Pre-clinical study of protective potency of candidate recombinant live pertussis vaccine for intranasal administration

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Коклюш — тяжелое инфекционное заболевание, передающееся воздушно-капельным путем и относящееся к категории управляемых инфекций, контролируемых с помощью вакцинопрофилактики. С начала 1950-хх годов вакцинацию против коклюша во всем мире проводят цельноклеточными коклюшными вакцинами (ЦКВ) в составе АКДС. В начале 1990-х годов в ряде экономически развитых стран ЦКВ заменили на менее реактогенные бесклеточные (ацелюлярные) коклюшные вакцины (БКВ) в составе АаКДС. Однако, несмотря на успехи вакцинопрофилактики коклюша, заболеваемость во всем мире неуклонно растет [9]. Все чаще выявляют коклюш у подростков и взрослых, растет число атипичных форм заболевания и, так называемого, бессимптомного носительства. Клинические изоляты возбудителя коклюша содержат измененные новые генотипы бактерий B. pertussis, позволяющие нивелировать поствакцинальный иммунитет [1, 14]. Краткосрочность протективного иммунитета, индуцированного современными коклюшными вакцинами, также отражается на увеличении заболеваемости в атипичных формах и распространенности коклюша в разных возрастных группах. Сложившаяся эпидемиологическая картина диктуют необходимость совершенствования применяемых коклюшных вакцин, а также создания новых, позволяющих эффективно иммунизировать младенцев и ревакцинировать подростков и взрослых. В НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи разработана инновационная рекомбинантная живая коклюшная вакцина (РЖКВ) для интраназального применения. РЖКВ содержит генетически модифицированные бактерии B. pertussis 4МКS, несущие две мутации в опероне ptx и точечную мутацию в его промоторной области, а также нокаутную мутацию гена dnt. Бактерии B. pertussis 4МКS, также как и сконструированные ранее аттенуированные бактерии, продуцируют нетоксичную форму коклюшного токсина (КТ) и не синтезируют дермонекротический токсин (ДНТ) [4, 5]. Рекомбинантные бактерии B. pertussis 4МКS в результате сайт-направленного мутагенеза промоторной зоны оперона ptx приобрели наиболее распространенный в настоящее время в популяции возбудителя коклюша генотип ptxP3, характеризующийся повышенной экспрессией КТ в сравнении с бактериями генотипа ptxP1[4, 6]. Целью настоящей работы было изучение защитной активности кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения в тестах внутримозгового и интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентными бактериями рода Вordetella (B. pertussis, B. paraperussis и B. bronchiseptica). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактерии B. pertussis, B.paraperussis и B. bronchiseptica культивировали на твердой питательной среде КУА с добавлением 10% дефибринированной крови барана при температуре 35о -37о С в течение 24-36 ч. После интраназального заражения у эвтаназированных мышей извлекали легкие, гомогенизировали в 0,85% растворе хлорида натрия рН 7.2-7.4, инкубировали при температуре 350 С 15 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5-10 мин. По 0,1 мл супернатанта высевали на три чашки Петри с селективной средой. Для выделения ДНК супернатанты гомогенатов легких обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы «Promega» США [2]. Использована разработанная нами тест-система для ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) [2]. Защитную активность РЖКВ и субстанции — аттенуированных бактерий В. pertussis 4MKS определяли после однократного интраназального введении трех пятикратных разведений препарата, начиная с дозы 0,750 МЕ в 0,025 мл 20 мышам. Коммерческий препарат АКДС разводили в соответствии с инструкцией до концентрации 0,750 МЕ в 0,5 мл и вводили внутрибрюшинно однократно 20 мышам. Спустя 17-20 суток после иммунизации мышей заражали интрацеребрально вирулентными бактериями В.pertussis 18323. В экспериментах использовали мышей линии Balb/с1 обоего пола весом 10- 12 г. Одновременно из этой же партии использовали мышей для титрования ЛД50 штамма B. pertussis 18323. Тест считали положительным, если препарат обеспечивал выживаемость более 70 % мышей при заражении их не менее 100 ЛД50 [3]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Существующие в настоящее время для профилактики коклюша вакцины АКДС и АаКДС применяют парентерально (внутримышечно), и методы изучения их защитной активности предполагают подкожное или внутрибрюшинное однократное введение тестируемых препаратов мышам. Для доклинического исследования живых коклюшных вакцин нами отработан метод интраназального введения бактерий B. pertussis лабораторным животным. Для иммунизации и экспериментального заражения суспензию бактерий B. pertussis вводили интраназально, используя краткосрочный наркоз, обеспечивающий свободное дыхание животного. Обездвиживание мышей достигалось внутримышечным введением раствора золетила (Франция) в количестве 0,2-0,4 мг. После наркоза каплю суспензии на конце иглы шприца Гамильтон (20-25 мкл) подносили к носу мыши, добиваясь ее полного вдыхания без разбрызгивания. Для определения эффективной дозы было определено количество бактерий B. pertussis в респираторном тракте мыши через час после интраназального введения препарата. С этой целью гомогенат легких мышей в разведениях высевали на среду КУА с кровью и параллельно определяли количество геном—эквивалентов B. pertussis с помощью ПЦР РВ. Установлено, что через один час после интраназальной инокуляции около 109 бактерий B. pertussis методом ПЦР РВ в легких мышей регистрируется около 106 ГЭ B. pertussis, а бактериологическим методом 105 КОЕ. Интраназальное введение РЖКВ проводили по описанной выше методике. Результаты экспериментов представлены на рис. Установлено, что мыши, интраназально иммунизированные РЖКВ в дозе 0,75х109 м.к. (0,75 МЕ), выживали в 100% случаев при заражающей дозе в 300 ЛД50. В среднем 89,7 % выживаемости мышей обеспечивала доза вакцины 0,15 МЕ и 59% — 0,03 МЕ. Таким образом, предполагаемая защитная доза РЖКВ, обеспечивающая выживание более 70% вакцинированных мышей, близка к 0,15 МЕ. В качестве сравнения были выбраны: коммерческий препарат АКДС C1252/ААП/15 НПО «Микроген» и изогенные аттенуированные бактерии B. pertussis 4М генотипа ptxP1. АКДС защищала только 85% мышей даже при иммунизации максимальной дозой. Выживаемость при дозе 0,15 МЕ составляла 60%, а при минимальной дозе выживало 10 % мышей, интрацеребрально зараженных вирулентными бактериями B. pertussis 18323. Интраназальная иммунизация живыми бактериями B. pertussis 4М обеспечивала 60% выживаемости мышей при дозе равной 0,15 МЕ, в то время как тот же уровень защиты обеспечивали бактерии B. pertussis 4МKS (РЖКВ) в дозе в 5 раз меньшей — 0,03 МЕ. Ранее нами были сконструированы рекомбинантные бактерии B. bronchiseptica 8220-17, продуцирующие коклюшный токсин (КТ) [6]. КТ, продуцируемый рекомбинантными бактериями B.bronchiseptica 8220-17, обладает свойствами нативного КТ, экспрессируемого вирулентными бактериями B.pertussis. Следует отметить, что помимо описанных ранее иммунобиологических характеристик, интраназальное введение бактерий B.bronchiseptica 8220-17 макакам резус сопровождалось развити-ем лейкоцитоза и выработкой специфических антител к КТ, взаимодействующих с нативным КТ (не опубликовано). Бактерии B.pertussis 475 выращивали на среде КУА с кровью в течение 24—30 часов, B.pаrареrtussis 504 — 18-20 ч, B.bronchiseptica 8220-17 — 12-16 ч. Культуру собирали с чашек, суспендировали в 0,85% растворе хлорида натрия до концентрации 120 МЕ (1,2х1011 м.к. в мл) и по 25 мкл суспензии в соответствующих разведениях вводили мышам. Для инокуляции использовали исходную культуру и два 3-кратные разведения, содержащие 3х109 , 1х109 и 3х108 МЕ, соответственно. Контролем служили мыши, которым интраназально вводили по 25 мкл 0,85% раствора хлорида натрия. Определение количества бактерий в легких животных через час после введения показало, что при интраназальном введении 3х109 м.к. регистрировали от 106 до 107 ГЭ бактерий, при введении дозы 3х108 — высевали порядка 105 КОЕ. Рассчитанное из количества инокулированных бактерий рода Bordetella значение ЛД50 составляло (0,25-0,47) х109 м.к. Результаты представлены в табл. 1. Наибольшую гибель мышей наблюдали в период с 3 по 17 дни, при введении 3х109 м.к. погибало 100% мышей и 80-100% при дозе 109 м.к. Доза 0,3х109 м.к. вызывала гибель 60- 80% мышей. Инфицированные мыши теряли в весе, изменялся шерстяной покров (выпадение, взъерошенность и т.п.), снижалась двигательная активность (сбивались в кучу, сидели без движения). Через 20 дней состояние выживших мышей приходило в норму. В контрольной группе все мыши оставались живыми. Срок наблюдения 30 суток. Интраназальную иммунизацию мышей проводили тремя сериями РЖКВ. ЛД50 вирулентных бактерий B. bronchiseptica 8220 и 8220-17 (рекомбинантный штамм продуцирующий нативный КТ), B. pertussis 475, B. pаrареrtussis 504 определены в соответствии с результатами, представленными в табл. 1. Иммунизированных РЖКВ мышей заражали интраназально разрешающей дозой (3-5)х109 м.к., что соответствовало 7-12 ЛД50 для использванных вирулентных бактерий рода Bordetella. Результаты эксперимента приведены в табл. 2. В настоящем сообщении представлены результаты изучения защитной активности РЖКВ интраназального применения.

Защитная активность РЖКВ после внутримозгового заражения мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323. РЖКВ — серии 3.1, 1.1.10, 1.1.11; АКДС — серия С1252/ААП/15; B. pertussis 4М — аттенуированные бактерии B. pertussis генотипа Ptx P1; горизонтальная линия: контрольный уровень 70% выживания мышей; иммунизирующие дозы: 1 — 0,75 х109 м.к.; 2 — 0,15 х109 м.к.; 3 — 0,03 х109 м.к.

Для оценки защитной активности ЦКВ, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, как правило, используют тест внутримозгового (интрацеребрального) заражения иммунизированных мышей вирулентными бактериями тестового штамма B. pertussis 18323 [3, 17]. Защитную активность новых препаратов БКВ в Европе и США определяют по иммуногенности — способности индуцировать выработку специфических противококлюшных антител, в сравнении с лицензированными препаратами. В Японии, Китае, Корее для оценки БКВ используют разные модификации теста интрацеребрального заражения (ICN или MICA). Применяется также методика сравнительной оценки скорости выведения вирулентных бактерий B. pertussis из легких мышей после интраназального заражения контрольных и вакцинировнных животных (INCA) [17]. Именно такой метод использован для оценки протективности живых аттенурованных бактерий B. pertussis BPZE1, сконструированных французскими учеными [13]. Основные трудности при определении защитной активности новых вакцинных препаратов состоят в сложности стандартизации предлагаемых методов и сопоставлении полученных результатов [17]. Нам представляется, что метод определения защитной активности коклюшных вакцин в тесте интрацеребрального заражения мышей, несмотря на его трудоемкость, достаточно воспроизводим, хорошо коррелирует с защитной активностью ЦКВ и пригоден для оценки протективности рекомбинантных живых коклюшных вакцин. Для того, чтобы оценить протективность живой вакцины при естественном для коклюша интраназальном введении вирулентных бактерий, нами разработан метод, предполагающий определение выживаемости контрольных и интраназально вакцинированных мышей после их интраназального заражения вирулентными бактериями рода Bordetella [6]. Описание подобного метода в современной литературе не встречается. Проведенные исследования показали, что внутримышечное введение золетила в дозе 0,2-0,4 мг приводит к краткосрочному (5-10 мин) обездвиживанию мышей (крысят) и сохраняет равномерное дыхание животных. В таком состоянии они способны вдохнуть 20-25 мкл суспензии (108 - 109 МОЕ) в виде капли на конце иглы Защитная активность РЖКВ после внутримозгового заражения мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323. РЖКВ — серии 3.1, 1.1.10, 1.1.11; АКДС — серия С1252/ААП/15; B. pertussis 4М — аттенуированные бактерии B. pertussis генотипа Ptx P1; горизонтальная линия: контрольный уровень 70% выживания мышей; иммунизирующие дозы: 1 — 0,75 х109 м.к.; 2 — 0,15 х109 м.к.; 3 — 0,03 х109 м.к. 65 шприца «Гамильтон» без разбрызгивания и потери материала. Эвтаназия животных через час после введения препарата показала, что в легких регистрируется около (105 -106 ) ГЭ, что значительно меньше количества инокулированных бактерий. Результат одинаков для вирулентных и аттенуированных бактерий B. pertussis, рекомбинантных бактерий B. bronchiseptica 8220-17 и природных изолятов B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504. Этот показатель важен для определения дозы препарата РЖКВ, формирующей определенный защитный эффект, и его следует учитывать при оценке результатов как в экспериментах с животными, так и при планировании вакцинирующей дозы в клинических исследованиях РЖКВ. Защитную активность РЖКВ при вакцинации мышей интраназальным способом проверяли в двух тестах. Интрацеребральное заражения мышей вирулентными бактериями B.pertussis 18323 продемонстрировало высокую протективность препарата РЖКВ, превосходящую защитную активность коммерческого препарата АКДС серии C1252/ААП/15 НПО «Микроген». Препарат РЖКВ, согласно критериям, применяемым для ЦКВ, может быть использован для иммунизации мышей в дозе 0,15 КОЕ. Полученный нами результат является тем более убедительным после оценки количества коклюшных микробных клеток, выявленных в легких мышей через час после иммунизации РЖКВ. По-видимому, реальная доза живых рекомбинантных бактерий В. pertussis 4MKS, формирующая иммунный ответ при интраназальном введении, в сотни (100-1000) раз меньше, чем инактивированных вирулентных бактерий В. pertussis в составе АКДС вакцины, вводимой парентерально. Аналогичные результаты описаны нами ранее для генетически аттенуированных бактерий, сконструированных на основе других реципиентов B.pertussis [5]. Результаты сравнительного определения защитной активности аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS в составе РЖКВ, содержащих новый генотип ptxP3, и изогенных бактерий B. pertussis 4М генотипа ptxP1 выявили тенденцию увеличения защитной активности у бактерий B.pertussis 4МKS. Действительно, на фоне некоторого общего снижения выживаемости с уменьшением количества МЕ в иммунизирующей дозе выживаемость мышей в пределах 60% обеспечивается дозой, равной 0,15 МЕ для штамма B. pertussis 4М (ptx P1) и 0,03 МЕ — B. pertussis 4МKS (ptx P3). Этот результат, скорее всего, указывает на то, что пороговая 70% выживаемость мышей после интрацеребрадьного заражения обеспечивается достоверно меньшей иммунизирующей дозой аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS. Следует понимать, однако, что защитная активность аттенуированных бактерий B. pertussis является интегральной характеристикой и 2—3-кратное увеличение уровня продукции одного, пусть даже и самого важного, протективного антигена КТ*, может быть недостаточным для значительного усиления защитной активности, измеряемой в мышиной модели. Более полное заключение о потенциале защитной активности рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS в сравнении с изогенными бактериями B. pertussis 4М довакцинного генотипа ptx P можно сделать после сравнительного анализа защитной активности нескольких экспериментальных серий РЖКВ и B. pertussis 4М, определенных в тестах интрацеребрального и интраназального заражения. Таким образом, препарат РЖКВ интраназального применения обладал защитной активностью, превосходящую таковую у вакцины АКДС в тесте интрацеребрального заражения иммунизированных мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323. Особый интерес представляет определение защитной активности РЖКВ интраназального применения по выживаемости мышей зараженных интраназально вирулентными бактериями. Такой тест в максимальной степени приближен к ес-тественному заражению людей при коклюшной инфекции, но в литературе не описан. Описанные в литературе результаты определения вирулентности бактерий рода Bordetella при экспериментальном интраназальном заражении мышей немногочисленны, не содержат описания процедуры инокуляции бактерий, и с нашей точки зрения не могут быть экстраполированы на условия наших экспериментов. Анализ литературы показывает, что разные штаммы бактерий рода Bordetella имеют большой разброс значений ЛД50 при интраназального заражения мышей [7, 8], что связано, вероятно, как со свойствами самих бактерий, так и с используемыми линиями мышей, зависит от способа заражения и учета количества бактерий Bordetella в инфицирующей дозе. Так, например, для бактерий B. bronchiseptica RB50 ЛД50 составляет около 107 , а для B. bronchiseptica 253 — около106 на мышах линии C57BL/6 [7, 8]. Поэтому изучению защитной активности РЖКВ в тесте экспериментальной интраназальной инфекции мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 в наших экспериментах предшествовало определение их вирулентности (ЛД50) на нативных лабораторных мышах Balb/С1. Приведенные в работе результаты показывают, что использованные нами штаммы имели высокую степень вирулентности, вызывающую гибель интраназально инфицированных мышей в дозах равных или меньше 106 м.к., регистрируемых в легких через час после заражения. Также как и в экспериментах с аттенуированными бактериями B.pertussis, наблюдали разницу в количестве интраназально инокулированных и зарегистрированных в легких мышей бактерий сразу после инфицирования. Интраназальное заражение лабораторных мышей бактериями B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504 приводило к развитию легочной инфекции и гибели животных в первые 17 дней. У выживших особей наблюдали значительную потерю массы тела, изменение шерстяного покрова и нарушение двигательной активности. Необходимо отметить, что использованные для анализа природные и рекомбинантные бактерии рода Bordetella отличались продукцией коклюшного токсина. Бактерии B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 продуцировали нативный КТ, а у B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504 синтез КТ отсутствовал. Тем не менее, мыши, инфицированные всеми использованными штаммами, погибали примерно в одни и те же сроки с характерными клиническими проявлениями заболевания. Общей для всех изученных штаммов Bordetella была способность продуцировать аденилатциклазный токсин, дермонекротический токсин, гемагглютинин, пертактин и другие факторы вирулентности. В настоящее время роль каждого из перечисленных факторов вирулентности в патогенезе коклюша изучена недостаточно. Наиболее вероятно, гибель мышей в первые дни после инфекции была обусловлена действием ДНТ. В пользу такого предположения говорят результаты определения остаточной вирулентности, специфической и общей токсичности аттенуированных бактерий B.pertussis 4MKS [6]. Они не проявляли токсических свойств даже при интраназальном введении 1010 МЕ суспензии мышатам, крысятам и взрослым мышам и отличались от вирулентных бактерий B.pertussis 475, B.bronchiseptica 8220-17, B.pаrареrtussis 504 и B.bronchiseptica 8220 — отсутствием продукции ДНТ и активного КТ. Таким образом, по-видимому, гибель мышей, инфицированных перечисленными штаммами бактериями рода Bordetella, по крайней мере, отчасти обусловлена действием ДНТ на легкие животных. Основываясь на значениях ЛД50 бактерий B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504, нами определены заражающие летальные дозы, составляющие (7-12) ЛД50 для определения защитной активностиРЖКВ. Такие исследования представляют интерес как для определения защитного потенциала коклюшных вакцин против близкородственных микроорганизмов, так и для выбора оптимального штамма для тестирования эффективности препаратов. Полученные нами результаты показали, что интраназальная иммунизация РЖКВ защищает мышей от интраназальной инфекции вирулентными бактериями возбудителя бронхосептикоза у животных (B. bronchiseptica), паракоклюша (B. parapertussi) и коклюша (B. pertussis). Показана защитная активность РЖКВ после экспериментальной инфекции мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475. Этот результат совпадает с выводами аналогичных исследований [10 — 12] и вполне ожидаем, поскольку бактерии рода Bordetella близки друг к другу по структуре и последовательности геномов, продукции большого числа общих факторов вирулентности. Они имеют одинаковую регуляцию экспрессии основных генов вирулентности, а бактерии B. pertussis и B. parapertussis эволюционировали из разных клонов B. bronchiseptica [15]. Менее предсказуема выявленная нами защитная активность коммерческого препарата АКДС от интраназального заражения мышей бактериями B. pertussis. Этот результат совпадает с результатами тестирования бактериальной нагрузки в носоглотке вакцинированных ЦКВ павианов анубис после их экспериментального заражения вирулентными бактериями возбудителя коклюша. В работе [16] продемонстрирована ускоренная по отношению к невакцинированным животным элиминация бактерий у обезьян, инъекционно вакцинированных ЦКВ. Зависимость защитной активности от вакцинирующей дозы в наших экспериментах качественно не отличаются при использовании внутримозговом заражении мышей бактериями B. pertussis 18323 и их интраназального заражения вирулентными бактериями рода Bordetella. Однако были выявлены некоторые количественные отличия. В тесте интраназального заражения бактериями B. pertussis 475, B. pаrареrtussis 504 и B. bronchiseptica 8220-17 защита животных не менее 70% обеспечивалась при иммунизации дозой аттенуированных бактерий B. pertussis равной 3х107 МЕ в 5 раз меньшей, чем в тесте внутримозгового заражения мышей B. pertussis 18323. Процент выживаемости мышей, иммунизированных коммерческим препаратом АКДС вакцины, был выше по сравнению с внутримозговым заражением B. pertussis 18323, но более низкий, чем у РЖКВ в обоих этих тестах. Эти результаты согласуются с предположением о способности ЦКВ при парентеральном введении индуцировать некоторый мукозальный иммунный ответ, продемонстрированный недавно в экспериментах с приматами [16]. Так как ДНТ, с одной стороны, согласно существующим представлениям, не является протективным антигеном, а с другой стороны, не синтезируется аттенуированными бактериями B. pertussis, справедливо предположить, что высокий уровень защиты мышей после интраназальной иммунизации обеспечивается мукозальной, а не антитоксической составляющей противококлюшного иммунного ответа, защищающего на стадии адгезии и инвазии. Этот вывод согласуется с результатами сравнительного измерения защитной активности в тестах внутримозгового заражения B. pertussis 18323 и интраназального заражения. Защита мышей не менее 70% от интраназального инфицирования обеспечивалась иммунизирующей дозой аттенуированных бактерий B. pertussis в 5 раз меньшей, чем при использовании теста внутримозгового заражения. Таким образом, предлагаемая нами модель интраназального заражения для оценки защитной активности РЖВК позволяет определять противобактерийную мукозальную составляющую поствакцинального противококлюшного иммунитета. Более детальное изучение корреляции результатов интраназального и внутримозгового заражения мышей, иммунизированных разными коклюшными вакцинами, позволит определить применимость предложенной экспериментальной модели. В наших экспериментах не было выявлено существенной разницы в результатах тестирования РЖКВ, полученных при использовании бактерий B. pertussis 475, B. pаrареrtussis 504 и B. bronchiseptica 8220-17. Если этот результат подтвердится в последующих экспериментах, предлагаемый тест и сконструированные нами рекомбинантные бактерии B.bronchiseptica 8220-17 могут быть хорошей альтернативой используемому в настоящее время трудоемкому, требующему достаточно высокой квалификации методу внутримозгового заражения мышей прихотливыми, медленно растущими, требующими стандартных сред с добавлением крови бактериями B. pertussis 18323. Представленные результаты показали, что препарат РЖКВ интраназального применения защищал мышей от инфицирования вирулентными бактериями других патогенных для человека видов рода Bordetella. Наши результаты согласуются с данными доклинического изучения аттенуированных бактерий B.pertussis BPZE1, сконструированных французскими исследователями [11, 13] и позволяют констатировать, что разработанная кандидатная рекомбинантная живая коклюшная вакцина будет защищать не только от коклюша, но и паракоклюша и бронхосептикоза. Исследования последнего десятилетия в разных странах, в том числе и в России, показали, что в настоящее время на фоне массовой вакцинации против коклюша штаммы циркулирующих бактерий B. pertussis содержат измененные последовательности генов вирулентности — ptx, fga, prn, отличающиеся от таковых в довакцинальном периоде. Высказываются предположения, что одна из причин роста заболеваемости коклюшем связана с циркуляцией возбудителя с новыми генотипами [1, 6, 14]. Для совершенствования современных коклюшных вакцин рассматривается возможность замены вакцинных штаммов довакцинного генотипа на новые, относящиеся к современным генотипам. Рекомбинантные бактерии B. pertussis 4МKS с новым генотипом ptxP3, сконструированные на основе изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis 4М довакцинного генотипа ptxP1, сохраняют стабильность генома и заданные биологические характеристики, продуцируют большее количество токсоида [4, 6]. Представленные в настоящем сообщении результаты позволяют констатировать, что регуляторная мутация в опероне ptxP1, увеличивающая экспрессию оперона ptx, привела к усилению защитной активности аттенуированных бактерий B. pertussis. Разработанная нами генетическая методология может быть использована для необходимой модификации бактерий B. pertussis довакцинных генотипов с целью создания вакцинных препаратов на основе регламентированных производственных штаммов. Использование предполагаемого подхода позволит своевременно реагировать на необходимость замены генотипов в вакцинных штаммах, согласно с превалированием новых генотипов в популяции B. pertussis, сэкономить время и средства на разработку эффективных препаратов для профилактики коклюша.

About the authors

L. N. Sinyashina

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

E. G. Semin

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

A. Yu. Medkova

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

R. A. Syundyukova

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

G. I. Karataev

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Russian Federation

References

Supplementary files