Moraxella osloensis as a part of genital tract microbiota in infertility: incidental findings or pathology markers?

Full Text

Введение

Проблемой, которая в настоящее время подвергается всестороннему изучению, является влияние вагинальной микробиоты (ВМБ) на состояние здоровья женщин и их новорождённых [1]. Развитие представлений о состоянии вагинального биотопа женщин репродуктивного возраста неразрывно связано с историей изучения нормальной микрофлоры влагалища. В 1892 г. А. Додерлейн впервые описал бактерии, преобладавшие в нормоценозе, которые впоследствии назвали палочками Додерлейна, а в настоящее время объединяют под общим названием Lactobacillus spp. Дальнейшие исследования доказали, что нормальная флора весьма разнообразна и изменчива. Её состав зависит от множества факторов: возраста женщины, фазы менструального цикла, сексуальной активности, наличия беременности и др. Однако признаком здоровья по сей день считается преобладание в микробном пейзаже влагалища лактобацилл (до 95%). Здоровые женщины в основном колонизированы L. crispatus, L. jensenii и L. iners; однако и другие бактерии могут быть элементами ВМБ [2].

Параллельно с изучением нормальной микрофлоры исследовали и микробиоту женщин с патологическими выделениями. До недавнего прошлого все заболевания, не обусловленные гонококками, трихомонадами и кандидами, назывались «неспецифический вагинит/кольпит». Первое классическое клинико-эпидемиологическое исследование, с которым официально связано начало изучения бактериальных вагинозов, было проведено H.L. Gardner и соавт. в 1954 г. [3]. Авторы выделили новую бактерию из половых путей женщин, подтвердив её этиологическую значимость в развитии «неспецифических кольпитов» и возможность полового пути передачи. Лишь в 1980 г., используя метод ДНК-РНК-гибридизации, установили её принадлежность к совершенно новому роду Gardnerella, названному в честь H.L. Gardner. Соответственно, заболевание стали называть гарднереллезом. В 1982 г. Р.А. Totten и соавт. [4] доказали, что G. vaginalis всегда обнаруживаются у больных, но они встречаются также у 5–40% клинически здоровых женщин. Другими словами, гарднереллы не являются единственной причиной заболевания, более того, ведущая роль принадлежит консорциуму анаэробных бактерий.

В 1984 г. в Стокгольме по предложению научной группы K. Holmes было принято современное название болезни — бактериальный вагиноз (БВ) — как наиболее точно характеризующее патологию. Оказалось, что обсеменённость влагалища при БВ на несколько порядков выше, чем у здоровых женщин: 10¹⁰–10¹¹ против 10⁶–10⁷ КОЕ/мл. При этом резко изменяется соотношение аэробной и анаэробной флоры в сторону увеличения последней и существенно меняется качественный состав микроорганизмов, прежде всего за счёт значительного уменьшения количества лактобацилл (до уровня менее 30% от исходного), их видового спектра и функциональной активности, сопровождающегося активизацией роста разнообразных условно-патогенных видов. Наряду с этим расширяется и перечень таксонов, ассоциированных с БВ. В их числе Atopobium vaginae, Mobiluncus spp., Bacteroides spp., Prevotella spp. и другие анаэробные бактерии [5]. Термин «вагиноз» подчеркивает отсутствие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища, несмотря на обильные выделения с неприятным запахом, что подтверждается низким содержанием нейтрофильных лейкоцитов в вагинальном содержимом. БВ — исключительно женское заболевание, между тем и у мужчин детектируются микроорганизмы, заселяющие влагалище женщин в подобных случаях. Поскольку никакие клинические симптомы при этом у них обычно не возникают, принято считать, что мужчины выступают лишь носителями инфекции и своего рода ее распространителями среди женщин. Появляются публикации, указывающие на влияние классических возбудителей БВ на сперму и семенную жидкость — два основных компонента, связанных с мужской фертильностью [6]. Однако при бактериологическом исследовании такие признанные ассоцианты микробиоты женщин при БВ, как G. vaginalis и A. vaginae, крайне редко детектируются в эякуляте мужчин. В подобных случаях диагностику провести удается лишь с помощью высокоточных лабораторных методов, а интерпретация полученных при этом результатов весьма сложна.

Внедрение не зависящих от культуры молекулярных методов предоставило новую информацию о бактериальном разнообразии в ВМБ, выявив большое количество привередливых и/или некультивируемых видов бактерий. Эти молекулярные исследования сформировали новый взгляд на роль состава бактериальных сообществ. Стало ясно, что их пейзаж гораздо сложнее, чем ранее признавалось, а в ВМБ в дополнение к уже идентифицированным видам обнаруживаются многие до сих пор неизвестные бактериальные таксоны [7][8].

В литературе последних лет, характеризующей ВМБ на основе применения различных технологий микробиологического анализа, в том числе при БВ [9][10], мы лишь однажды встретили указание на более или менее значимое представительство бактерий семейства Moraxellaceae [11]. Впервые описанные V. Morax [12], эти бактерии проявляли высокую степень тропизма к тканям глаза и сегодня относятся к ведущим этиопатогенам кератита, конъюнктивита и эндофтальмита [13]. Об их встречаемости и роли в генитальном тракте свидетельствуют немногочисленные публикации прошлых лет [14][15][16][17][18].

Наш опыт молекулярно-генетического исследования микрофлоры генитального тракта мужчин и женщин, состоящих в бесплодном браке, заставлял обращать внимание на присутствие генетических маркеров Moraxella spp., к тому же представителей этого рода мы всегда обнаруживали и в материале больных с предположительным диагнозом «острая генитальная гонококковая инфекция» (ОГГИ). 

Цель исследования — оценить возможную диагностическую и прогностическую роль Moraxella spp., детектируемых в генитальном тракте пациентов, состоящих в бесплодном браке.

Материалы и методы

Для исследования использовали образцы вагинального содержимого, полученного из заднего свода влагалища с помощью мерной ложки Фолькмана от 15 женщин, и пробы эякулята от 15 мужчин — их половых партнеров — при бесплодном браке, а также пробы отделяемого генитального тракта 12 пациентов с подозрением на ОГГИ.

Метагеномное исследование 16S рибосомальной РНК образцов осуществлено на платформе «Illumina MiSeq» с использованием набора «MiSeq Reagent Kits v3» («600-Cycle Kit») согласно рекомендациям производителя. Библиотеки для секвенирования участков V3–V4 гена 16S РНК были приготовлены согласно 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Illumina. При биоинформационной оценке применяли программное обеспечение для метагеномного анализа «Kraken Metagenomics v.2.0.0» (классификатор ридов — коротких нуклеотидных последовательностей), используя стандартную базу данных [19].

Для культурального метода применяли кровяной агар, среды Эндо и Сабуро, МРС, а также агар Мартена, изучали тинкториальные, культуральные и биохимические свойства выделенных штаммов.

Показатели количественных характеристик представлены как М ± σ.

Результаты

При биоинформационной оценке полученных данных установлено высокое содержание фрагментов бактериальных геномов в образцах. Для вагинального биотопа — 83,9 ± 16,1%, а для эякулята — 72,0 ± 28,6% от общего генетического материала в пробе.

Во влагалищной жидкости субфертильных женщин при метагеномном анализе доля бактерий семейства Lactobacillaceae составляла 12–84% (41,9 ± 17,99; рисунок, а). В половине случаев содержание геномовариантов этого семейства не превышало 30% общей бактериальной массы, что характерно для БВ. Ведущее положение среди представителей семейства занимал род Lactobacillus с доминированием L. jensenii, L. delbrueckii и L. amylolyticus, однако генетические маркеры L. crispatus — индикатора нормоценоза — не выявлены, что также настораживает в плане дисбиотического состояния во влагалище обследованных. Генетический материал L. iners — бактерии скорее с негативной репутацией — практически не детектирован. В то же время удельное содержание анаэробных бактерий — типичных ассоциантов БВ: Actinomyces spp., Peptoniphilus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp. и Mobiluncus curtisii — оказалось минимальным. Enterococcus faecalis детектированы во всех пробах, однако их удельный вес превышал 1% совокупного генетического материала лишь в трети случаев (рисунок, а). Доля микроорганизмов семейства Staphylococcaceae только в одном образце составила 0,5%, в остальных обнаруживали следовые количества, при этом преобладали геномоварианты из рода Staphylococcus. Аналогично скудное представительство характерно и для семейства Enterobacteriaceae. Только в 2 случаях энтеробактерии в общей микробной массе составили 0,8%, хотя во всех пробах обнаружены фрагменты геномов Escherichia coli, Klebsiella spp. и комплекса Enterobacter cloacae.

В эякуляте мужчин — половых партнеров обследованных женщин во всех образцах детектировали Enterococcus faecalis — 28,1 ± 23,6% от общего количества генетического материала (рисунок, б). Кроме того, у всех мужчин обнаружены фрагменты генома представителей рода Lactobacillus и семейства Enterobacteriaceae, однако их более или менее значимое содержание (≤5%) отмечали лишь в 1–2 образцах из 5. Удельный вес генетического материала бактерий — представителей родов Prevotella, Bacteroides, Clostridium, Morganella, Corynebacterium и Staphylococcus, которые встречались с заметным постоянством, был еще менее значительным.

Неожиданной находкой стало обнаружение во всех исследованных образцах в большом количестве генетических маркеров Moraxella spp. (рисунок), среди которых M. osloensis занимали лидирующие позиции. У женщин доля генетического материала M. osloensis оказалась в 2 раза больше, чем у мужчин (25,3 ± 9,0 и 11,7 ± 9,3% соответственно).

Для вагинального биотопа субфертильных женщин установлено, что у половины из них M. osloensis присутствовали одновременно с G. vaginalis, при этом первый симбионт преобладал, а доля гарднерелл составляла порядка 10% общей бактериальной массы. В трети таких случаев присутствовали E. faecalis (8–15%). Кроме этого, M. osloensis чаще обнаруживали в пробах, когда среди лактобактерий лидировали представители L. jensenii. В1 случае 20% генетического материала представлял геном Bifidobacterium longum в сочетании с M. osloensis (19%).

В эякуляте субфертильных мужчин детектирована устойчивая ассоциация E. faecalis и M. osloensis. В трети проб доминирующее положение занимали M. osloensis, а более чем в половине — E. faecalis.

При сравнении с пробами, полученными от мужчин и женщин с предположительным диагнозом ОГГИ, установлено, что генетический материал M. osloensis в них только в 1 случае достигал 7% от общего содержания, а в остальных — не превышал 1%. Если сравнить встречаемость и содержание M. osloensis и N. gonorrhoeae в микробиоте, то в половине случаев генетический материал моракселл преобладал над таковым гонококков, только в каждом третьем образце фрагменты генома N. gonorrhoeae регистрировали чаще, чем M. osloensis. В остальных образцах эти два вида имели равный удельный вес.

При использовании культурального метода представители рода Moraxella не были выделены ни в одной пробе. При посевах образцов зачастую регистрировали один вид микроорганизмов, реже ассоциации 2 бактерий и менее чем в десятой доле проб — совокупность 3 микроорганизмов. При молекулярно-генетическом исследовании обнаружен значительно более широкий видовой спектр в каждой пробе. Примечательно, что те виды, которые высевали при культивировании, детектированы и при метагеномном исследовании, но в минимальных количествах, и наоборот, что трудно объяснить.

Обсуждение

При обследовании супружеских пар, состоящих в бесплодном браке, а также пациентов с типичной клинической картиной ОГГИ — признанной патологии, зачастую приводящей к инфертильности, — при молекулярно-генетическом изучении патологического материала нами во всех случаях обнаружены представители рода Moraxella. Важно подчеркнуть, что при применении бактериоскопического и культурального методов такие находки были единичными при бесплодии и не регистрировались при гнойно-воспалительном процессе.

Неудачи микроскопического исследования, скорее всего, связаны с особенностями биотопа. По данным [13], при инфицировании глаза, например, моракселлы могут быть достаточно успешно детектированы при использовании только микроскопического метода, поскольку являются грамотрицательными диплобациллами и их легко отличить от других немногочисленных таксонов в слезной жидкости. При исследовании отделяемого генитального тракта, где фигурирует широкий спектр бактериальных морфотипов, внешне сходных с моракселлами, такой подход не информативен. Более того, M. osloensis отчасти может удерживать кристаллический фиолетовый, что еще более затрудняет диагностический процесс. Идентификация моракселл по фенотипическим признакам при бактериологическом анализе также затруднительна: для культивирования требуются длительная инкубация (более 48 ч) и сложные условия (6% СО₂ , многокомпонентные дорогостоящие, а порой недостаточно качественные среды и др.), при этом первоначальные колонии точечные, редко достигают 2 мм в диаметре [13]. Причинами неудач культуральногометода, скорее всего, следует считать и предшествующее антагонистическое действие ассоциантов в биотопе, и бактерицидное влияние компонентов секретов и т.п. В то же время самые информативные метагеномные исследования не дают оснований судить о жизнеспособности и характере взаимоотношений между детектируемыми микроорганизмами [20]. Более того, описаны трудности интерпретации результатов такого анализа, поскольку между видами, например, рода Neisseria существует значительное сходство, достигающее в отдельных случаях 98–99% [21].

Наш первый опыт, констатирующий детекцию фрагментов генома моракселл в 100% исследованных образцов, в силу минимального объема наблюдений не может претендовать на сколько-нибудь категорическую оценку этого феномена. Однако он дает повод рассматривать представителей рода Moraxella, в первую очередь M. osloensis, в качестве возможных маркёров патологических изменений в микробиоте генитального тракта, ассоциированных с нарушением фертильности.

Наряду с установленной нами частотой их встречаемости в подобных случаях, основанием для такого предположения служат, на наш взгляд, и результаты ряда исследований других авторов, характеризующие биологические особенности этих бактерий. Исследователи указывают на высокую степень устойчивости моракселл к оксидативному стрессу, который можно наблюдать в репродуктивном тракте в результате активности лейкоцитов и/ или лактобактерий. Моракселлы, обладающие каталазной активностью, способны в большей степени выдерживать такой стресс, чем каталазанегативные виды [22], а каталазная активность M. osloensis превышает таковую у E. coli [23].

Moraxella spp. широко распространены в окружающей среде, что обусловлено их относительно высокой устойчивостью. M. osloensis, например, хорошо переносят высушивание и действие ультрафиолета, даже в большей степени, чем E. coli и S. aureus, что обусловлено содержащимися в клеточной мембране липидами и жирными кислотами [24, 25]. Можно предположить, что симбиоз с такими бактериями весьма полезен для других ассоциантов, в частности энтерококков и гарднерелл, поскольку они способны нейтрализовать антагонистическое действие представителей нормальной микрофлоры и эффекторов иммунной системы. В настоящее время M. osloensis относят к оппортунистическим патогенам, при том что их патогенный потенциал увеличивается при «старении» штаммов. Например, 60-часовые культуры оказались в несколько раз более вирулентными, чем 24-часовые, которые практически не оказывали повреждающего действия на тест-объекты [26].

Остается нерешенным вопрос о продукции токсина(ов), хотя логично предположить, что описанные выше эффекты могут быть связаны с тем, что через 60 ч инкубации культуры M. osloensis или существенно увеличивают продукцию, или накапливают токсин(ы). В целом для представителей рода описаны такие факторы патогенности, как липополисахарид, фимбрии, выработка капсулоподобного вещества и гемагглютинина [26]. Наличие
такого комплекса факторов патогенности в совокупности с медленным накоплением токсина(ов) позволяет предположить, что M. osloensis могут играть ключевую роль в поддержании патосимбиоза, особенно при хроническом воспалении.

Особый интерес в этой связи вызывает накопившаяся к настоящему времени информация о том, что долговременная колонизация органа определенными видами бактерий, вызывающими локальный генотоксический стресс, может стать причиной клеточной трансформации и в конечном счете привести к раку. Генотоксический стресс, в свою очередь, может быть следствием хронического воспаления, вызванного бактериями, накопления их метаболитов в тканях и органах. Установлено, что генотоксины приводят к увеличению повреждений ДНК и блокировке систем репарации [27]. Сведений о продукции подобных метаболитов M. osloensis в литературе мы не обнаружили, хотя считаем такую их способность вероятной. Представляется, что M. osloensis, доминирующие в репродуктивном тракте субфертильных пациентов, способствуют развитию и поддерживают бессимптомный воспалительный процесс, а медленное накопление токсина может оказывать пролонгированное повреждающее действие на гаметы. Более того, постоянное присутствие моракселл в микробиоте при ОГГИ может указывать и на их определенную патогенетическую активность, и на синергичный характер взаимоотношений между M. osloensis и N. gonorrhoeae.

В истории изучения вагинальной микробиоты есть примеры, когда трудно объяснимая встречаемость одного и того же микроорганизма в отсутствие симптоматики и при установленной патологии, в том числе при БВ, находила достаточно неожиданное объяснение. Так случилось, например, при детальном изучении представителей рода Gardnerella: факты позволяют предположить, что у здоровых женщин превалируют штаммы (или виды) гарднерелл с низкой вирулентностью, а за развитие заболевания, которое даже предлагается вновь называть гарднереллезом [28], отвечают высоковирулентные разновидности этих бактерий [29][30][31][32]. Авторы отмечают важную для развития полиэтиологичного БВ особенность гарднерелл — их способность к симбиозу с другими условно-патогенными анаэробами, предоставляя последним комфортную среду обитания [33].

Аналогичные гипотезы возникают при анализе биологических особенностей и частоты встречаемости моракселл в микробиоте генитального тракта обследованных мужчин и женщин. Отсутствие информации о связи этих бактерий с БВ, как, впрочем, и о прямой причастности последнего к снижению фертильности, с одной стороны, и выявление типичных признаков этого дисбиотического состояния (существенное снижение доли лактобактерий, присутствие G. vaginalis) — с другой, представляется нам фактом интересным и требующим пристального дальнейшего изучения. Можно полагать, что именно M. osloensis в ассоциациях с другими оппортунистическими патогенами, в частности G. vaginalis и E. faecalis, формируют консорциумы, обусловливающие устойчивый патосимбиоценоз, встречающийся в репродуктивном тракте, в том числе при бесплодии. Поскольку с каждым годом увеличивается число случаев, когда детектируют хронические воспалительные процессы в репродуктивном тракте, отличающиеся отсутствием клинических симптомов, но в то же время существенным поражением и даже деструкцией клеток человека [34], снижение фертильности при устойчиво сложившемся симбиоценозе, включающем моракселлы, можно рассматривать как индикаторное состояние для этой патологии, а M. osloensis — как её маркер.

Заключение

При метагеномном исследовании отделяемого генитального тракта мужчин и женщин, состоящих в бесплодном браке, зарегистрирована высокая частота встречаемости и зачастую значительная доля генетического материала Moraxella spp., в первую очередь M. osloensis, детектируемых в ассоциации с фрагментами генома E. faecalis и G. vaginalis. Наличие таких консорциумов в микробиоте репродуктивных органов указывает на возможную роль моракселл в поддержании патосимбиоценоза, обусловливающего бессимптомный хронический воспалительный процесс, приводящий, в частности, к снижению фертильности.

Данных об индуцируемых микробиотой генитального тракта генотоксических эффектах и мутагенезе, обусловленном и (или) модулируемом бактериями, в частности о способности моракселл к продукции генотоксинов, в доступной литературе мы не обнаружили. Однако исследования в этом направлении, в том числе при бесплодии, следует признать перспективными и целесообразными.

About the authors

A. P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: agodovalov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5112-2003

Anatoliy P. Godovalov — PhD (Med.), leading researcher, Central scientific research laboratory, Assoc. Prof., Microbiology and virology department

Perm

Russian Federation

N. S. Karpunina

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3127-1797

Natalia S. Karpunina — D. Sci. (Med.), Prof., Hospital therapy and cardiology department

Perm

Russian Federation

T. I. Karpunina

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2511-4656

Tamara I. Karpunina — D. Sci. (Biol.), Prof., Microbiology and virology department

Perm

Russian Federation

References

Supplementary files