THE IMMUNOBIOLOGICAL ACTIVITY OF THE COMPLEX PREPARATION AGAINST HAEMOPHILUS INFLUENZAE INFECTION

Cover Page


Cite item

Abstract

Aim. To study the immunobiological activity of the complex preparation for Haemophilus influenzae infections prevention. Materials and methods. We used the complex preparation, containing 1 mcg of lipooligosaccharide and 10 mcg of protein-containing fraction, lipooligosaccharide and protein-containing fraction monopreparations, and capsular polysaccharide preparation. For studying cross-protective activity of the complex preparation white outbread mouses (weight 14-16 g) were intramuscularly immunized with a dose 0,5 ml. 10 days later the animals were inoculated with H. influenzae encapsulated and non-typed strains culture inoculum in a dose 5*109 microbial cells/mouse. The immunized animals specific antibodies level was determined by means of indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). For studying complex preparation’s influence on the development of the infectious process immunized mouses were intranasally inoculated with H. influenzae encapsulated and non-encapsulated strains. The mouses dissections were performed in 3, 24 and 72 hours after inoculation. Sterile samples (lung tissue) were homogenized, titrated and plated onto 5% horse blood agar; then after 18-20 growth hours we counted the number of colonies and recalculated its number for one mouse. Results. Our investigations have shown that the complex preparation provided 90-100% animals’ defence from used in this experiment infectious agent strains. Mouses immunization with the preparation induced significant increase in the level of antibodies, revealed by means of indirect ELISA. Beginning with the third day after intranasal inoculation there was a pathogen multiplica112 tion in control group mouses lungs. In the same time immunized mouses had almost indetectable number of bacteria. Almost all animals from control group contained pathogen in lymph nodes and mesentery; though pathogen’s presence in immune mouses viscera was rather occasional. Conclusion. The complex preparation protected animals from all H. influenzae strains, used in our experiment. The dynamic of the infectious process directly depended on the development of immune response on the complex preparation injection. 

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том,
что инфекции, вызываемые Н. influenzae, имеют широкое распространение на тер-
ритории России и являются актуальной проблемой здравоохранения [4]. Для про-
филактики инфекций, вызываемых капсульными штаммами (Hib), применяется ко-
нъюгированная вакцина Акт-ХИБ (Авентис Пастер, Франция). Для профилактики
инфекций, вызываемых бескапсульными штаммами (NTHi), вакцины не существует.
Между тем, распространенность, частота генерализации, тяжесть течения заболева-
ний и высокая летальность при инфекциях, обусловленных штаммами H.influenzae,
принадлежащими к разным серотипам, требует разработки именно такой вакцины
для специфической профилактики [8].
Описаны исследования, авторы которых химическим способом конъюгировали
относительно консервативные детоксицированные липоолигосахариды с белками
для формирования вакцин [7]. Эти конъюгаты были иммуногенны для мышей и
кроликов и вызывали Т-зависимую иммунологическую защиту. Для создания ново-
го вакцинного препарата, направленного на профилактику гемофильной инфекции,
вызываемой как капсульными, так и бескапсульными штаммами H.influenzae, могут
быть использованы липоолигосахариды, препараты, содержащие белки наружной
мембраны, а также комбинация некоторых из них [5]. Основываясь на ранее про-
веденных исследованиях, в НИИВС им. И.И. Мечникова проведена НИР по разра-
ботке комплексного препарата, предназначенного для профилактики гемофильной
инфекции. Целью настоящего исследования явилось изучение иммунобиологичес-
кой активности разработанного препарата.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
В работе использованы комплексный препарат, содержащий 1 мкг липоолиго-
сахарида (ЛОС) и 10 мкг белоксодержащей фракции (БСФ), а также монопрепараты
ЛОС, БСФ и препарат капсульного полисахарида (КПС). Препарат ЛОС получали
экстракцией раствором хлорида натрия [1]. По данным субтипирования ЛОС при-
надлежит к наиболее распространенному бескапсульному штамму (№45 NTHi).
Белоксодержащую фракцию получали методом водной экстракции (БСФ-ВЭ) [3].
Метод экстракции дополняли этапом очистки от нуклеиновых кислот с последу-
ющим диализом и очисткой от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией.
Капсульный полисахарид H.influenzae получали из культуральной жидкости экстра-
кцией цетавлоном. Все препараты получены из микробных культур штаммов-про-
дуцентов H.influenzae в лаборатории иммунохимической диагностики НИИВС им.
И.И. Мечникова. Монопрепараты использовали как препараты сравнения.
Для изучения протективной активности комплексного препарата аутбредным
мышам массой 14-16 г вводили однократно внутримышечно 0,5 мл (доза) препара-
та. Через 10 дней животных заражали живыми культурами H.influenzae капсульного
(№1095) и бескапсульных штаммов (№45, №58, №65) в дозе 5×109 микр.кл./мышь.
Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней, регистрируя смертность.
Уровень специфических антител у иммунизированных животных выявляли в
непрямом варианте ИФА. В качестве отрицательного контроля использовали сыво-
ротки интактных животных.
Для изучения влияния комплексного препарата на развитие инфекционного
процесса иммунизированных мышей интраназально заражали культурами кап-
сульного и бескапсульного штаммов H.influenzae [6]. Контрольной группе вводили
физиологический раствор. Вскрытие животных проводили через 3, 24, 48 и 72 ча-
са. Стерильно отобранный материал (ткань легкого) гомогенизировали, титровали
и мерно высевали на чашки Петри с сердечно-мозговым агаром с добавлением 5%
крови и через 18-20 часов культивирования в термостате при температуре 36,5 °С и
5% СО2 производили подсчет выросших колоний бактерий, после чего пересчиты-
вали число бактерий на мышь.
Р Е З У Л ЬТАТЫ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследования показали, что комплексный препарат обеспечивал защиту 90-
100% животных от штаммов возбудителя, использованных в опыте. ЛОС NTHi 45
также обладал достаточно высокой перекрестной протективной активностью и в до-
зе 1 мкг защищал от заражения капсульным и бескапсульными штаммами (табл. 1).
Добавление ЛОС к КПС стимулировало аналогичный уровень защиты (80-100%),
в то время как введение мышам КПС создавало защиту только к капсульному Hib
штамму. Белковый монокомпонент в дозе 10 мкг обладал меньшим протективным
эффектом и защищал 50-60% мышей. Неожиданным обстоятельством явилось
торможение протективных свойств варианта препарата, состоящего из белкового
компонента и КПС Hib. Его протективная активность в отношении штамма Hib
снижалась до 20-40% В отношении бескапсульных штаммов этот эффект был менее
выраженным, но тоже достоверным (р<0,05).
Иммунизация мышей комплексным препаратом приводила к значимому уве-
личению уровня специфических антител, выявляемых в непрямом варианте ИФА
(табл. 2). При иммунизации животных препаратами сравнения увеличение титров
специфических антител зависело от использованного препарата. Высокий уровень
IgG к ЛОС наблюдался при иммунизации ЛОС и исходной фракцией БСФ-ВЭ,
что свидетельствовало о присутствии в последнем примеси липоолигосахарида.
Иммунизация мышей БСФ-ВЭ приводила к образованию высокого уровня антител
к ЛОС и БСФ-ВЭ. При этом уровень IgG к препарату БСФ был самым высоким.
Высоким был уровень IgG к ЛОС при иммунизации животных смесью БСФ и ЛОС
(ОП=2,6).
Развитие инфекционного процесса, контролируемого по высевам бактерий из
внутренних органов животных, протекало по-разному в контрольной и опытных
группах (рис. 1, 2). В контрольной группе, начиная с третьих суток, наблюдалось
размножение возбудителя в легких. При этом у иммунизированных мышей коли-
чество бактерий, высеваемых из ткани легких, было незначительным в те же сроки
наблюдения. Параллельно с высевами из легких, бактерии высевали из других ор-
ганов (сердце, селезенка, печень, почки, лимфатические узлы брыжейки) Индекс
обсемененности уже через три часа после заражения достигал единицы. Спустя
72 часа после заражения культурой штамма Hib 1095 обсемененность органов в
опытных группах мышей резко снижалась, по сравнению с контролем; при за-
ражении штаммом NTHi 45 возбудитель у опытных мышей не высевался. Через
144 часа наблюдения в органах мышей вновь обнаружен возбудитель в половине
проб. Индекс обсемененности находился в пределах от 0,3 до 0,4. Практически у
всех мышей контрольной группы возбудитель выделялся из лимфатических узлов,
брыжейки, у иммунных мышей этот показатель был значимо ниже.
Инфекции, вызываемые H. influenzae,
являются важной причиной заболе-
ваемости и смертности в экономически
развитых и развивающихся странах,
прежде всего, среди детей раннего воз-
раста. Учитывая распространенность и
тяжелое течение инфекций, вызывае-
мых наиболее вирулентным капсуль-
ным серотипом — Hib, нельзя недооце-
нивать медико-социальную значимость
заболеваний, вызываемых бескапсуль-
ными штаммами гемофильной палочки.
Основными факторами патогенности
таких штаммов являются белки наруж-
ной мембраны и ЛПС. Следует отме-
тить, что штаммы не содержат полно-
ценного липополисахарида, а содержат
липоолигосахарид (ЛОС), лишенный
длинных S-специфических цепей. При
этом липоолигосахарид имеет уникаль-
ную структуру, и среди бескапсульных
штаммов обнаружено более 10 различа-
ющихся по специфичности липоолиго-
сахаридов. Поэтому сахарид-производ-
ные препараты для профилактики гемо-
фильной инфекции должны содержать
множество углеводных структур, чтобы
обеспечить адекватный охват штаммов,
вызывающих инфекции. Вакцина, на-
правленная на поверхностно-представ-
ленные ЛОС, может быть возможным
кандидатом для контроля NTHi инфек-
ций. Однако детоксицированный ЛОС
является Т-независимой молекулой,
слабо иммуногенной in vivo. Вдобавок
к слабой иммуногенности ЛОС гетеро-
генность олигосахаридов и гомология
между углеводными структурами на по-
верхности бактериальных клеток и клеточных мембранах макроорганизма делает раз-
работку NTHi-вакцин нелегким заданием. За рубежом разрабатываются вакцинные
препараты на основе видовых белков наружной мембраны (БНМ) и ЛОС. Все раз-
рабатываемые препараты относятся к типу конъюгированных вакцин, обладающих
свойствами Т-зависимого антигена. На основании данных субтипирования нами вы-
бран наиболее распространенный в популяции бескапсульный штамм H.influenzae —
№45 NTHi [2]. ЛОС 45NTHi обладал наиболее выраженной специфической и пере-
крестной активностью. Кроме того, методом водной экстракции нами получены бе-
локсодержащие фракции (БСФ). Его производный — БСФ-ВЭ-3 хроматографически
очищенный препарат обладал перекрестной серологической активностью, содержал
в своем составе известные протективные белки наружной мембраны H.influenzae
(Р2, Р5, Р6) и обладал низкой токсичностью (LD50~2,0 мкг). Препарат ЛОС защищал
мышей от заражения летальными дозами гетерологичных бескапсульных штаммов.
Добавление ЛОС к КПС стимулировало защиту (80-100%) от заражения капсульным
и бескапсульными штаммами, в то время как введение мышам КПС создавало защи-
ту только к капсульному Hib штамму. БСФ-ВЭ в дозе 10 мкг обладал протективным
эффектом, защищая 50-60% мышей от заражения капсульным и бескапсульными
штаммами H.influenzae. Изучение гуморального ответа на введение комплексного
препарата и препаратов сравнения позволило прийти к заключению о том, что КПС
Hib не стимулирует специфический иммунитет. Отсутствие антителообразования
может свидетельствовать о необходимости замены вида экспериментальной модели.
Кроме того, КПС Hib не стимулирует специфический иммунитет к гетерологичным
штаммам NTHi. Иммунизация мышей ЛОС приводила к значимому (ρ<0,05) увели-
чению уровня антител. Добавление ЛОС к КПС не усиливало антителообразование к
КПС. Добавление к БСФ 1 мкг ЛОС усиливало перекрестную протективность обоих
препаратов (80-100% мышей выживало). Высокий уровень IgG к ЛОС при иммуни-
зации животных смесью БСФ и ЛОС (ОП=2,6) указывает на стимуляцию гумораль-
ного иммунного ответа ЛОС и делает этот антиген значимым в составе комплексного
вакцинного препарата, предназначенного для профилактики инфекций, вызываемых
капсульными и бескапсульными штаммами гемофильной палочки.
Развитие инфекционного процесса изучали на легочной модели заражения [6],
так как по нашему мнению, она разработана с учетом органотропности H.influenzae
к тканям дыхательных путей и легких. После заражения иммунизированных комп-
лексным препаратом животных формирования инфекционного процесса напрямую
зависело от развития иммунного ответа на введение комплексного препарата. Таким
образом, препарат, содержащий 10 мкг БСФ и 1 мкг ЛОС, обладал перекрестной
протективной активностью, защищая 80-100 мышей от заражения летальными до-
зами капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae. Иммунизация мышей
приводила к повышению уровня антител и к ЛОС, и к БСФ.
×

About the authors

N. E. Yastrebova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

M. M. Tokarskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

S. I. Elkina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

N. N. Ovechko

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

S. A. Baranovskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

References

  1. Варбанец Л.Д., Здоровенко Г.М., Книрель Ю.А. Методы исследования эндотоксинов. Киев, Наукова думка, 2006.
  2. Головинская О.В. Иммунобиологические свойства различных углеводсодержащих препаратов Haemophilus influenzae. Автореф. дисc. канд. мед. наук. М., 2011.
  3. Ефремова В.Е., Егорова Н.Б. Токсичность и протективная активность комплексного антигена стафилококка, полученного методом водной экстракции. Журн. микробиол. 1978, 12:59-63.
  4. Онищенко Г.Г. Заболеваемость инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики, в Российской Федерации и задачи по их снижению и ликвидации. Журн. микробиол. 2003, 2:16-28.
  5. Овечко Н.Н., Ястребова Н.Е. Антигены поверхностных структур Hаemophilus influenzae как перспективные кандидат-вакцины, Журн. микробиол. 2017, 4:82-90.
  6. Hoover J.L., Lewandowski T.F., Mininger C.L. et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii. J. Visualized Experiments. 2017, 119, e55068, doi: 10.3791/55068.
  7. Murphy T.F. Vaccines for nontypeable Haemophilus influenzae: the Future Is Now. Clin. Vaccine Immunol. 2015, May; 22(5): 459-466.
  8. Sunakawa K., Takeuchi Y., Iwata S. Nontypeable Haemophilus influenzaе (NTHi) epidemiology. Kansenshogaku Zasshi. 2011, May;85(3) : 227-237.

Copyright (c) 2019 Yastrebova N.E., Tokarskaya M.M., Elkina S.I., Ovechko N.N., Baranovskaya S.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies