Mass spectrometry analysis of protein blood extracts of animals with experimental brucellos

D. V. Ulshina; Ульшина Д. В.; D. A. Kovalev; Ковалев Д. А.; D. G. Ponomarenko; Пономаренко Д. Г.; D. V. Rusanova; Русанова Д. В.; T. V. Berdnikova; Бердникова Т. В.; A. Yu. Evchenko; Евченко А. Ю.; O. V. Bobrysheva; Бобрышева О. В.; Yu. V. Siritsa; Сирица Ю. В.; S. V. Pisarenko; Писаренко С. В.; A. M. Zhirov; Жиров А. М.; I. V. Kuznetsova; Кузнецова И. В.; N. G. Varfolomeeva; Варфоломеева Н. Г.; A. N. Kulichenko; Куличенко А. Н.

doi:10.36233/0372-9311-2019-4-11-18

Mass spectrometry analysis of protein blood extracts of animals with experimental brucellos

Authors: Ulshina D.V.¹, Kovalev D.A.¹, Ponomarenko D.G.¹, Rusanova D.V.¹, Berdnikova T.V.¹, Evchenko A.Y.¹, Bobrysheva O.V.¹, Siritsa Y.V.¹, Pisarenko S.V.¹, Zhirov A.M.¹, Kuznetsova I.V.¹, Varfolomeeva N.G.¹, Kulichenko A.N.¹
Affiliations:
1. Stavropol Research Institute for Plague Control
Issue: Vol 96, No 4 (2019)
Pages: 11-18
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/424
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-11-18
ID: 424

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. The aim of the present research was to study the possibility of direct detection of the causative agent of brucellosis in a biomaterial under experimental conditions via the MALDI-TOF MS method using Mass-Up program resources and a set of packages for open-source statistical software R. Materials and methods. We used laboratory mice infected with the causative agents of Brucellosis (strains B. melitensis 548, B. abortus 544, B. suis 1330) as models. Protein profiling was performed on a MALDI-TOF Microflex «Bruker Daltonics» mass spectrometer. Results. The bioinformatic-statistical approach used for analyzing MALDI-TOF mass spectra allows to carry out a direct detection of Brucella in the biomaterial; besides, it is possible to determinate their species via the identification of a group of biomarkers. Conclusion. It was experimentally confirmed that the protein profiles of the blood extracts of infected animals contain 11 markers, including 6 genus specific for Brucella spp., which can be associated with Brucella infection.

Keywords

Brucella spp., MALDI-TOF MS, protein profiling

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время в работу бактериологических лабораторий активно внед- ряется технология MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry — матрично-активированная лазерная десорбция/ ионизация с времяпролетным разделением), характеризующаяся высокоточной экс- пресс-идентификацией микроорганизмов, возможностью анализировать материал, контаминированный посторонней микрофлорой и низкой стоимостью анализа. Для подавляющего большинства микроорганизмов: грамположительные, гра- мотрицательные, аэробные и анаэробные бактерии, дрожжи и плесень, сформи- рованы базы масс-спектрометрических данных (БД). С одной стороны, можно с уверенностью утверждать, что имеющиеся коммерческие БД позволяют обеспечить проведение рутинной идентификации патогенов, с другой, количество референ- сных масс-спектров различных видов микроорганизмов составляет лишь малую долю глобального микробного разнообразия, и поэтому имеющиеся базы данных нуждаются в пополнении. Возможности применения метода MALDI-TOF MS для точной идентификации микроорганизмов на основании анализа их белковых профилей отражены в статье Seng P. с соавторами [7]. По данным авторов диагностическая информативность ме- тода MALDI-TOF MS варьирует в пределах от 90 до 99,9%. По результатам ранее проведенных нами исследований была доказана эффек- тивность применения MALDI-TOF MS для индикации и межвидовой дифферен- циации культур бруцелл, выделенных бактериологическим методом из клиническо- го материала [2]. Можно ожидать, что в ближайшие годы MALDI-TOF MS будет использоваться в комплексе с основными методами лабораторной диагностики бруцеллеза благодаря возможности ее применения для экспресс-идентификации и типирования биологических агентов [3; Sali M. et al., 2018]. Известно, что для успешной идентификации культур микроорганизмов необ- ходимого качества масс-спектры могут быть получены при концентрации в исход- ном образце — не менее 104 м.к./мл [5]. Кроме того, присутствие различных веществ органической и неорганической природы в клиническом материале может также затруднить прямую индикацию бруцелл. В качестве решения указанной проблемы используют различные способы предварительной подготовки проб: фракциониро- вание, удаление мажорных фракций белков, селективное удаление небелковых при- месей и др. Использование MALDI-TOF MS для выявления возбудителей ООИ, в том числе бруцеллеза, в клиническом материале на настоящий момент включает необ- ходимый этап выделения культуры патогена бактериологическим методом, что за- трудняет внедрение подобного подхода в практику ввиду увеличения материальных затрат и продолжительности анализа [6]. Дополнительные временные затраты для реализации данного этапа существенно затрудняют возможность раннего назначе- ния адекватного антибиотика и могут приводить к использованию как недостаточно эффективных, так и избыточных режимов терапии. Применительно к рассматрива- емой проблеме сокращение времени инкубации высева первичной гемокультуры с применением специальных способов пробоподготовки позволяет проводить прямую идентификацию первичной гемокультуры, минуя этап субкультивирования [8]. Принимая во внимание все достоинства и возможности метода, наиболее ак- туальной представляется задача по выявлению на белковых профилях исследуе- мых культур групп специфичных фрагментов — маркеров с целью их дальнейшего поиска в спектрах образцов клинического материала или биоматериала от живот- ных [4]. В ходе проведенных исследований по изучению культур возбудителя бруцелле- за методом MALDI-TOF MS нами были выявлены группы бруцелла-специфичных фрагментов в диапазоне масс 2000 — 20000 Da (m/z, ±5 Da): 2422, 2581, 3025, 3268, 3336, 3523, 3696, 3754, 4545, 4770, 5036, 5170, 5360, 6672, 7048, 9085, 16068 [1]. Для изучения возможности и эффективности применения MALDI-TOF масс- спектрометрии для прямой детекции возбудителя бруцеллеза в биологических об- разцах необходимо экспериментальное моделирование инфекции на биомоделях. Цель работы — изучить возможность прямого выявления возбудителя бруцелле- за в биоматериале с использованием MALDI-TOF MS в условиях эксперимента. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы В качестве биологических моделей использовали лабораторных мышей (n=20), зараженных возбудителями бруцеллеза (штаммы Brucella melitensis 548, Brucella abortus 544, Brucella suis 1330). В ходе эксперимента были сформированы четыре группы животных: группу № 1 заражали штаммом B.melitensis 548, № 2 — B. abortus 544, № 3 — B. suis 1330, № 4 — группа сравнения (животные, кровь которых была использована в анализе в ка- честве отрицательного контроля). Для моделирования инфекции мышам вводили подкожно в паховую область 0,5 мл суспензии соответствующего штамма бруцелл в концентрации 1105 м.к./мл в растворе 0,9% хлорида натрия, рН 7,2. Наблюдение за животными проводили в течение 21 сут после заражения. Через 21 сут после заражения биопробных животных умерщвляли путем хло- роформирования. У хлороформированных биомоделей производили взятие крови из сердца в объеме 1,0-1,5 мл. От зараженных животных производили посев па- ренхиматозных органов и лимфоузлов на агар Альбими, скошенный в пробирках. Посевы культивировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 14 сут. От всех зараженных животных бактериологическим методом была выделена культура бруцелл. Биологическая безопасность работ с культурами возбудителя бруцеллеза была обеспечена в полном объеме в соответствии с требованиями СП 1.3.31.18-13 и МУК 3.1.7.3402—16. Культуры возбудителя бруцеллеза были выращены на агаре Альбими (рН 7,2 — 7,4, прочность 300 — 380 г по Валенту, содержание аминного азота 100 — 120 мг). Для проведения исследования использовались: вода ультрачистая, тип I по ASTM (система Millipore, США), спирт этиловый 96 % (ГОСТ Р 51723-2001), кис- лота муравьиная ~ 98% (Sigma-Aldrich, США), ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ-МС (Sigma-Aldrich, США), α-циано-4-гидроксикоричная кислота, степень чистоты для масс-спектрометрии (Sigma-Aldrich, США), трифторуксусная кислота > 99% (Sigma-Aldrich, США), бактериальный тест-стандарт MBT для внутренней калибровки масс-спектрометра (Bruker Daltonics, Германия). Принимая во внимание внутриклеточную локализацию возбудителя бруцеллеза, в качестве образца для белкового профилирования брали экстракт лейкоцитарной фракции крови, для чего осадок, содержащий форменные элементы крови, разбавляли многократно дистиллированной водой с последующей инкубацией (10 мин) и цент- рифугированием до полного удаления эритроцитов. Освобождение от эритроцитов проводили до полного обесцвечивания, получаемого в ходе промывки супернатанта. Суспензию отмытых лейкоцитов переносили в чистые микроцентрифужные пробирки и центрифугировали с удалением супернатанта при 15500 об/мин 10 мин. Обеззараживание образцов лейкоцитарной фракции осуществляли путем до- бавления к пробе 70% этилового спирта с последующей инкубацией при темпера- туре 30оС в течение 90 мин. После проведенной инактивации образцы суспензии центрифугировали и супернатант отбирали. Для полного удаления спирта процеду- ру центрифугирования повторяли. После обеззараживания часть осадка высевали на скошенный Бруцеллагар, посевы инкубировали в течение 7 дней при 37°C. Во время проведения контроля на специфическую стерильность образцы белковых экстрактов хранились при тем- пературе минус 18 — 20°С. При отсутствии специфического роста в пробирках с Бруцеллагаром исследуемый материал считали обеззараженным. Белковую экстракцию лейкоцитарной фракции производили смесью 70 % му- равьиной кислоты и ацетонитрила. Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 2000—20000 Da. Подготовленные вышеописанным способом пробы в объеме 1 мкл наносили на ячейки стального планшета для MALDI-TOF MS, в течение нескольких минут су- шили на открытом воздухе, затем сверху наслаивали раствор матрицы (α-циано-4- гидроксикоричная кислота в растворе, содержащем 500 мкл ацетонитрила, 475 мкл воды I типа и 25 мкл трифторуксусной кислоты). Плашку высушивали на воздухе в течение 5 минут до образования кристаллов. Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектромет- ре Microflex при следующих параметрах: частота лазера 60 Гц, интенсивность лазера 10—50%, время задержки экстракции 110 нс PIE, напряжение первого источника ионов 19,4 kV, второго — 17,3 kV, напряжение фокусирующей линзы 8 kV, напряже- ние линейного детектора 2,500 kV, диапазон масс m/Z 2000—20000 Da. Внутреннюю калибровку диапазона m/Z проводили с использованием точных значений масс бактериального тест-стандарта MBT (Bruker Daltonics, Германия) в автоматическом режиме. Для управления масс-спектрометром, включая установку режимов работы и регистрации масс-спектров, использовали программный пакет Daltonics flexControl v.3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), для предварительной оценки интенсивности и разрешения пиков в спектре — flexAnalysis v 3.3.65. Формирование промежуточ- ных таблиц проводили с использованием программных ресурсов пакета Microsoft Office 2010. Статистический анализ и визуализацию полученных данных осущест- вляли с помощью интегрированных пакетов «MALDIquant», «MALDIquantForeign», «sda» (https://cran.r-project.org/web/packages/rgl/index.html), (http://strimmerlab.org/ software/maldiquant/) языка программирования R (https://cran.r-project.org/) и Mass- Up (http://sing.ei.uvigo.es). Полученные в ходе работы масс-спектры для каждого анализируемого образ- ца использовали для построения дендрограммы средствами программного пакета «MALDIquant», реализованного в среде R, представляющего альтернативу для ин- терпретации данных MALDI-TOF MS. Представление полученных масс-спектров в виде иерархической структуры позволило определить положение каждого отдельно- го спектра на основании величины сходства характеристик его пиков от средних значений характеристик в группе спектров. Результативность кластерного анализа достигается использованием метрики дистанций d (х, у), при этом расстояние меж- ду объектами одной группы в целом будет меньше «e», а между объектами из разных групп больше «e», где «e» > 0 — задаваемый уровень сходства. Построение собственного дерева для каждой повторной выборки с вычислени- ем частоты встречаемости всех фрагментов в сформированной последовательности производили с использованием бутстреп-вероятности BP. Гипотезу о существовании кластера считали достоверной, если с ветвями бутстрепного дерева связывалась ве- роятность, превышающая 70%. Построение дендрограммы проводили в евклидовом пространстве на основании данных матрицы признаков «featureMatrix». В качестве метода для создания классификаций масс-спектров использовали анализ главных компонентов (principal component analysis, РСА), основное преиму- щество которого заключается в том, что из совокупности характеристик объекта наблюдения (в данном случае — масс-спектр образца) выбирают наиболее вариа- бельные величины (с точки зрения исследователя), значения которых откладывают по осям трехмерной системы координат (главные компоненты) и на пересечении перпендикуляров из этих осей ставят точку. Используемое программное обеспече- ние позволило представить РСА-кластер в трехмерном пространстве. В качестве маркеров использовали сигналы, p-значение которых было меньше 0,05 (https://www.sing-group.org/mass-up/manual). Частоту встречаемости каждого потенциального маркера рассчитывали с использованием пакета прикладных про- грамм Statistica v 10.0. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Оценку особенностей белковых профилей экстрактов крови мышей, заражен- ных бруцеллами, проводили при сравнении с масс-спектрами отрицательного кон- троля (кровь мышей из контрольной группы). Каждый образец анализировали в четырех повторах. По результатам качественного и количественного анализа данных наименьшее количество пиков (40±2) содержали масс-спектры экстрактов крови животных, зара- женных B. suis 1330. Наиболее представительные спектры (79±3 и 69±3) были полу- чены для образцов крови мышей, которым вводили B. abortus 544 и B. melitensis 548, соответственно. На масс-спектрах белковых экстрактов крови мышей из групп сравнения ос- новное число сигналов было локализовано в двух областях значений масс рабочей области: 2,6—8,5 и 13,5—16,0 kDa. В результате сравнительного анализа белковых профилей образцов отрицательного контроля были установлены общие фрагменты, значения абсолютной интенсивности которых варьировало в диапазоне от 250 до 2,0 х 104 a.i. (m/z ± 5 Da): 2683, 2739, 2925, 3140, 3327, 4195, 4286, 5005, 5660, 6908, 7228, 7506, 11682, 14992, 15001. Разрешение для перечисленных сигналов находи- лось в диапазоне от 205 до 436, отношение сигнал/шум — от 6/1 до 19/1, ширина пика на полувысоте — от 11 до 52, частота регистрации составляла ≥0,99. Указанные значения параметров полученных масс-спектров являются приемлемыми для диф- ференциации аналитически значимых фрагментов из всего массива сигналов. При этом, области m/Z, содержащие сигналы с высоким значением абсолютной интен- сивности, перекрывались с областями значений масс, в которых регистрировались специфичные для представителей рода Brucella пики, что затрудняло выявление бруцелла-специфичных сигналов на масс-спектрах экстрактов крови мышей, зара- женных возбудителем бруцеллеза. Основное количество зарегистрированных пиков на масс-спектрах белковых экстрактов лейкоцитарной фракции крови мышей, зараженных возбудителем бру- целлеза, было расположено в интервале значений масс 2,0 — 8,3 и 14,5-1,6 kDa рабо- чей области. Анализ MALDI-TOF масс-спектров белковых экстрактов лейкоцитов крови инфицированных животных всех групп позволил выявить общие пики (m/z ± 5 Da): 2250, 2581, 3025, 3640, 3696, 3754, 4545, 6672, 7905, 8351, 14504 (курсивом отмечены родоспецифичные маркеры возбудителя бруцеллеза). Интенсивность ука- занных фрагментов находилась в диапазоне от 300 до 6000 a.i., разрешение — от 269 до 534, отношение сигнал/шум — от 8/1 до 24/1, ширина пика на полувысоте — от 6 до 59. Указанные параметры общих сигналов позволяют достоверно их дифференци- ровать от совокупности всех пиков. Частота регистрации шести родоспецифичных сигналов бруцелл, отличающихся по абсолютной интенсивности, составляла 0,98. В ходе сравнительного анализа белковых профилей экстрактов лейкоцитов крови мышей, инфицированных культурой B. abortus 544, были установлены специ- фичные для этой группы сигналы (m/z ± 5 Da): 2322, 2334, 4941, 6257, 10781, 10798, 11000, 12117, 13609. На масс-спектрах белковых экстрактов лейкоцитов крови жи- вотных, зараженных B. melitensis 548, было выявлено 2 общих сигнала (m/z ± 5 Da): 2264, 8378. Наибольшее количество уникальных фрагментов отмечено на белковых профилях экстрактов крови мышей 3 группы (B. suis 1330) (m/z ± 5 Da): 2133, 2422, 2455, 2545, 2754, 3050, 3107, 3268, 3842, 3885, 3902, 3927, 3970, 4067, 4796, 4856, 4871, 4896, 5114, 5219, 5235, 5250, 6621, 6640, 7106, 7155, 7172, 7336, 7360, 7386, 7550, 7777, 7854, 7992, 8917, 10289, 10332, 12699, 14256, 14346, 14362, 14468, 14698, 14864, 15858, 15904. Очевидно, что заражение модельных животных возбудителем бруцеллеза со- провождается появлением специфичных сигналов на соответствующих белковых профилях экстрактов крови. Визуализация данных, пост- роенная методом PCA с исполь- зованием ресурсов статистичес- кого программного обеспечения Mass-Up (рис. 1) отражает рас- пределение проб крови искусст- венно инфицированных живот- ных компактно и дискретно от крови мышей из группы сравне- ния в виде совокупности точек в пространстве (РСА-кластер).

Рис. 1. Диаграмма распределения масс-спектров экстрактов лейкоцитов крови мышей, зараженных культурами B. abortus 544, B. melitensis 548 и B. suis 1330, а также из группы сравнения на основании результатов анализа MS профилей методом PCA

На диаграмме можно отме- тить четкое разделение белковых профилей экстрактов крови мы- шей при остром бруцеллезе на две группы: первую образуют жи- вотные, зараженные культурами B. abortus 544 и B. melitensis 548, во вторую вошли животные, инфицированные B. suis 1330. Распределение образцов на ос- новании MS данных полностью совпадает с видовой принадлеж- ностью используемых при зара- жении штаммов бруцелл. Формирование отдельного кластера образцами лейкоцитарной фракции крови животных, зараженных B. abortus 544 и B. melitensis 548, на дендрограмме (рис. 2) в полной мере согласуется с общеизвестными данными о генетической близости представителей указанных двух видов бруцелл и с результатами на основании ана- лиза сходства белковых профилей их культур.

Рис. 2. Дендрограмма масс-спектров проб крови мышей из групп сравнения

Образцы отрицательного контроля формировали отдельную группу. Пробы крови животных, зараженных культурами B. suis 1330, также формировали компактную группу, по сравнению с образцами крови мышей, зараженных культурами B. abortus 544 и B. melitensis 548. Возможно, подобное расположение является следствием того, что белковые профили проб лей- коцитов крови животных, зараженных культурами B. suis 1330, характеризовались наименьшей представительностью (количество и интенсивность сигналов) по срав- нению с образцами от животных, зараженных B. abortus 544, B. melitensis 548. Таким образом, в ходе работы была подтверждена возможность прямого вы- явления специфичных маркеров возбудителя бруцеллеза в биоматериале методом MALDI-TOF MS без этапа выделения чистой культуры или накопления возбудителя в образце на стадии подроста гемокультур на питательных средах. В результате срав- нительного анализа белковых профилей экстрактов лейкоцитов крови животных при остром бруцеллезе описано 6 общих родоспецифичных сигналов Brucella spp. (m/z ± 5 Da): 2581, 3025, 3696, 3754, 4545, 6672, позволяющих достоверно опреде- лить образцы инфицированных бруцеллезом животных. Результаты MALDI-TOF MS исследования культур возбудителя бруцеллеза подтверждают сложность проведения межвидовой дифференциации близкородс- твенных видов бруцелл на основе данных белкового профилирования. Вместе с тем, на основании полученных данных, распределение спектров проб лейкоцитарной фракции крови животных, инфицированных разными видами бруцелл, на постро- енной дендрограмме полностью согласуется с видовой принадлежностью исследуе- мых штаммов. Присутствие различий на белковых профилях экстрактов лейкоци- тов крови мышей, инфицированных культурами возбудителя бруцеллеза, очевидно, обусловлено не только индивидуальными особенностями используемых культур бруцелл разных видов, но и их адаптивными изменениями в организме животных в условиях персистенции возбудителя. Следовательно, при нахождении в организме хозяина возбудитель инфекции подвергается воздействию иммунной системы, что, вероятно, обусловливает синтез патогеном определенных белков, экспрессия кото- рых вне организма хозяина отсутствует. Описанные родо- и видоспецифичные для бруцелл особенности масс-спектров экстрактов лейкоцитов крови при остром бруцеллезе могут быть использованы при разработке эффективного методического подхода для индикации и идентификации возбудителя бруцеллеза в клиническом материале и биоматериале от сельскохозяйс- твенных животных с использованием MALDI-TOF MS. Таким образом, результаты экспериментального исследования позволяют го- ворить о высокой диагностической информативности метода MALDI-TOF MS для прямого выявления белковых маркеров бруцелл в биоматериале и последующего определения их видовой принадлежности, что требует дальнейших исследований. Впервые охарактеризованы ассоциированные с бруцеллезной инфекцией 11 белко- вых маркеров, в том числе 6 родоспецифичные для микроорганизмов рода Brucella spp., которые могут быть использованы при разработке эффективного методическо- го подхода для диагностики бруцеллеза методом MALDI-TOF MS.