Study of the biological properties of attenuated variants of the virulent A/WSN/33 strain of influenza virus, obtained by the site-specific mutagenesis of PB2-gene

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Многолетний опыт использования живых гриппозных вакцин в России и США
показал их высокую эффективность. В настоящее время они успешно используются
в виде холодоадаптированных (ХА) реассортантных вакцин при массовых иммунизациях, особенно детей [1]. В отличие от инактивированных гриппозных вакцин
ХА гриппозные вакцины способны защищать население от дрейфовых вариантов
вируса.
Прямое включение аттенуирующих мутаций в геном актуальных эпидемических штаммов можно рассматривать как новый перспективный подход к получению
живых гриппозных вакцин [4, 7, 16, 17, 20]. Основным источником аттенуирующих
мутаций, согласно данным литературы, рассматривается холодоадаптированный
штамм А/Энн Арбор/6/60 (Н2N2) [10]. Однако использование набора мутаций из
генома этого штамма не позволяло полностью аттенуировать не только пандемический штамм, но также и некоторые вирулентные сезонные варианты вируса гриппа
человека [20]. Для успешного решения этой проблемы целесообразно расширение
арсенала аттенуирующих мутаций. В этой связи, возможно использование охарактеризованных аттенуирующих мутаций, взятых из генома других ХА штаммов вируса
гриппа человека, в частности, ХА штамма А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) [1] и ХА
штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) [2].
Опыты, проведенные некоторыми исследователями [12, 18], показали высокую
эффективность включения сайт-специфических мутаций в РВ2-ген вирулентного
штамма для получения аттенуированных вариантов вируса гриппа А. Применение
этой технологии в отношении РВ2-гена позволило включать в этот ген несколько
аттенуирующих мутаций, что дало возможность контролировать степень аттенуации
вирулентного штамма. Данные, полученные этими авторами, свидетельствовали
также о высокой генетической стабильности некоторых из этих вариантов, полученных с помощью данной технологии. В данной работе мы попытались исследовать аттенуационный потенциал ts-мутаций, локализованных в РВ2-гене всех вышеуказанных ХА штаммов после их прямого включения в различных комбинациях
в геном вирулентного штамма А/WSN/33 (Н1N1, а также изучить иммуногенность
и защитную эффективность полученных сайт-специфических мутантов при гомологичном и гетерологичном контрольном заражении.в сравнении со сходными характеристиками ХА вакцинного реассортанта, имеющего поверхностные антигены.
аналогичные поверхностным антигенам штамма А/WSN/33.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Данные литературы свидетельствовали о том, что генетические детерминанты, ответственные за ts-фенотип и att-фенотип ХА штаммов-доноров вируса
гриппа А, могут быть локализованы в РВ2 —гене [11, 15, 19]. Более поздние исследования выявили конкретные аминокислотные замены в РВ2-белке, ответственные за аттенуацию этих штаммов-доноров [8]. Как видно из табл. 1, ХА штамм
А/Энн Арбор/6/60 имел аминокислотную замену в позиции 265 РВ2-белка [3, 5, 9],
ХА штамм А/Ленинград/134/17/57 — в позиции 478 РВ2-белка [8] и ХА штамм
А/Краснодар /101/35/59 — в позиции 290 РВ2-белка [2]. Все аминокислотные замены являлись следствием замены в триплете одного нуклеотида. С помощью обратной
генетики на первом этапе исследований в геном вирулентного штамма А/WSN/33
были включены одиночные мутации из РВ2-гена ХА штаммов А/Энн Арбор/6/60,
А/Ленинград/134/17/57 и А/Краснодар/101/35/59. Все полученные трансфектанты с единичными заменами в РВ2 гене характеризовались резко выраженным
снижением размножения в куриных эмбрионах при 390
С (shutoff температура).
Последовательное включение дополнительных мутаций в геном вариантов с единичными мутациями приводило к получению двойных мутантов: AAL2 (265+478),
AAK2 (265+290) и LAK2 (478+290). Дальнейшая работа в этом направлении позволила получить вариант с тремя ts-мутациями в РВ2-гене: U2 (265+290+478). Получение ХА реассортанта между штаммом А/WSN/33(H1N1) и ХА штаммом-донором А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) проводили по ранее описанной
стандартной методике [13]. Инактивацию генно-инженерного штамма А/WSN/33
проводили с помощью УФ-облучения (УФ-лампа G8W T5, Germicidal, 288 mm).
В процессе инактивации титр вируссодержащей жидкости снижался на 5,0 lg.
Смешанную инфекцию штаммов А/WSN/33 и А/Краснодар/101/35/59 в куриных
эмбрионах проводили при температуре 300
С в течение 18 часов. Далее проводили
2 селективных пассажа в куриных эмбрионах при 250
С в присутствии антисыворотки к штамму А/Краснодар/101/35/59. Полученный реассортант клонировали
методом бляшек. Анализ генома ХА реассортанта проводили с помощью ПЦР с
использованием дифференцирующих праймеров к штамму А/Краснодар/101/35/59.
Были использованы следующие пары праймеров 5’—3’: PB2-ген: F2-1 (CCCTGT
CCATGTTAGAAACCAAGT), R2-1 (CGCTGAGTTGCCCTAGTAACGA), РB1-ген:
F1-1 (AGCACAAGCAGGCAAACCAT), R2-1 ( CAATCTGTGTGCTGTGG), PA-ген;
F1 (AGCAAAAGCAGGTACTGATC), R2 (TGGATGTGTGTCTTCTCAGA), NP-ген:
F4-1 (GCCAGTGGGTACGACTTCGA), R2 (CTGATTTGACCTGCAGAG), Mген: F1 (AGCAAAAGCAGGTAGATATTG), R2 (TGCAAGATCCCAATGATACTC),
NS-ген: F1 (AGCAAAAGCAGGGTGAC), R1 (CCCATTCTCATTACTGCTTC). РЗГА
с использованием антисывороток к серотипам Н1 и Н2 показала, что НА-белок ХА
реассортанта относится к серотипу Н1 (антисыворотка к Н1- 1:1024, антисыворотка
к Н2- 1:20). Секвенирование NA-гена ХА реассортанта показало его принадлежность к серотипу N1.
Вирулентный генно-инженерный штамм r A/WSN/33 (H1N1) был получен с помощью трансфекции из плазмид pHW2000 со вставками генов штамма А/WSN/33
(H1N1), предоставленных доктором Вебстером (Мемфис, США). Для проведения
данной работы был также получен холодоадаптированный реассортант путем скрещивания ХА штамма А/Краснодар /101/35/59 (Н2N2) и вирулентного штамма вируса гриппа А/WSN/33 (H1N1). Реассортант унаследовал 6 «внутренних» генов от ХА
штамма-донора и 2 гена, кодирующих поверхностные НА и NA-белки от штамма
А/WSN/33. При гомологичном контрольном заражении был использован вирулентный штамм А/WSN/33(H1N1). При гетерологичном контрольном заражении использовали штамм А/Утка Пенсильвания/10218/1984(Н5N2) вируса гриппа птиц
(Н5N2), адаптированный к мышам [14].
Все использованные в работе вирусы и сайт-специфические мутанты поддерживали путем пассажей в 10 — 11-дневных куриных эмбрионах. Активность репродукции вирусов гриппа при разной температуре инкубации оценивали по результатам
титрования в КЭ, инкубированным при 340
С, 370
С, 380
С, 390
С и выражали в RCT
(reproductive capacity at different temperatures). RCT39= (lg ЭИД50/0,2 мл при 340
С — lg
ЭИД50/0,2 мл при 390
С). Вирусы считались температурочувствительными (ts-фенотип), если RCT39 был более 5.0 lg ЭИД50/0,2 мл. Температура, при которой размножение вируса снижалось в 100 раз по сравнению с оптимальной температурой размножения считалось shutoff температурой.
В опытах по трансфекции использовали культуру клеток Т293 и линию клеток
MDCK, полученную из Института Пастера (Франция). Все клетки выращивались
при 37 °С в СО2-инкубаторе. Клеточные культуры пассировались на среде МЕМ
(фирма ПанЭко, Москва), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки и гентамицин в количестве 1 мг на 450 мл среды.
Для генно-инженерных работ со штаммом А/WSN/33 (Н1N1) вируса гриппа использовалась 8-плазмидная трансфекционная система на основе вектора pHW2000.
Каждая из 8 плазмид содержала соответствующий ген вируса гриппа, фланкированный необходимыми регулирующими элементами для сборки вируса в клеточной
культуре при трансфекции [6]. Плазмида pHW2000, а также плазмиды со вставками
генов штамма вируса гриппа А/WSN/33 были предоставлены доктором Вебстером
(Мемфис, США). Для накопления плазмид использовали штамм Escherichia coli
DH5alpha.
Вирусы накапливали в куриных эмбрионах по стандартной методике. Для
последующего выделения РНК вирусы концентрировали центрифугированием.
Вначале аллантоисную жидкость центрифугировали в центрифуге Beckman J2-21
(ротор JA-14) при 6000 об/мин в течение 30 мин для осаждения клеточного дебриса. Вирус осаждали из надосадочной жидкости на высокоскоростной центрифуге
Beckman J2-21 c использованием ротора JA-14 (14000 об/мин, 2,5 часа). Осадок
вирионов ресуспендировали в буфере STE (10mM Tris-HCL, 100 mM NaCL, 1mM
EDTA, pH 7.4) в гомогенизаторе Даунса.
Для последующей постановки ПЦР выделяли вирусную РНК при помощи набора для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови (ООО «Лаборатория Изоген».
Москва).
Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР при помощи ревертазы MMuLV (СибЭнзим, Новосибирск). ПЦР ставили с высокоточной полимеразой Tersus
(«Евроген», Москва). Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой агарозы осуществляли при помощи набора фирмы Fermentas (Thermo Fisher Scientific,
США).
Мутагенез РВ2-гена проводился с помощью двуступенчатой ПЦР. На место введения мутации в последовательности гена подбирались прямой и обратный мутационные праймеры с необходимой заменой. Синтез олигонуклеотидов заказывался
через компанию Евроген. Для контроля длины ПЦР продукта проводился аналитический форез в 1,5% агарозном геле с использованием трис-ацетатного буфера. Для
очистки ПЦР продукта использовали Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit
(кат. № 0702).Клонирование проводили с помощью так называемой GoldenGate рeакции
(web-site: http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone0003647). Использовались рестриктаза Esp3 (BsmB1) (Fermentas / ThermoScientific кат. № ERO451), буфер 10x Fermentas
Tango, T4 ДНК лигаза (Сибэнзим, кат. № Е319) до 5 ед/мкл, дитиотреитол (ДТТ) до
1mM, АТФ до 1mM и линейный вектор со вставкой по 50 нг (молярное соотношение вектор/вставка — 1/3). Реакция проводилась в амплификаторе с программой 15
циклов по 5 минут при 370
С и 5 минут при 170
С.
Трансформацию проводили на рубидиевых компетентных бактериальных клетках штамма DH5a. После разморозки во льду к клеткам добавлялась 1/2 часть лигазной смеси. Далее суспензию клеток инкубировали 1 час во льду, проводили тепловой шок — 2 минуты при 420
С в водяной бане, инкубировали во льду 2 минуты,
добавляли среду LB без антибиотика и инкубировали в течение 30 мин при 370
С.
Клетки высевались на чашки Петри с 1,5% агаром и средой LB с ампициллином (200
мкг/мл). Чашки Петри инкубировали 16 часов при 370
С. Скрининг клонов проводили при помощи ПЦР с последующим электрофоретическим анализом.
Секвенирование вставок в полученных плазмидах проводилось фирмой
«Евроген» на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500.
Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen)
либо в кокультуре клеток 293Т и MDCK, либо в однодневном монослое клеток 293Т
(плотность клеточного монослоя около 70%).
Изучение att-фенотипа проводили по следующей методике: группы самок мышей (по пять голов на группу) инфицировали интраназально под легким эфирным наркозом анализируемыми вирусами с инфекционным титром 104.5 ЭИД50
(в дозе 50 мкл на мышь). Через 72 часа мышей усыпляли и извлекали легочную
ткань. Из легочной ткани готовили 10% суспензию в ступках с тертым стеклом.
Инфекционный титр вируса в 10 % суспензии легких определяли в куриных эмбрионах и выражали в lg ЭИД50./0,2 мл. Все реассортанты были исследованы в трех
независимых опытах.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием среднего квадратичного отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе работы было проведено сравнительное исследование ts-фенотипа ХА реассортанта А/Краснодар/101/35/59 х А/WSN/33 и вариантов штамма
А/WSN/33, имеющих сайт-специфические мутации в РВ2-гене. Как видно из табл.
2, родительские варианты: ХА штамм—донор А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) и
вирулентный штамм А/WSN/33 (Н1N1) значительно различались по ts-фенотипу.
Штамм А/WSN/33 активно размножался в куриных эмбрионах как при 340
С, так и
при 380
-390
С. При 390
С штамм А/WSN/33 крайне незначительно снижал репродуктивную активность. ХА штамм А/Краснодар/101/35/59 активно реплицировался в
куриных эмбрионах при 340
С, однако резко снижал темпы репродукции при 380
С
и 390
С. ХА реассортант, полученный при скрещивании этих родительских вариантов, унаследовал от ХА штамма-донора высокую репродуктивную активность и, в
отличие от штамма А/WSN/33, неспособность к активному размножению при 380
С
и 390
С. Все полученные сайт-специфические мутанты с единичными аминокислотными заменами в РВ2-белке заметно снизили способность к размножению в куриных эмбрионах при 390
С. Включение дополнительных ts-мутаций в РВ2-ген штамма
А/WSN/33 приводило к получению двойных мутантов, которые характеризовались
дальнейшим изменением ts-фенотипа. Все двойные мутанты утеряли способность к
размножению в куриных эмбрионах при 390
С, и было отмечено снижение способности двойных мутантов к размножению в куриных эмбрионах при 380
С (shutoff
температура снизилась до 380
С). Наиболее выраженное изменение ts-фенотипа наблюдалось у трансфектанта U2 c тремя ts-мутациями в геноме. Shutoff температура
данного вируса приблизилась к 370
С.Исходный вирулентный штамм А/WSN/33 активно размножался в легких
мышей при интраназальном размножении. Через 72 часа после начала инфекции титр вируса в легких равнялся lg 5,0±0,4, ЭИД50/0,2мл. ХА штамм-донор А/
Краснодар/101/35/59 практически утерял способность к размножению в легких
мышей. ХА реассортант, полученный при скрещивании штамма А/WSN/33 и ХА
штамма А/Краснодар/101/35/59, не отличался от ХА штамма-донора по att-фенотипу. Трансфектанты с включением единичных мутаций в РВ2-гене характеризовались
заметным снижением размножения вируса в легких (табл. 2), в отличие от исходного вирулентного штамма. Трансфектанты с двойными мутациями в РВ2-гене (ААL2,
AAK2, LAK2), а также трансфектант U2 утеряли способность к размножению в легких мышей.
Группы мышей были интраназально иммунизированы двукратно дозой 104.0
ЭИД50 трансфектантами U2, LAK2, AAL2, AAK2, трансфектантом №20 (V478L) и ХА
реассортантом А/Краснодар/101/35/59 х A/WSN/33. Мышам контрольной группы
двукратно интраназально вводили физраствор. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь и определяли титр антител, ингибирующих гемагглютинацию. Анализируемые вирусы индуцировали у иммунизированных мышей
различный уровень гуморальных антител. Наиболее высокие титры антител наблюдались в крови мышей, иммунизированных трансфектантами LAK2, AAK2, U2 и
ХА реассортантом (log2 7,61±0,87; 7,65±0,54; 7,55±0,54; 8,05±0,61). Трансфектант
№11 (V478L) и AAL2 индуцировали более умеренный титр гуморальных антител
(log2 7,05±0,5; 6,85±0,44). На следующем этапе через 10 дней после второй иммунизации мыши были инфицированы интраназально 10 MLD50 (103.0 ЭИД50) штамма А/WSN/33. Через 72 часа у мышей были извлечены легкие и было исследовано
размножение вируса в легких у мышей, иммунизированных анализируемыми вирусами. У неиммунизированных мышей из контрольной группы титр размножения
вирулентного вируса достигал 4,5 lg ЭИД50/0,2 мл. У мышей, иммунизированных
ХА реассортантом, наблюдалось полное подавление размножения вируса в легких.
Аналогичный результат наблюдался во всех группах мышей, иммунизированных
сайт-специфическими мутантами штамма А/WSN/33.
Представляло интерес провести сравнительное исследование защитной эффективности полученных нами сайт-специфических мутантов штамма А/WSN/33
и классического ХА реассортанта против вируса гриппа другого серотипа. С этой
целью группы мышей, иммунизированных вышеупомянутыми вирусами, и мыши
контрольной группы через 10 дней после второй иммунизации были интраназально
инфицированы штаммом А/Утка/ Пенсильвания/ 10218/ 1984/ вируса гриппа птиц
(Н5N2), адаптированного к мышам [14]. Инфицирующая доза составляла 10 МЛД50.
(103.0 ЭИД50). У части мышей из каждой группы была исследована сыворотка крови
на наличие антител к вирусу птичьего гриппа серотипа Н5N2 Как видно из табл. 3, у
иммунизированных мышей и мышей из контрольной группы не были обнаружены
антитела к вирусу гриппа птиц Н5N2. Интраназальное инфицирование мышей контрольной группы вирусом птичьего гриппа вызывала 100% летальность на 8-9 сутки
после инфицирования; 50% летальность наблюдалась в группе мышей, иммунизированных трансфектантом № 11, имеющим в РВ2-белке мутацию Val 478 Leu; 25%
летальность была отмечена в группе мышей, итммунизированных трансфектантом
AAL2, имеющим 2 мутации в РВ2-белке (265+478). Остальные 4 группы мышей,
иммунизированных мутантами U2, LAK2, AAK2 и ХА-реассортантом, характеризовались 100% выживаемостью. Мы исследовали интенсивность размножения вируса
птичьего гриппа Н5N2 в легких мышей каждой группы. Как видно из табл. 3, наибольшая интенсивность размножения наблюдалась в легких мышей контрольной
группы: 104.5 ЭИД50/0,2 мл. Однако в легких мышей из других групп мы наблюдали
довольно значительное размножение вируса (табл. 3). С учетом полного отсутствия
антител к вирусу гриппа птиц в крови иммунизированных животных высокую выживаемость мышей можно было объяснить только индуцированной активностью
клеточного иммунитета.
Анализ распределения мутаций в геноме ХА штаммов-доноров аттенуации
вируса гриппа свидетельствовал о том, что наиболее важные мутационные замены
сосредоточены в белках полимеразного комплекса: РВ1, РВ2, РА. Однако эффективность прямого включения аттенуирующих мутаций в гены, кодирующие белки
полимеразного комплекса, различна. Это обусловлено структурно-функциональными свойствами этих белков. Белок РВ2 обладает высокой пластичностью, и это
позволяет включить в этот белок различное количество мутаций. Последнее обстоятельство дает возможность сохранять баланс между требуемым уровнем аттенуации
и высокой иммуногенностью.
Включение в РВ2-ген штамма А/WSN/33 единичных мутаций из генома ХАштаммов доноров аттенуации приводило незначительным изменениям ts-фенотипа
и att-фенотипа. Однако при увеличении количества включенных в РВ2-ген ts-мутаций, полученные мутанты полностью утеряли способность к репликации при
повышенной температуре и размножению в легких мышей при интраназальном заражении. Интраназальная иммунизация мышей полученными сайт-специфически-ми мутантами индуцировала заметный титр гуморальных антител, ингибирующих
гемагглютинацию. Большинство сайт-специфических мутантов с двумя и тремя
мутациями в РВ2-гене не уступало по защитной эффективности ХА-реассортанту,
имеющему поверхностные антигены, аналогичные поверхностным антигенам штамма А/WSN/33 как при гомологичном, так и гетерологичном контрольном заражении.
Важнейшим условием дальнейшего изучения и практического использования полученных мутантов является анализ их генетической стабильности. Данные, полученные Parkin N. et al. и Subbarao E.K. et al. [12, 18] указывают на важность определенного
количества мутаций в РВ2-гене, гарантирующего отсутствие реверсий к дикому типу.
Дальнейшие усилия нашей лаборатории будут сосредоточены на этом направлении.

About the authors

V. Yu. Kost

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow.

Russian Federation

A. A. Rtischev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow.

Russian Federation

R. R. Mintaev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow.

Russian Federation

I. I. Akopova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow.

Russian Federation

K. V. Lisovskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow.

Russian Federation

S. G. Markushin

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Moscow.

Russian Federation

References

Supplementary files