CULTIVATION OF BORDETELLA PERTUSSIS BIOFILMS ON ABIOTIC SUBSTRATE

Cover Page


Cite item

Abstract

Aim. Selection of optimal conditions for the cultivation of Bordetella pertussis biofilms and comparative assessment of the ability of different strains to form biofilms. Materials and methods. Used a vaccine strain of B. pertussis № 475 and selected from this strain strain № 475а, characterized by high virulence. Cultures of strains grown on dense nutrient medium (DNM) and liquid nutrient medium (LNM) were used as inoculates for biofilms production. The intensity of biofilms formation in round-bottom 96-well polystyrene plates was estimated by staining with 0,1% gentian-violet solution. Results. Daily cultures of the strain № 475 with LNM formed moderate biofilms in the range of doses 5 — 1,25 IOU (international optical units) /ml, in the absence of growth at lower doses. The daily cultures of this strain with the DNM formed a dense biofilms when planting a doses in the range from 10 to 1,25 IOU/ml, moderate from 0,625 to 0,157 IOU/ml and weak biofilms at a dose of 0,079 IOU/ml. Strain № 475а with the DNM formed dense biofilms in the doses range of 10 to 0,04 IOU/ml and only at the dose of 0,02 IOU/ml were formed moderate biofilms. Conclusion. A simple and informative method has been developed to evaluate the ability of B. pertussis strains to form biofilms in polystyrene plates. Cultures obtained with the DNM formed a more significant biofilms than cultures with LNM. Identified high ability to biofilms formation by a selected strain №. 475a, compared to the original strain № 475.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Эпидемический процесс коклюшной инфекции, несмотря на высокий уровень
противококлюшной вакцинации, продолжается во многих странах мира. По данным
ВОЗ, в 2008 г. в мире было зарегистрировано 16 млн случаев заболевания коклюшем,
195 тысяч детей погибли от него. В 2011 г. в мире зарегистрировано 162 047 случаев
заболевания коклюшем, из них тяжелых 38 040 [1].
Исследования, проведенные во многих странах мира, показали, что основны-
ми причинами роста заболеваемости коклюшем является несоответствие генотипов
B. pertussis циркулирующих штаммов генотипам вакцинных штаммов B. pertussis,
вследствие адаптации бактерий к вакцинированной популяции, что привело к сниже-
нию иммунитета и возникновению вспышек заболевания коклюшем. Мутации в ге-
нах, кодирующих основные факторы вирулентности, аллельный полиморфизм и ре-
дукция генома B. pertussis привели к появлению циркулирующих штаммов B. pertussis,
несущих в генотипе ptxP3 аллель оперона коклюшного токсина, отличающийся
повышенной вирулентностью и ассоциирующийся с увеличением заболеваемости
коклюшем [9, 11]. При этом, одним из возможных факторов высокой вирулентности
циркулирующих штаммов может быть их повышенная способность к формированию
биопленок. Обсуждается также возможность продукции биопленочными формами
B. pertussis новых антигенов, не входящих в состав современных вакцин [6 — 8].
В настоящее время доказана роль микробных биопленок в развитии целого ряда
инфекций человека. Установлено, что различные виды бактерий формируют биоплен-
ки на любых биотических и абиотических субстратах. Биопленочные формы бактерий
отличаются от планктонных измененным спектром экспрессии генов и обладают по-
вышенной устойчивостью к факторам внешней среды (антибиотикам, дезинфектан-
там, иммунным факторам) [3]. Способность коклюшного микроба формировать био-
пленки в биотических и абиотических условиях, механизмы формирования биопле-
нок, их структура и функция изучены до настоящего времени недостаточно. Изучение
закономерностей формирования биопленок B. pertussis, анализ способности штаммов
коклюшного микроба с различными генотипическими характеристиками к формиро-
ванию биопленок может внести существенный вклад в изучение патогенеза коклюша
и совершенствование средств профилактики этой инфекции.
Цель работы заключалась в выборе оптимальных условий культивирования для
образования биопленок B. pertussis и сравнительная оценка способности разных
штаммов формировать биопленки.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Биопленочные формы B. pertussis культивировали в 96-луночных пластиковых
планшетах в соответствии с ранее описанным методом [10] в нашей модификации.
В опытах использовали вакцинный штамм № 475 (серовар 1.2.3) и селекциониро-
ванный из этого штамма штамм № 475а [5]. В качестве инокулята для получения
биопленок использовали ночную культуру штаммов, выращенных на плотной пита-
тельной среде («Бордетелагар», ГНЦПМБ, г.Оболенск) и жидкой (шуттелируемой)
синтетической питательной среде [4]. Концентрацию микробных клеток (МОЕ/мл)
определяли с помощью отраслевого стандартного образца мутности (ОСО42-28-85-
08 П, 10 МЕ, Научный центр экспертизы средств медицинского применения).
Культуры, выращенные на жидкой и плотной питательных средах, доводили до
концентрации микроорганизмов 20 МОЕ/мл. Затем коклюшные культуры титрова-
ли в пробирках с жидкой синтетической питательной средой начиная с 10 МОЕ/мл
до 0,01 МОЕ/мл с двукратным интервалом. Каждое разведение культур в объеме 200
мкл вносили в 4 — 8 лунок круглодонных 96-луночных планшетов (Nunc, Дания).
Дополнительно в 4 — 8 лунок вносили жидкую синтетическую питательную среду
в качестве негативного контроля. Планшеты накрывали крышкой и выдерживали в
термостате при 370С в течение 24 и 48 ч. После окончания культивирования бактерий
из лунок планшета осторожно удаляли питательную среду с планктонными клетка-
ми. Затем лунки с биопленками промывали 2-3 раза стерильным фосфатно-солевым
буферным раствором рН 7,2. После этого в каждую лунку добавляли по 200 мкл 0,1%
раствора генциан-фиолетового. Планшеты выдерживали с красителем в течение
10-15 минут при комнатной температуре, после чего удаляли из лунок несвязавший-
ся краситель, тщательно промывая планшеты водопроводной водой. Планшеты пе-
реворачивали на фильтровальную бумагу вверх дном и высушивали при комнатной
температуре. Затем в лунки добавляли 95% этиловый спирт в объеме 200 мкл. Через
2-3 мин содержимое лунок переносили в чистые 96-луночные плоскодонные план-
шеты («Linbro») и измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 620 нм с
помощью вертикального спектрофотометра «Multiskan FC», Finland. Интенсивность
образования биопленок оценивали по показателям ОП окрашенного растворителя
по отношению к негативному контролю как плотные (t>4), умеренные (t≤4), слабые
(t≤2), отсутствие биопленок [2]. Статистический анализ проводили с использованием
пакета прикладных программ Excel (Microsoft, США) с применением параметричес-
ких методов сравнения при нормальном распределении (t-критерий Стьюдента).
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
На первом этапе исследований были разработаны оптимальные условия обра-
зования биопленок микробными клетками B. pertussis: интенсивность образования
биопленок при различных концентрациях клеток при засеве на 96-луночные поли-
стироловые планшеты, длительность культивирования. Также было проведено срав-
нительное изучение способности формирования биопленок культурами B. pertussis,
выращенными в жидкой и плотной питательных средах. Полученные результаты
приведены в табл. 1. Результаты опытов выявили существенные различия между ин-
тенсивностью образования биопленок культурами штамма № 475, выращенными в
жидкой и плотной питательных средах.
При этом культуры, полученные с плотной питательной среды, формировали
более выраженные биопленки, чем культуры с жидкой питательной среды. Суточные
культуры с жидкой питательной среды формировали умеренные биопленки в диапа-
зоне доз 5 — 1,25 МОЕ/мл при отсутствии роста на более низких дозах. Увеличение
срока культивированиия до 48 ч сопровождалось некоторым увеличением интен-
сивности образования биопленок. Плотные биопленки формировались при дозах
5-1,25 МОЕ/мл, а умеренные в дозах 0,625 — 0,157. Суточные культуры с плотной
питательной среды формировали плотные биопленки при посевных дозах от 5 до
0,625 МОЕ/мл, а умеренные в дозах 0,313-0,079 МОЕ/мл. При увеличении срока
культивирования до 48 ч были получены плотные биопленки при всех испытанных
посевных дозах (5-0,04 МОЕ/мл). Таким образом, оптимальный срок культивиро-
вания, позволяющий оценить интенсивность образования биопленки B. pertussis,
составил 24 ч.
После отработки условий культивирования мы провели сравнительное изуче-
ние способности образования биопленок двумя штаммами B. pertussis: вакцинным
штаммом № 475 и селекционированным из него штаммом № 475а. Полученные
с плотной питательной среде культуры штаммов выращивали в полистироловых
планшетах фирмы Nunc в течение суток. Приведенные в табл. 2 данные указыва-
ют на значительные различия между исследованными штаммами по интенсивности
образования биопленок. Исходный штамм № 475 формировал плотные биопленки
при посевной дозе в диапазоне от 10 до 1,25 МОЕ/мл, умеренные от 0,625 до 0,157
МОЕ/мл и слабые биопленки в дозе 0,079 МОЕ/мл. При более низкой посевной
дозе формирования биопленок не происходило. Селекционированный штамм отли-
чался от исходного повышенной способностью образования биопленки. Плотные
биопленки формировались при посевной дозе в диапазоне от 10 до 0,4 МОЕ/мл и
только при дозе 0,02 МОЕ/мл формировались умеренные биопленки.
Таким образом, нами был разработан достаточно простой и воспроизводимый
метод, позволяющий оценивать способность штаммов B. pertussis формировать био-
пленочные культуры на абиотическом субстрате. Установлено оптимальное время
культивирования, проведено сравнительное изучение интенсивности образования
биопленок культурами, выращенными на жидкой и плотной питательных средах.
Более интенсивной рост биопленок культур, полученных с плотной питательной
среды, по сравнению с планктонными культурами, может быть обусловлен особен-
ностью экспрессии поверхностных структур, ответственных за адгезию микробных
клеток на субстрате. Важное значение имеют выявленные нами выраженные отли-
чия между штаммами № 475 и № 475а по способности к формированию биопленок.
Штамм № 475а был селекционирован из исходного штамма № 475 и отличался от
него повышенной вирулентностью и повышенным уровнем продукции коклюшно-
го токсина [5]. Таким образом, прослеживается определенная связь между интен-
сивностью формирования биопленок и вирулентностью исследованных штаммов.
Повышенная способность к образованию биопленок селекционированным штам-
мом может быть связана с изменением экспрессии факторов, обеспечивающих
прикрепление микробных клеток к субстрату и межклеточные взаимодействия.
Полученные результаты открывают новые возможности в исследовании механизмов
формирования биопленок B. pertussis, вирулентности штаммов с различными гено-
типическими характеристиками и факторов, влияющих на эти процессы.
×

About the authors

E. M. Zaytsev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
MoscowMoscow Russian Federation

M. V. Britsina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation

M. N. Ozeretskovskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

N. U. Mertsalova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

I. G. Bazhanova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

References

  1. Еженедельный эпидемиологический бюллетень. Вакцины против коклюша: документ по позиции ВОЗ, август 2015 г., № 35:433-460. http://www.who.int/wer.
  2. Марданова А.М., Кабанов Д.А, Рудакова Н.Л., Шарипова М.Р. Биопленки: основные методы исследования: учебно-методическое пособие. Казань: К(П)ФУ, 2016.
  3. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина. Журн. микробиол. 2011, 3: 99-109.
  4. Способ глубинного культивирования коклюшных бактерий. Авторское свидетельство № 762431 от 16.05.1980 г.
  5. Штамм бактерий Bordetella pertussis — продуцент коклюшного токсина. Авторское свидетельство №1761795 от 15.05.1992 г.
  6. Cattelan N., Dubey P., Arnal L. et al. Bordetella biofilms: a lifestyle leading to persistent infections. Pathog. Dis. 2016 Feb;74(1):ftv108. doi: 10.1093/femspd/ftv108. Epub 2015 Nov 19.
  7. Cattelan N., Jennings-Gee J., Dubey P. et al. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infect. Immun. 2017 Nov 17;85(12). pii: e00373-17. doi: 10.1128/IAI.00373-17. Print 2017 Dec.
  8. Dorji D., Mooi F., Yantorno O. et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Med. Microbiol. Immunol. 2018 Feb; 207(1):3-26. doi: 10.1007/s00430-017-0524-z. Epub 2017 Nov 21.
  9. King A.J, van Gorkom T., van der Heide H.G. et al. Changes in the genomic content of circulating Bordetella pertussis strains isolated from the Netherlands, Sweden, Japan and Australia: adaptive evolution or drift? BMC Genomics. 2010 Jan 26;11:64.
  10. O’Toole G.A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. 2011; 47: 2437.
  11. Wagner B., Melzer H., Freymüller G. et al. Genetic Variation of Bordetella pertussis in Austria. PLoS One. 2015 Jul 16;10(7):e0132623.

Copyright (c) 2019 Zaytsev E.M., Britsina M.V., Ozeretskovskaya M.N., Mertsalova N.U., Bazhanova I.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies