощью программ «Chromas»³ («Technelysium»), «Vector NTI 9» («Life Technologies») и BLAST⁴.

Полногеномное секвенирование

Полногеномное секвенирование штаммов E. coli проводили с использованием наборов «Nextera DNA Library Preparation Kit» («Illumina») и «MiSeq Reagent Kits v3» («Illumina») на платформе «Illumina MiSeq» согласно инструкции производителя. Единичные прочтения собирали в контиги с использованием программного обеспечения «SPAdes 3.9.0» [24]. Аннотировали собранные геномы с помощью сервера NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline [25]. Анализ полногеномных последовательностей проводили с использованием инструментов Центра геномной эпидемиологии⁵.

Филогенетический анализ

Филогенетический анализ штаммов E. coli проводили с использованием ресурсов NCBI «Blastn» и «Blast Tree View»⁶ на основании сравнения искусственно собранных последовательностей аллельных профилей генов МЛСТ.

Статистический анализ

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета «Microsoft Office 2010» и программы «SPSS Statistica 17.0» («IBM»). Проверку распределения на нормальность осуществляли с помощью критерия Колмогорова–Смирнова, нормальным считалось распределение при двусторонней асимптоматической значимости более 0,05. Различие сформированных групп вирулентности подтверждали методом двухвыборочного t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Различия считали значимыми при величине коэффициента достоверности p < 0,01.

Депонирование нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank

В базе данных GenBank размещены 9 полногеномных последовательностей штаммов UPEC: SERS01000000, SERT01000000, SERU00000000, SERV00000000, JACSYM000000000, SERW01000000, SERX00000000, JACSYL000000000, SERY00000000.

Результаты

Штаммы

Штаммы E. coli выделены от 20 женщин 23– 84 лет с урологическими диагнозами: хронический цистит (n = 12), инфекция мочевыводящей системы без установленной локализации (n = 3), цистит (n = 2), мочекаменная болезнь (n = 2) и гиперактивный мочевой пузырь (n = 1) (табл. 1).

Фенотипы и генотипы антибиотикорезистентности

Охарактеризованные штаммы UPEC отнесены к 2 категориям резистентности к АМП: резистентные (n = 11) и множественно резистентные (n = 9). Резистентные штаммы были устойчивы к препаратам 1–2-й функциональных групп: β-лактамам и нитрофуранам. Множественно резистентные штаммы были устойчивы к препаратам трех (β-лактамам, фторхинолонам и нитрофуранам), четырех (β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам и нитрофуранам) и пяти (β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам, полимиксинам и нитрофуранам) функциональных групп. При этом все штаммы были чувствительны к фосфомицину (МПК < 32 мг/л), нитрофурантоину (МПК < 64 мг/л) и меропенему (МПК < 0,5 мг/л).

В изучаемых штаммах UPEC выявлены гены β-лактамаз bla_TEM (n = 10), bla_CTX-M (n = 6), интегразы класса 1 (n = 8) и генные кассеты интегронов класса 1 dfrA17-aadA5 (n = 2), dfrA1 (n = 1) и aacA4-cmlA1 (n = 1). Генов bla_SHV, bla_KPC, bla_OXA-48 и bla_NDM не обнаружено. Шесть штаммов не имели детектируемых генов антибиотикорезистентности. Выявлено 5 вариантов сочетаний генетических детерминант резистентности: 1 ген bla_TEM определён у 4 штаммов, 1 ген bla_CTX-M — у 2, сочетание 2 генов bla_TEM+intl1 — у 3, 2 генов bla_CTX-M+intl1 — у 2, набор из 3 генов bla_TEM+bla_CTX-M+intl1 — у 3 штаммов. Генные кассеты интегронов несли детерминанты устойчивости к аминогликозидам aadA5 и aacA4, сульфаниламидам dfrA1 и dfrA17, хлорамфениколу cmlA1. У 5 интегронов генные кассеты отсутствовали (табл. 1).

Генотипы вирулентности штаммов UPEC

В изучаемых штаммах E. coli выявлены гены факторов вирулентности UPEC 7 функциональных групп: адгезинов fimH (n = 20), csgA (n = 20), focG (n = 4), papGII (n = 4), papGIII (n = 4) и sfaS (n = 3); сидерофоров fyuA (n = 15), iroN (n = 11) и iutA (n = 6); токсинов hlyA (n = 7), cnf1 (n = 5) и usp (n = 9); транспортёров капсулы kpsMTII (n = 13); факторов противодействия иммунитету ompT (n = 16) и traT (n = 11); колицина cvaC (n = 1); а также островов патогенности I₅₃₆ (n = 5), II₅₃₆ (n = 4), III₅₃₆ (n = 1), IV₅₃₆ (n = 15), II_J96 (n = 5) и II_CFT073 (n = 9). Гены адгезинов papGI и afa/draBC, транспортёра капсулы 3-го типа kpsMTIII и острова патогенности I_J96 и I_CFT073 в этих штаммах не обнаружены (табл. 2).

В разных штаммах UPEC было выявлено разное количество генов вирулентности — от 2 до 14. Гены адгезинов были идентифицированы во всех изучаемых штаммах, гены сидерофоров — в 18, гены факторов противодействия иммунитету — в 17, гены транспортеров капсулы — в 14, гены токсинов — в 9, ген колицина — в 1, острова патогенности — в 15 штаммах. Анализ сочетания факторов вирулентности разных функциональных групп показал, что 7 штаммов несли все 7 групп, 1 штамм — 6 групп, 4 штамма — 5 групп, 4 штамма — 4 группы, 2 штамма — 3 группы, 2 штамма — 1 группу.

Вирулентность штаммов UPEC для личинок G. mellonella

Рис. 1. Анализ вирулентности штаммов E. coli на модели личинок G. mellonella.
Fig. 1. Analysis of the virulence E. coli strains in the G. mellonella larvae model.

 

О-групповая принадлежность, филогенетические группы и сиквенс-типы штаммов UPEC

В ходе исследования идентифицированы 10 О-групп E. coli: О25 (n = 3), О2 (n = 2), O11 (n = 2), О18 (n = 2), О4 (n = 1), О6 (n = 1), O9 (n = 1), О15 (n = 1), О75 (n = 1) и O89 (n = 1). Для 5 штаммов О-группы не идентифицированы с помощью использованного метода типирования. Определена принадлежность штаммов к филогруппам A (n = 4), B1 (n = 3), B2 (n = 10), E (n = 1) и F (n = 2). Идентифицированы 14 ранее известных сиквенс-типов E. coli: ST14 (n = 1), ST58 (n = 1), ST69 (n = 1), ST-73 (n = 1), ST93 (n = 1), ST127 (n = 1), ST131 (n = 3), ST141 (n = 2), ST165 (n = 1), ST297 (n = 1), ST457 (n = 2), ST537 (n = 1), ST744 (n = 1) и ST1434 (n = 1), а также два новых, ранее не описанных сиквенс-типа ST10102 и ST9239 (табл. 2).

К филогруппе A отнесены штаммы О-групп О18, О89; к филогруппе B1 — О9; к филогруппе B2 — О2, О4, О6, О18, О25, О75; к филогруппе E — О15; к филогруппе F — О11 О-групп. Показано, что 3 штамма О25-группы принадлежат к сиквенс-типу ST131, 2 штамма О11-группы — к сиквенс-типу ST457, два штамма О2-группы — к сиквенс-типу ST141. Два штамма О18-группы отнесены к разным сиквенс-типам (ST14 и ST1434) и разным филогруппам (B2 и A; табл. 2).

Стоит отметить, что серогруппы О4, О6, О9, О11, О75 и О89 в данном исследовании идентифицированы только у высоковирулентных штаммов, а серогруппы О15 и О25 — только у слабовирулентных. Две серогруппы — О2 и О18 — были идентифицированы в группе как высоковирулентных, так и слабовирулентных штаммов. Филогруппы A, B1 и F определены только у высоковирулентных штаммов, в то время как филогруппа B2 — в обеих группах вирулентности. Среди 13 высоковирулентных для личинок G. mellonella штаммов E. coli определены 12 сиквенс-типов, среди 7 слабовирулентных штаммов — 5 сиквенс-типов, сиквенс-тип ST141 был идентифицирован как у 1 высоковирулентного, так и у 1 слабовирулентного штамма (табл. 2).

Филогенетическое дерево

Анализ филогенетического родства сиквенс-типов штаммов UPEC выявил два кластера: кластер I, включающий ST457; и кластер II, объединяющий все остальные сиквенс-типы. Кластер II состоит из двух подкластеров: IIa (ST69) и IIb, который включает в себя две подгруппы: IIb-1 (ST14, ST73, ST127, ST131, ST141, ST537 и ST10102) и IIb-2 (ST58, ST93, ST165, ST297, ST744, ST1434 и ST9239). Расположение изученных штаммов UPEC на филогенетическом дереве сиквенс-типов полностью совпадает с принадлежностью штаммов к филогенетическим группам: в кластер I входят штаммы группы F, в подкластер IIa — E, в подкластер IIb-1 — B2 и в подкластер IIb-2 — A и B1. В кластер I и подгруппу IIb-2 вошли только высоковирулентные для личинок G. mellonella штаммы, в подкластер IIa — один слабовирулентный штамм, в подгруппу IIb-1 — как высоковирулентные, так и слабовирулентные штаммы. Новые сиквенс-типы ST9239 (IIb-1) и ST10102 (IIb-2) филогенетически наиболее близки к сиквенс-типам ST297 и ST73 соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Филогенетическое дерево штаммов UPEC, построенное на основании искусственно собранных нуклеотидных последовательностей генов МЛСТ-профиля.

Точкой обозначены сиквенс-типы высоковирулентных штаммов, звездочкой — новые сиквенс-типы.

Fig. 2. Phylogenetic tree of UPEC strains, built on the basis of artificially assembled nucleotide sequences of MLST-profile genes.

The point denotes the sequence types of highly virulent strains, the asterisk — new sequence types.

 

Интересно отметить, что только штаммы UPEC, относящиеся к филогруппе B2, серогруппам О2, О4, О6, О18, О25, О75 и подгруппе IIb-1 филогенетического дерева, несли гены адгезинов papGII, papGIII, sfaS и focG, гены токсинов hlyA, cnf1, usp и острова патогенности III536, IICFT073, I536, II536, IIJ96 (табл. 2).

Анализ полных геномов штаммов UPEC

Проанализированы 9 полногеномных последовательностей штаммов UPEC, которые характеризовались размерами 4,5–5,4 млн п.н. и ГЦ-составом 51–52%, несущих 4,3–5,2 тыс. генов (табл. 3). В геномах 7 штаммов выявлены генетические детерминанты, определяющие устойчивость к 10 функциональным классам АМП (β-лактамам, аминогликозидам, фениколам, фторхинолонам, полимиксинам, сульфаниламидам, тетрациклинам, макролидам, фосфомицинам и четвертичным аммониевым соединениям). Кроме того, у 8 штаммов идентифицированы гены белка MdfA, обеспечивающего чрезвычайно широкий спектр лекарственной устойчивости (табл. 4). Спектр выявленных генетических детерминант антибиотикорезистентности коррелировал с описанными выше фенотипами устойчивости штаммов к АМП: наличие генов β-лактамаз — с устойчивостью к β-лактамам, генов аминогликозид модифицирующих ферментов — с устойчивостью к аминогликозидам, гена mcr — с устойчивостью к колистину, мутаций в генах gyrA — с устойчивостью к фторхинолонам.

В геномах изучаемых штаммов обнаружены гены, кодирующие группы факторов вирулентности: адгезинов, сидерофоров, противодействия иммунитету макроорганизма, капсулообразования, токсинов, бактериоцинов и др. Отмечено значительное разнообразие геномов по количеству идентифицированных генов вирулентности — от 1 до 35. В геномах штаммов были выявлены до 6 генов адгезинов, до 6 генов сидерофоров, до 4 генов факторов противодействия иммунитету организма-хозяина, до 3 генов капсулообразования, до 5 генов токсинов, до 8 генов бактериоцинов и 1–5 генов других факторов вирулентности (табл. 5).

Обсуждение

Объектом данного исследования являлись штаммы уропатогенных E. coli — ведущего возбудителя ИМП как в России, так и во всём мире [2][3]. Показано, что около половины охарактеризованных нами штаммов UPEC относятся к категории множественно резистентных, устойчивы к АМП 3 и более функциональных классов (β-лактамам, фторхинолонам, нитрофуранам, аминогликозидам, полимиксинам), что согласуется с ранее опубликованными данными [3]. Поскольку все штаммы в нашем исследовании были чувствительны к фосфомицину, нитрофурантоину и меропенему, данные АМП могут рассматриваться в качестве препаратов выбора в клинической практике, что согласуется с данными, полученными для России [3].

Фенотипы множественной лекарственной устойчивости коррелировали с наличием генетических детерминант антибиотикорезистентности: генов β-лактамаз bla_TEM, bla_CTX-M и bla_OXA типов, генов аминогликозид-модифицирующих ферментов aac, aph и aad типов, гена колистин-модифицирующего фермента mcr, мутаций в гене ДНК-гиразы gyrA, обеспечивающих устойчивость к β-лактамам, аминогликозидам, колистину и фторхинолонам соответственно. Аналогичные гены были выявлены в штаммах UPEC в работе [6]. Обращает на себя внимание разнообразие идентифицированных аллелей эпидемически значимого гена БЛРС bla_CTX-M — 14, 15, 27 и 55, обнаруженных в трети изученных штаммов за достаточно короткий промежуток времени исследования у небольшой группы пациентов с внегоспитальными инфекциями. Это согласуется с большим разнообразием аллелей гена bla_CTX-M, описанным в исследовании европейских авторов для госпитальных и внегоспитальных штаммов UPEC [26], а также с увеличением доли БЛРС-продуцирующих штаммов UPEC в России [3]. Необходимо подчеркнуть, что в 2 штаммах идентифицирован ген устойчивости к антибиотику резерва колистину mcr-1.

В геномах изучаемых штаммов UPEC выявлено большое количество и разнообразие генетических детерминант вирулентности. Все штаммы имели гены fimH и csgA, что аналогично данным, описанным в работах других авторов [8][27]. Ген afa/draBC в изученных нами штаммах E. coli не обнаружен, в то время как в работе [27] встречаемость данного гена составляла 15%. В нашем исследовании представленность генов fyuA, iroN и iutA составляла 83, 50 и 45%, что принципиально не отличается от данных других авторов: 78, 36–68 и 67% соответственно [8][27]. Интересно отметить, что гены рецепторов сидерофоров в нашем исследовании чаще встречались в сочетаниях, чем индивидуально: fyuA + iroN (n = 6), fyuA + iutA (n = 3) и fyuA + iroN + iutA (n = 3). Гены факторов противодействия иммунитету макроорганизма ompT и traT были выявлены у большинства штаммов нашего исследования (83 и 61% соответственно), что аналогично другим данным — 75 и 71% соответственно [27]. Наличие генов focG и sfaS и оперона pap в нашем исследовании отмечено у 22, 17 и 44% изучаемых штаммов соответственно, что аналогично данным [8], но отличается от данных в других исследованиях — 50, 26 и 80% соответственно [27]. Ген hlyA в нашем исследовании идентифицирован у 39% штаммов, что примерно соответствует уровню встречаемости (42%) этого гена в исследовании российских авторов [8], но ниже, чем в работе [27] — 76%. Ген cnf1 в нашем исследовании встречался у 28% штаммов, а в работе [27] — у 83% штаммов. Таким образом, в нашем исследовании у подавляющего большинства штаммов присутствовали гены адгезинов, сидерофоров и факторов противодействия иммунной системе.

Фенотипическое проявление вирулентности исследуемых штаммов UPEC изучали на модели личинок G. mellonella, которая широко используется для характеристики бактериальных уропатогенов [15][16]. Показано, что множественно резистентным фенотипом обладали 6 высоковирулентных штаммов из 13, что указывает на вовлечённость в процесс объединения потенциалов вирулентности и антибиотикорезистентности UPEC.

Профили генов вирулентности, выявленные в нашей работе в полных геномах штаммов UPEC, различались у высоко- и слабовирулентных штаммов. Гены lpfA, papA_F12, focC, sfaD, ireA, air, neuC, kpsMII_K1, astA, cma, cvaC, cea, celb, mchB, mchC, mchF, mcmA, eilA, tcpC и epeA встречались только в геномах высоковирулентных штаммов, а гены papA_F43, afaD, ibeA, kpsMII_K5, sat, senB — только в геномах слабовирулентных штаммов.

Важно отметить, что исследованные в нашей работе внегоспитальные штаммы UPEC, как и во всем мире, характеризуются высокой степенью генетической гетерогенности: идентифицированы 3 филогенетические группы, 10 О-групп и 16 сиквенс-типов. По данным литературы, выявленные нами серогруппы О2, О6, О15, О25 и О75 относятся к числу часто встречающихся у UPEC [10][13][14]. Это согласуется также с тем, что в базе данных EnteroBase⁷ на 20.09.2020 серогруппы O2, O4, O6, O18, O25 и О75 были представлены более чем 10 штаммами UPEC каждая, а серогруппы O9, O11, О15 и O89 — менее чем 10 штаммами каждая. Стоит отметить, что штаммы серогруппы О6 охарактеризованы как высоковирулентные для личинок G.mellonella и в нашем исследовании, и в работе [15]. В то же время штаммы О15- и О25-групп были отнесены нами к слабовирулентным для личинок G. mellonella, а штаммы О2- и О18-групп — и к высоковирулентным, и к слабовирулентным штаммам, что не совпадает с результатами исследования [15].

Показано, что штаммы 11 сиквенс-типов, в том числе нового ST-9239, принадлежат к категории высоковирулентных, а 4 сиквенс-типов, в том числе нового ST-10102, — к категории слабовирулентных. Сиквенс-тип ST-131, описанный в нашей работе, характерен для штаммов UPEC во всём мире (65 упоминаний среди UPEC в базе данных EnteroBase на 20.09.2020). Другие характерные для UPEC сиквенс-типы ST69, ST73, ST127, ST14, ST58, ST93, ST141, ST457, ST537 и ST297, описанные в нашем исследовании, также представлены в базе данных EnteroBase (от 1 до 106 упоминаний среди UPEC на 20.09.2020). В нашей работе впервые описаны штаммы E. coli сиквенс-типов ST165, ST744 и ST1434, выделенные от человека с ИМП; ранее эти сиквенс-типы были ассоциированы с другими патогруппами E. coli (согласно базе данных EnteroBase на 20.09.2020). В нашем исследовании штаммы E. coli ST131 обладали слабой вирулентностью для личинок G. mellonella, что совпадает с результатами [15]. Интересно, что все штаммы этого сиквенс-типа в нашем исследовании принадлежали к серогруппе О25, а в упомянутой работе — не только к серогруппе О25, но и к другим серогруппам [15].

Высоко- и слабовирулентные штаммы UPEC подгруппы IIb-1 филогенетического дерева, относящиеся к характерным для UPEC филогруппе B2 и серогруппам О2, О4, О6, О18, О25 и О75, несли ген usp, кодирующий токсин — уропатогенный специфический белок Usp, что согласуется с опубликованными ранее данными о наличии ассоциации гена usp с сиквенс-типами ST131, ST69, ST73 и ST141 [9].

Полученные нами данные о принадлежности штаммов UPEC ST73 серогруппы О6 и ST127 серогруппы О4 к группе высоковирулентных для личинок G. mellonella аналогичны описанным в литературе [15]. В то же время штамм UPEC серогруппы О15 сиквенс-типа ST69 в нашем исследовании отнесён к слабовирулентным, а в работе [15] — к высоковирулентным UPEC. Особое внимание обращают на себя два высоковирулентных для личинок G. mellonella штамма E. coli (O11, ST457), которые характеризовались устойчивостью к резервному антибиотику колистину и несли ген mcr-1. Ранее mcr-1-позитивные штаммы UPEC такого же сиквенс-типа были описаны в Китае [28]. В России этот ген был детектирован ранее в штаммах E. coli сиквенс-типов ST156 и ST359 [29].

Заключение

Описано генетическое разнообразие изученных внегоспитальных штаммов UPEC, относящихся к 3 филогенетическим группам, 10 О-группам и 16 сиквенс-типам и несущих разные наборы генетических детерминант факторов патогенности и антибиотикорезистентности. Все штаммы отнесены к категории резистентных, у половины из них определена множественная лекарственная устойчивость, обусловленная наличием генов устойчивости к β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам и др., что согласуется с общемировой тенденцией распространения антибиотикорезистентности среди внегоспитальных патогенов. Идентифицированы две группы штаммов UPEC по степени вирулентности на модели личинок G. mellonella — высоковирулентные и слабовирулентные, геномы которых существенно отличались по наличию наборов генов адгезинов, сидерофоров, токсинов, факторов противодействия иммунитету макроорганизма, капсулообразования и островов патогенности. Описаны штаммы UPEC, характеризующиеся одновременно высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью во внегоспитальной среде. Дальнейшее накопление данных позволит оценить эпидемиологическую ситуацию по ИМП, дать прогноз её развития в будущем, а также определить оптимальные направления терапии.

About the authors

P. V. Slukin

Author for correspondence.
Email: xopgi@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4976-0145

Pavel V. Slukin - researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

E. I. Astashkin

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3559-9071

Eugeny I. Astashkin - Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

E. M. Aslanyan

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9538-9968

Elena M. Aslanyan - researcher, Disinfectology department

Obolensk

M. G. Ershova

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4691-648X

Marina G. Ershova - Head, Microbiology laboratory

Yaroslavl

E. D. Poletaeva

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7074-6989

Elena D. Poletaeva - bacteriologist, Microbiology laboratory

Yaroslavl

E. A. Svetoch

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3185-1954

Edward A. Svetoch - D. Sci. (Vet.), Professor, chief researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

A. P. Shepelin

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8253-7527

Anatoly P. Shepelin - D. Sci. (Biol.), Deputy director for scientific and industrial Work

Obolensk

N. K. Fursova

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6053-2621

Nadezhda K. Fursova - Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Analysis of the virulence E. coli strains in the G. mellonella larvae model.

Download (18KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Phylogenetic tree of UPEC strains, built on the basis of artificially assembled nucleotide sequences of MLST-profile genes.

Download (17KB)

Indexing metadata