Evaluation of azoximer bromide (polyoxidonium) influence on the adhesive properties of the Yersinia pestis EV NIIEG vaccine strain by atomic force microscopy

T. N. Shchukovskaya; Щуковская Т. Н.; A. Y. Goncharova; Гончарова А. Ю.; S. A. Bugorkova; Бугоркова С. А.; P. S. Erokhin; Ерохин П. С.; O. M. Kudryavtseva; Кудрявцева О. М.

doi:10.36233/0372-9311-93

Evaluation of azoximer bromide (polyoxidonium) influence on the adhesive properties of the Yersinia pestis EV NIIEG vaccine strain by atomic force microscopy

Authors: Shchukovskaya T.N.¹, Goncharova A.Y.¹, Bugorkova S.A.¹, Erokhin P.S.¹, Kudryavtseva O.M.¹
Affiliations:
1. Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»
Issue: Vol 98, No 3 (2021)
Pages: 298-307
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/998
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-93
ID: 998

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. To characterize the influence of azoximer bromide (polyoxidonium, PO) in cultivation conditions on the morpho- and nanomechanical cell surface properties of Y. pestis EV NIIEG vaccine strain and its derivatives Y. pestis КМ218 (pYT–, pYV–, pYP–), Y. pestis КМ216 (pYT–, pYV–, pYP+), Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica by atomic force microsopy (AFM), as well as on the adhesion of cells Y. pestis EV NIIEG to human collagen type IV.

Materials and methods. The measurements were carried out using the Solver P47-PRO probe microscope (NT-MDT, Russia), standard methods of semi-contact AFM and AFM imaging analysis program. The adhesion of Y. pestis EV NIIEG to type IV collagen was determined by the number of cells binding to glass slides covered with human collagen type IV.

Results. The introduction of PO in the cultivation environment caused changes in the morphometric parameters of the cells of Y. pestis EV NIIEG vaccine strain and its isogenic derivatives (increase in volume, flatten ingested (S/H), index I (W/H). These changes were accompanied by the transformation of nanomechanical properties of the cell surface (reducing the root mean square, adhesion force), which countenance was associated with the plasmid profile. The lesser decrease of adhesion force in the absence of changes of the index I was observed in cells Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica with plasmid pYV. In the strain Y. enterocolitica KM383 (pYV–) PO did not induce significant changes in the indicators studied. The introduction of the PO into the cultivation environment decreased the ability of Y. pestis EV cells to bind to human collagen type IV. Modification by PO the adhesive properties of the vaccine strain Y. pestis EV NIIEG was accompanied by an increase in its immunogenicity.

Keywords

Yersinia pestis, azoximer bromide, bacterial cell, atomic force microscopy, morphometric analysis, surface structure

Full Text

Введение

В развитии инфекционного процесса адгезия возбудителя к клеткам-мишеням, компонентам внеклеточного матрикса (ВКМ) играет ключевую роль, во многом определяя его начало, характер и течение [1][2][3]. Способность чумного микроба к адгезии обусловлена поверхностными структурами бактериальной клетки, которые могут быть представлены белками наружной мембраны — белком Ail, активатором плазминогена Pla, аутотранспортными белками различных классов YadB, YadC, Ilp; специализированными органеллами — пилями или фимбриями адгезии, образованными антигеном рH 6; наноразмерными везикулами внешней мембраны c включёнными белками Ail, Pla, капсульным антигеном F1 [4][5][6]. Наличие адгезинов способствует фиксации возбудителя чумы на поверхности эукариотических клеток, связыванию в различной степени с белками ВКМ ламинином, фибронектином, коллагеном IV типа, транслокации эффекторных белков в клетки-мишени, что обеспечивает уклонение от фагоцитоза и иммунологического распознавания организмом хозяина [1]. При снижении адгезивной активности штаммов чумного микроба разных подвидов зафиксировано повышение поглотительной способности фагоцитов у лабораторных животных [7].

В России синтезирован и внедрен в практику не имеющий аналогов за рубежом иммуноадъювант азоксимера бромид (полиоксидоний, ПО) — водорастворимое N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина с молекулярной массой 80 кДa [8]. В условиях in vivo ПО обладает выраженным иммуномодулирующим, детоксицирующим, антиоксидантным, мембраностабилизирующим и антигенусиливающим эффектом, применяется в схеме терапии ряда инфекционных заболеваний как вирусной, так и бактериальной этиологии, входит в состав вакцин против гриппа [9][10].

Особенностью химической структуры ПО является наличие на поверхности его молекулы большого количества различных активных групп, которые могут взаимодействовать с белками поверхностных структур бактериальных клеток [8]. Имеется ряд сообщений об ингибирующем действии ПО на факторы персистенции патогенов. Установлено, что он изменяет адгезивные свойства патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов (Shigella flexneri, Salmonella enteritidis, Corynebacterium diphtheriae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Candida albicans), снижает антилизоцимную и антикомплементарную активность микроорганизмов, повышает чувствительность ряда микроорганизмов к определенным антибиотикам групп линкозамидов, фторхинолонов, цефалоспоринов [11][12].

Для изучения адгезивных свойств микроорганизмов на современном уровне применяются методы бионанотехнологии, оперирующей наноразмерными объектами, среди которых особое место занимает атомно-силовая микроскопия (АСМ). АСМ принадлежит к семейству проксимальной зондовой микроскопии для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне, позволяет проводить одновременное исследование с субнанометровым пространственным разрешением локальных свойств клеточной стенки, в том числе жёсткости, пластичности и адгезивности [13][14].

Сведения о непосредственном влиянии адъювантов с иммуномодулирующим действием на биологические свойства возбудителей особо опасных заболеваний бактериальной этиологии, архитектонику их поверхностных структур, в том числе клеток вакцинных штаммов, отсутствуют.

Цель исследования — изучение влияния азоксимера бромида на морфометрические характеристики и адгезивность вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ и других представителей рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) с применением АСМ, а также характера действия на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к белку ВКМ — коллагену IV типа.

Материалы и методы

В работе использованы полученные из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» вакцинный штамм Y. pestis ЕV НИИЭГ (pYT⁺, pYV⁺, pYP⁺) и его изогенные производные Y. pestis КМ218 (pYT^–, pYV^–, pYP^–), Y. pestis КМ216 (pYT^–, pYV^–, pYP⁺), штаммы Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, Y. enterocolitica КМ33(201) (pYV⁺) 09 серовара, Y. enterocolitica КМ383 (pYV^–) 09 серовара. Штаммы микроорганизмов культивировали при 28°С и 37°С для Y. enterocolitica в течение 48 ч на питательной среде агар LB по Miller рН (7,2 ± 0,1) как с добавлением 60 мкг/мл иммуноадъюванта ПО (терапевтическая концентрация при разовом введении человеку), так и без внесения в среду ПО. Из выращенных культур готовили взвеси в стерильном 0,9% растворе NaCl рН 7,2 по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-59-85П 10 единиц, эквивалентному 1 × 10⁹микробных клеток на 1 мл, которые обеззараживали 2,5% раствором глутарового альдегида в 0,1 молярном какодилатном буфере рН (7,2–7,4) в течение 2 ч при 4°С с последующей проверкой на специфическую стерильность. Для проведения АСМ обеззараженные и дважды отмытые в стерильной дистиллированной воде бактериальные клетки помещали на поверхность подложки (стерильное предметное стекло) и высушивали на воздухе.

Исследования проводили с помощью сканирующего зондового микроскопа «Solver P47-PRO» («NT-MDT», Россия) в режиме прерывистого контакта АСМ следующими методами: полуконтактным, рассогласования и отображения фазы, а также в режиме непрерывного контакта следующими методами: постоянной силы и АСМ-спектроскопии. Использовали кремниевые зонды серии NSG01 («NT-MDT») жесткостью 5,1 Н/м с радиусом кривизны 10 нм и резонансной частотой 150 кГц и CSG30 («NT-MDT») жесткостью 0,1 Н/м с радиусом кривизны 10 нм и резонансной частотой 48 кГц. Исследования проводили при оптимальных значениях основных параметров сканирования: амплитуда колебаний кантилевера Resonance 22 единицы, начальная фаза его колебаний Phase 240°, скорость сканирования Frequency 0,75 Гц, коэффициент усиления цепи обратной связи FB Gain 0,3 единицы, Set Point 19 единиц (величина Set Point и начальный уровень сигнала DFL определяли величину силы взаимодействия зонда с поверхностью образца).

Оценивали морфометрические показатели бактериальных клеток: длину (L), ширину (W), толщину (высоту, Н), площадь поперечного сечения (S) и объем (V); коэффициент вытянутости клетки (L/W), характеризующий ее форму; коэффициент уплощенности (S/H), характеризующий степень пластичности клетки; индекс (I) отношения ширины клетки к ее высоте (W/H), характеризующий степень ригидности клеточной стенки; показатель среднеквадратичной шероховатости поверхности (root mean square — RMS), рассчитываемый как среднеквадратичная величина отклонений размеров пиков и впадин от средней линии поверхности подложки; силу адгезии. Обработку и анализ АСМ-изображений не менее чем 30 бактериальных клеток в каждом образце проводили с использованием программного обеспечения «Image Analysis» («NT-MDT»).

Изучение действия ПО на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к коллагену человека IV типа человека («Sigma-Aldrich», C7521) проводили по определению количества бактериальных клеток, прикрепившихся к стеклянным слайдам, предварительно обработанным раствором коллагена IV типа в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 ± 0,1 концентрацией 20 мкг/мл [15]. Прикрепившиеся клетки фиксировали парами формальдегида, окрашивали кристаллвиолетом и подсчитывали с использованием микроскопа «Olimpus CX 31» с видеокамерой «JVC» в 20 полях зрения в 3 повторах при увеличении 900. Иммуногенность культур Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенных на питательной среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без, оценивали по уровню антител к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови мышей BALB/c на 21-е сутки после иммунизации подкожно дозой 2,5 × 10⁴колониеобразующих единиц (КОЕ).

Протокол исследований одобрен Комиссией по биоэтике при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 6 от 09.10.2019).

Определение антител проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением сертифицированной иммуноферментной тест-системы «ИФА-АТ-Ф1 YERSINIA PESTIS» рег. уд. № ФСР 2012/13946 — 101012 (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») в строгом соответствии с инструкцией по применению. Учет оптической плотности осуществляли на микропланшетном фотометре «Stat Fax-3200» при длине волны 405 нм. Наличие антител в сыворотке определяли в 3 повторах и выражали в виде обратного среднегеометрического титра и его среднего квадратического отклонения.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica 10.0» («StatSoft Inc.»). Взаимосвязь между переменными определяли с помощью рангового корреляционного анализа по Спирмену. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде М ± m, где М — среднее значение анализируемого показателя, m — средняя квадратическая ошибка средней арифметической. Значимость различий между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия между группами наблюдения считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Выбор питательной среды агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 в качестве среды культивирования для изучения действия ПО на морфометрические характеристики и адгезивность вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и других представителей рода Yersinia обусловлен сравнительно близким по данным транскриптомного анализа характером роста чумного микроба в плазме крови человека [16], что позволяет более адекватно экстраполировать результаты исследований на процессы иммунопатогенеза в организме людей при чуме.

Полученные нами результаты экспериментальных исследований, представленные в табл. 1 и 2, свидетельствуют о непосредственном модифицирующем действии ПО на линейные параметры и адгезивные свойства бактериальных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и других представителей рода Yersinia. На основании морфометрического анализа установлено достоверное увеличение объема клеток у штамма Y. pestis EV НИИЭГ в 1,62 раза и его изогенных производных Y. pestis КМ216 (pYT^–, pYV^–, pYP⁺), Y. pestis КМ218 (pYT^–, pYV^–, pYP^–) — в 1,7 и 1,18 раза соответственно (р ˂ 0,05) при культивировании на среде с ПО. Коэффициент уплощённости, характеризующий степень пластичности бактериальной клетки [17], также достоверно (р ˂ 0,05) увеличивался в 1,26 раза у клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, в 1,1 и 1,12 раза — у штаммов Y. pestis КМ216, Y. pestis КМ218 соответственно.

Таблица 1. Морфометрические показатели клеток микроорганизмов рода Yersinia при культивировании на среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без по данным АСМ (M ± m)
Table 1. Morphometric cell counts of microorganisms of the genus Yersinia in cultivation conditions on the medium LB agar, Miller pH 7,2 ± 0,1 with the addition of PO and without it according to atomic-force microscopy (M ± m)

Штаммы Strains	Среда Medium	Длина, мкм Length, pm	Ширина, мкм Width, pm	Высота, мкм Height, pm	Объем, мкм³Volume, pm³
Y. pestis EV НИИЭГ (pYT⁺, pYV⁺, pYP⁺) Y. pestis EV NIIEG	LB агар LB agar	1,6 ± 0,1	0,9 ± 0,1	0,36 ± 0,05	0,54 ± 0,02
	LB агар + ПО LB agar + PО	2,4 ± 0,1*	1,1 ± 0,1	0,32 ± 0,05	0,88 ± 0,02*
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар LB agar	1,9 ± 0,1	0,85 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,31 ± 0,01
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар + ПО LB agar + PО	2,1 ± 0,1	0,85 ± 0,1	0,29 ± 0,05	0,54 ± 0,02*
Y pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар LB agar	2,4 ± 0,1	0,8 ± 0,1	0,25 ± 0,05	0,50 ± 0,02
Y pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар + ПО LB agar + PО	2,5 ± 0,1	0,9 ± 0,1	0,25 ± 0,05	0,59 ± 0,02*
Y pseudotuberculosis I серовар I serovar	LB агар LB agar	1,5 ± 0,1	0,7 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,38 ± 0,02
Y pseudotuberculosis I серовар I serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,4 ± 0,1	0,65 ± 0,1	0,30 ± 0,05	0,28 ± 0,01*
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар LB agar	1,7 ± 0,1	0,7 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,43 ± 0,01
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,9 ± 0,1	0,65 ± 0,05	0,30 ± 0,05	0,39 ± 0,02
Y enterocolitica КМ33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	1,4 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,25 ± 0,05	0,22 ± 0,01
Y enterocolitica КМ33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,2 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,30 ± 0,05	0,23 ± 0,01
Y. enterocolitica КМ383(рYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	1,4 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,35 ± 0,05	0,26 ± 0,01
Y. enterocolitica КМ383(рYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PО	1,4 ± 0,1	0,55 ± 0,1	0,30 ± 0,05	0,24 ± 0,01

Примечание. ⃰ р ˂ 0,05 по сравнению с параметрами при культивировании на LB агаре.
Note. *p < 0,05 in comparison with parameters when cultivating on LB agar.

Таблица 2. Морфо- и наномеханические показатели клеток микроорганизмов рода Yersinia при выращивании на среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с ПО и без по данным АСМ (M ± m)
Table 2. Morpho- and nanomechanical cell surface properties of microorganisms of the genus Yersinia in cultivation conditions on the medium LB agar, Miller pH 7,2 ± 0,1 with PO and without it according to atomic-force microscopy (M ± m)

Штаммы Strains	Среда Medium	Индекс I Index I	SIH	RMS	Сила адгезии, нН Adhesion force, nN
Y. pestis EV НИИЭГ (pYT⁺, pYV⁺, pYP⁺) Y. pestis EV NIIEG	LB агар LB agar	2,5 ± 0,1	0,70 ± 0,02	33 ± 1	6,6 ± 0,1
	LB агар + ПО LB agar + PO	3,5 ± 0,1*	0,88 ± 0,03*	25 ± 1*	4,9 ± 0,1*
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар LB agar	2,4 ± 0,1	0,6 ± 0,02	37 ± 1	6,5 ± 0,1
Y. pestis КМ216 (pYT^-, pYV^-, pYP⁺)	LB агар + ПО LB agar + PO	2,9 ± 0,1*	0,67 ± 0,02*	27 ± 1*	5,0 ± 0,1*
Y. pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар LB agar	3,2 ± 0,1	0,64 ± 0,02	30 ± 1	4,7 ± 0,1
Y. pestis КМ218 (pYT^-, pYV^-, pYP^-)	LB агар + ПО LB agar + PO	3,6 ± 0,1*	0,72 ± 0,02*	27 ± 1	4,2 ± 0,1*
Y. pseudotuberculosis Iсеровар I serovar	LB агар LB agar	2,0 ± 0,1	0,54 ± 0,02	35 ± 2	2,3 ± 0,1
Y. pseudotuberculosis Iсеровар I serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	2,16 ± 0,10	0,50 ± 0,02	26 ± 1*	1,9 ± 0,1*
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар LB agar	2,0 ± 0,1	0,54 ± 0,02	36 ± 2	2,7 ± 0,1
Y. pseudotuberculosis IV серовар IV serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	2,16 ± 0,1	0,51 ± 0,02	27 ± 1*	2,1 ± 0,1*
Y. enterocolitica KM33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	2,4 ± 0,1*	0,48 ± 0,02	38 ± 2	3,5 ± 0,1
Y. enterocolitica KM33(201) faYV⁺) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	2,0 ± 0,1	0,47 ± 0,02	35 ± 1	2,7 ± 0,1*
Y. enterocolitica KM383faYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар LB agar	1,7 ± 0,1	0,48 ± 0,02	37 ± 2	2,3 ± 0,1
Y. enterocolitica KM383faYV^-) 09 серовар 09 serovar	LB агар + ПО LB agar + PO	1,8 ± 0,1	0,44 ± 0,02	33 ± 1	2,2 ± 0,1

Примечание. ⃰р ˂ 0,05 по сравнению с параметрами при культивировании на LB агаре.
Note. Index I — wight/length; S/H — square/height; RMS — root mean square. *p < 0,05 in comparison with parameters when cultivating on LB agar.

По данным АСМ зарегистрировано значимое (p < 0,05) влияние ПО на повышение индекса I, уменьшение в нанометровом диапазоне среднеквадратической шероховатости клеточной поверхности и силы адгезии у клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом.

Полученные нами результаты морфометрического анализа свидетельствуют, что введение ПО в состав среды культивирования приводит к увеличению пластичности и снижению ригидности клеточной стенки, среднеквадратической шероховатости клеточной поверхности, силы адгезии чумного микроба, наиболее выраженным у штамма Y. pestis EV НИИЭГ. Корреляционный анализ показал прямую зависимость увеличения коэффициента уплощенности, индекса I (r_S= 0,954‒0,979 при значении критерия Стьюдента t = 1,61–3,44) и обратную зависимость — для среднеквадратической шероховатости клеточной поверхности и силы адгезии (r_S= −(0,967–0,984) при значении критерия Стьюдента t = 1,93–3,52), что свидетельствовало о функциональной связи выявленных изменений морфометрических показателей с присутствием ПО в среде культивирования. В меньшей степени снижение силы адгезии при отсутствии достоверных изменений индекса I под действием ПО наблюдалось у клеток Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, а также у бактерий Y. enterocolitica 09 серовара c плазмидой pYV⁺. У штамма Y. enterocolitica КМ 383 (рYV^–) 09 серовара при культивировании на среде с ПО не выявлено значимых изменений морфометрических показателей бактериальных клеток и наномеханических свойств их поверхности. Параллельно с определением характера действия ПО на морфометрические характеристики и адгезивность вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ с применением АСМ нами изучено влияние данного иммуноадъюванта на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к белку ВКМ — коллагену человека IV типа. Коллаген IV типа является ключевым структурным компонентом базальных мембран сосудистого эндотелия и слизистых оболочек. Молекула коллагена IV типа служит лигандом для интегринов, рецепторов на поверхности клеток, обеспечивая клеточную адгезию, миграцию и дифференцировку [18][19]. Установлено, что введение ПО в состав среды культивирования приводит к достоверному (p < 0,05) уменьшению количества клеток Y. pestis EV НИИЭГ, прикрепившихся к коллагену человека IV типа по сравнению с культивированием на среде без ПО — 68 ± 4,75 и 96 ± 10,5 микробных клеток соответственно. В то же время мало выраженная по силе отрицательная корреляция (r_S= −0,4755; р = 0,04) свидетельствует о второстепенном значении компонента ВКМ коллагена IV типа в качестве мишени в механизме действия ПО на адгезивность клеток Y. pestis EV НИИЭГ.

Модификация ПО адгезивных свойств вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ сопровождалась изменением его иммуногенности в сторону повышения. Характеристики антигенной активности культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на питательной среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без него, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Титры антител к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови мышей BALB/c, вакцинированных Y. pestis EV линии НИИЭГ в условиях культивирования на среде агар LB по Miller рН 7,2 ± 0,1 с добавлением ПО и без (M ± m)
Table 3. Antibody titers to Y. pestis F1 capsule antigen in serum BALB/c mice vaccinated with Y. pestis EV NIIEG cultivated on LB agar, Miller pH 7,2 ± 0,1 with the addition of PO and without it (M ± m)

Иммунизирующий штамм, доза (КОЕ) Strain used for immunization, dose (CFU)	Количество животных Number of animals	Реципрокные значения среднегеометрического титра Geometric mean reciprocal titers
Y pestis EV НИИЭГ (LB агар, Miller рН 7,2) Y pestis EV NIIEG (LB agar, Miller рН 7,2) 2,5 × 10⁴	10	76 ± 35,43
Y pestis EV НИИЭГ (LB агар, Miller рН 7,2 + ПО) Y pestis EV NIIEG (LB agar, Miller рН 7,2 + PO) 2,5 × 10⁴	10	136 ± 36,6*
0,9% NaCl	10	< 40

Примечание. *р < 0,05 по отношению к группе сравнения, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ.
Note. p < 0.05 in comparison with mice immunized with Y. pestis EV NIIEG.

Установлено, что уровень антител к капсульному антигену чумного микроба F1 в 1,7 раза выше в группе животных, иммунизированных вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным на питательной среде с ПО.

Обсуждение

Известно, что адгезины патогенных иерсиний действуют на разных стадиях инфекционного процесса, выполняют множественные функции, не только участвуют в процессах прикрепления к клеткам хозяина, но и связаны с проявлением таких свойств, как инвазия, персистенция, выживание в клетках хозяина, биопленкообразование, цитотоксичность [20]. Адгезия бактериальных клеток к контактирующим поверхностям может реализовываться за счет формирования нескольких типов связей, различных по природе и специфичности. К ним относятся неспецифические физико-химические связи, такие как силы Ван-дер-Ваальса, электростатические, гидрофобные, стерические, водородные связи, а также специфические лиганд-рецепторные взаимодействия между поверхностными структурами бактерий (адгезинами) и рецепторами клеток-мишеней организма хозяина [21][22]. АСМ позволяет получить 3D изображения единичных бактериальных клеток и их поверхностных ультраструктур, проводить точную морфометрическую оценку их основных параметров, исследовать молекулярные (гидрофобные и электростатические) взаимодействия на поверхности бактерий, картировать физико-химические свойства, измерять ригидность клеточной стенки и адгезивные свойства клеточной поверхности [23][24]. Результаты нашего исследования показали, что введение ПО в состав среды культивирования приводило к достоверным изменениям индикаторных морфометрических параметров клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV линии НИИЭГ (увеличению объема, коэффициента уплощенности, индекса I), указывающих на повышение пластичности и снижение ригидности клеточной стенки. Выявленные изменения морфометрических показателей сопровождались трансформацией наномеханических свойств клеточной поверхности (снижением среднеквадратической шероховатости, силы адгезии) бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, что свидетельствует о присутствии молекулярных мишеней для ПО на наружной мембране чумного микроба.

Биологические функции напрямую связаны с составом и организацией микробной поверхности. Ряд идентифицированных белков наружной мембраны патогенных иерсиний, функции которых определяют адгезию микробных клеток к структурным компонентам хозяина, относятся к аутотранспортным белкам или системе секреции V типа. Патогенные виды рода Yersinia экспрессируют аутотранспортные белки типов Va, Vc и Ve [4]. YadA — многофункциональный белок наружной мембраны Y. pseudotuberculosis и Y. enterocоlitica, относящийся к адгезинам типа Vc и кодируемый плазмидой вирулентности pYV (pCad). Помимо осуществления основной функции — адгезии бактерий, YadA участвует в процессах аутоагглютинации, инвазии, устойчивости к фагоцитозу, бактерицидному действию сыворотки. Интенсивность биосинтеза YadA возрастает при 37°С, обеспечивая покрытие этим белком значительной части поверхности микробной клетки [20]. Как показали результаты настоящего исследования, ПО, по-видимому, может оказывать ингибирующее действие на продукцию белка YadA, на что указывают значимое снижение силы адгезии у бактериальных клеток штамма Y. enterocolitica КМ-33(201) 09 серовара c плазмидой pYV (pCad⁺) при отсутствии таковых у Y. enterocolitica КМ 383 (pYV^–) 09 серовара в одинаковых условиях культивирования на среде с ПО при 37°С.

Одним из факторов адгезии возбудителя чумы является активатор плазминогена Pla, принадлежащий к семейству сериновых протеаз наружных мембран энтеробактерий и кодируемый видоспецифичной плазмидой pYP (pPla, pPCP1 или pPst). Четвертичная структура белка представлена 5 периплазматическими и 5 внеклеточными петлями, выступающими в межклеточное пространство на расстояние около 40 Å от липидного бислоя наружной мембраны. Белок Pla Y. pestis, помимо активации плазминогена и превращения его в плазмин путем ограниченного протеолиза, способен к гидролизу C3 компонента комплемента, протеолитическому инактивированию антимикробного пептида — кателицидина LL-37, а также TNF-α, IFN-γ, IL-8 и протеина 1 хемотаксиса моноцитов [25][26]. Сравнительный анализ полученных нами данных АСМ штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и его изогенных производных показал, что у безплазмидного штамма Y. pestis КМ218 (pYT^–, pYV^–, pYP^–) значение силы адгезии достоверно (p < 0,05) меньше таковых, измеренных для клеток штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ (pYT⁺, pYP⁺, pYV⁺) и штамма Y. pestis КМ216, имеющего только одну плазмиду pYP. Введение ПО в состав среды культивирования приводило к значимому снижению показателя среднеквадратичной шероховатости поверхности и силы адгезии у клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных, выраженность проявлений которых зависела от плазмидного профиля. У штамма Y. pestis КМ218, утратившего плазмиды pYP, pYV и pYT, зарегистрированы наиболее низкие исходные показатели адгезивных свойств клеточной поверхности бактерий и наименее значимые их изменения под действием ПО.

Активатор плазминогена Pla также может избирательно связываться с белками ВКМ и базальными мембранами (ламинином, коллагеном IV типа), обеспечивая тем самым уклонение от захвата профессиональными фагоцитами хозяина в мало доступных лейкоцитам местах [25][27]. Нами установлено, что введение ПО в состав среды культивирования приводило к снижению способности клеток Y. pestis EV НИИЭГ прикрепляться к коллагену человека IV типа — ключевому структурному компоненту базальных мембран сосудистого эндотелия и слизистых оболочек.

Как известно, липополисахарид (ЛПС) представляет собой сигнальную молекулу, распознаваемую системой врожденного иммунитета и обеспечивающую её активацию на самых ранних стадиях вакцинального процесса. Антигенпрезентирующие клетки (дендритные, клетки Лангерганса) организма хозяина экспрессируют на своей поверхности лектиновые рецепторы DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule-grabbing nonintegrin receptor) или CD209 и лангерин (CD207), которые могут связываться непосредственно с коровой областью ЛПС Y. pestis [28]. CD209 представлен также на поверхности макрофагов, включая альвеолярные макрофаги человека [29]. С помощью атомно-силовой спектроскопии с использованием оптической ловушки показано непосредственное участие в связывании с мембраной макрофага коровой области ЛПС Y. pestis вакцинного штамма EV НИИЭГ [30]. Установлено, что при 28°С синтезируется гекса-ацилированная форма липида А ЛПС Y. pestis со стимулирующей паттернраспознающий TLR4/ MD2-рецептор активностью, имеющей важное значение в инициации формирования антибактериального адаптивного иммунитета [31][32]. По данным S. Montminy и соавт. [33], мутант вирулентного штамма Y. pestis KIM1001-pLpxL с конститутивным синтезом гексагональной формы липида А утрачивал вирулентность для биопробных животных при наличии всех известных детерминант вирулентности и индуцировал формирование защиты в эксперименте от бубонной и легочной форм чумы. В нашей работе зарегистрировано повышение иммуногенных свойств культур вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на питательной среде с добавлением ПО при 28°С. По-видимому, особенность химической структуры ПО (сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбокси)- 1,4-этиленпиперазиния бромида), связанной с наличием N-оксидных и карбоксильных групп, может способствовать изменению экспрессии адгезинов на клеточной поверхности и повышению функциональной активности гекса-ацилированного ЛПС за счет уменьшения его экранирования и изменения пространственной ориентации. Также результаты настоящего исследования свидетельствуют о возможной связи направленности трансформирующего действия ПО наномеханических свойств клеточной поверхности (среднеквадратической шероховатости, силы адгезии) со снижением биосинтеза адгезинов, кодируемых плазмидой pYP у вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и плазмидой pYV у штаммов других представителей рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis I и IV сероваров, Y. enterocolitica 09 серовара). Вопрос о молекулярных механизмах этого воздействия и связи с защитной эффективностью вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ от чумной инфекции является предметом дальнейших исследований.