Динамика ферментативной активности в первичной культуре адгезивных лейкоцитов сирийского хомячка, заражённых SARS-CoV-2 ex vivo

Полный текст

Введение

Коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома 2-го типа (SARS-CoV-2 — severe acute respiratory coronavirus 2) (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus) является этиологическим агентом коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), пандемия которого (2020–2023 гг.) стала самой продолжительной и одной из наиболее смертоносных среди острых респираторных заболеваний в новейшей истории человечества [1]. После окончания пандемического периода SARS-CoV-2 не исчез из человеческой популяции, а превратился в одну из составляющих в структуре сезонного подъёма заболеваемости острыми респираторными заболеваниями [2]. По этой причине изучение патогенеза SARS-CoV-2-инфекции не теряет своей актуальности, ряд аспектов этого процесса изучен недостаточно полно. В связи с этим особый интерес вызывает процесс взаимодействия вируса с клетками периферической крови, в частности, с клетками врождённого иммунитета — нейтрофилами и моноцитами.

В доступной литературе изложены теоретические предположения о возможной способности вируса SARS-CoV-2 инфицировать нейтрофилы. Так, N. Rong и соавт. сообщили о рецепторе CD147, альтернативном рецептору ACE2, который обусловливает тропизм вируса, экспрессируется в нейтрофилах здоровых доноров и активируется у пациентов с COVID-19 [3]. Другим неканоническим рецептором является лектиновый рецептор С-типа, который опосредует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек при COVID-19 [4]. Исходя из этого можно сделать предположение о том, что вирус способен непосредственно влиять на лейкоциты крови.

Описанные нами ранее морфологические изменения лейкоцитов периферической крови также свидетельствуют об их значительном вовлечении в процесс SARS-CoV-2-инфекции [5–8]. Однако в научной литературе отсутствует подробная информация о характере и динамике ферментативной активности лейкоцитов при инфицировании данным вирусом. Имеются отдельные сообщения об изменениях активности миелопероксидазы (МПО) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови пациентов с диагнозом COVID-19, причём выраженность этих изменений коррелирует с тяжестью основного заболевания [9–11]. По этой причине необходимо изучить не только морфологические, но и морфофункциональные изменения в комплексе с целью суждения о метаболических процессах клеток врождённого иммунитета под влиянием SARS-CoV-2.

Целью данной работы является определение ферментативной активности лейкоцитов периферической крови сирийских хомячков в динамике SARS-CoV-2-инфекции ex vivo, характеризующей микробицидный потенциал клеток врождённого иммунитета.

Материалы и методы

Первичную адгезивную культуру лейкоцитов сирийского хомячка (Mesocricetus auratus) получали из крови 15 особей в возрасте 4 мес и массой около 100 г. Все процедуры с животными выполняли строго в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, от 18.03.1986. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова Роспотребнадзора (протокол № 2 от 16.05.2024).

Кровь собирали из сердца в стеклянные пробирки с добавлением в каждую гепарина из расчёта 5 ЕД/мл. Пробирки помещали в термостат под углом 45° при 37°С на 1 ч, после чего осторожно удаляли верхний слой плазмы, а лейкоцитарную плёнку отбирали, доводили до концентрации 2 × 10⁶ клеток/мл питательной средой 199 («БиолоТ») и разносили по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета («TFS»), который помещали в термостат (5% СО₂, 37°С) на 40 мин; затем среду с неадгезированными клетками удаляли и лунки трижды промывали 150 мкл среды 199.

Количество живых адгезированных клеток в лунке определяли с помощью инвертированного микроскопа «МИБ-Р» («ЛОМО»), оснащённого цифровой камерой МС-8.3 С («ЛОМО»). С помощью программы MCView («LOMO-Microsystems») площадь поля зрения, не включающего край лунки, выставляли равной 0,26 мм², подсчитывали в ней число (n) живых (прикреплённых с целостной внешней мембраной) клеток; пересекающие внешнюю границу клетки учитывали на левой/верхней гранях квадрата поля зрения и не учитывали на правой/нижней гранях. Поскольку общая площадь лунки равна 35 мм², то общее количество клеток в лунке (N) оценивали по формуле:

$N\approx n \times \frac{\mathrm{35,00}м{м}^2}{\mathrm{0,26}м{м}^2}\approx \mathrm{134,62} \times n$.                                                                        (1)

Итоговую оценку количества живых клеток в каждой лунке производили по 10 случайно выбранным полям зрения.

Инфицирование первичной культуры адгезивных лейкоцитов сирийского хомячка ex vivo осуществляли путём внесения в лунки с монослоем клеток 100 мкл среды 199 с рабочим разведением супернатанта клеточной культуры Vero E6, инфицированной SARS-CoV-2 (в контрольные образцы — без вируссодержащего супернатанта) и последующей инкубацией 1 ч при 37°С, после чего проводили трёхкратную промывку и заполнение лунок средой для культивирования, содержащей среду 199 с 15% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и 0,004% гентамицина К («БиолоТ»). Были использованы две инфицирующие дозы: 3 lg (ТЦД₅₀/мл) и 2 lg (ТЦД₅₀/мл), где ТЦД₅₀ — это 50% тканевая цитопатическая доза для линии клеток почки африканской зелёной мартышки (Chlorocebus sabaeus, ♀) (Vero E6).

Штамм SARS-CoV-2/Vladivostok/R-8726/2021 был получен из Коллекции патогенных микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова. Данный штамм относится к генотипу Delta (AY.121) (VGARus ID: prim000041; GenBank ID: OQ318430; GISAID ID: EPI_ISL_16643370) и был выделен из назофарингеального смыва больного COVID-19 в декабре 2021 г. на модели клеточной линии Vero E6 [2].

Индикацию РНК SARS-CoV-2 осуществляли с помощью метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов «ОТ-ПЦР-РВ-SARS-CoV-2» («Синтол»). РНК выделяли с использованием комплекса реагентов «М-Сорб-НК» («Синтол»). Все манипуляции осуществляли согласно протоколам производителя. Пороговый цикл (threshold cycle, С_Т) ОТ-ПЦР-РВ рассматривали как полуколичественную характеристику содержания вирусных частиц в среде: чем выше их содержание, тем ниже С_Т. Отсутствие вируса соответствовало С_Т ≥ 36.

Активность аденозинтрифосфатазы (АТФазы) и аденозинмонофосфатазы (АМФазы) определяли после двукратной отмывки адгезированных лейкоцитов ростовой средой без ЭТС путём внесения в лунки планшета 50 мкл субстрата для АТФазы (8 мг/мл аденозин-5′-трифосфата в 10-кратно разведённом трис-HCl-буфере, рН 7,8, содержащем 87 мг NaCl, 28,7 мг KCl, 5,2 мг MgCl₂ × 6 H₂O) и для АМФазы (4 мг/мл аденозин-5′-монофосфата в таком же буферном растворе, содержащем 87 мг NaCl и 70 мг MgCl₂). Образцы оставляли при 37°С на 30 и 60 мин соответственно. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1 : 1. Через 20 мин поглощение растворов измеряли¹ при длине волны 620 нм [12].

Активность ЛДГ и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли после двукратной отмывки адгезированных лейкоцитов ростовой средой без ЭТС путём внесения в лунки планшета 100 мкл раствора йодонитротетразолия («ICN») — для ЛДГ и бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиума («ICN») — для СДГ 2 мг/мл в фосфатном буфере рН 7,2 с 0,4% MnCl₂ и инкубировали 30 мин при 37°С; затем среду удаляли и монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса рН 7,2. Внутриклеточные гранулы диформазана растворяли в 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм (для ЛДГ) и 540 нм (для СДГ) [12].

Активность МПО и цитохромоксидазы (ЦХО) определяли после двукратной отмывки адгезированных лейкоцитов ростовой средой без ЭТС путём внесения в лунки планшета 100 мкл раствора ортофенилендиамина («Merck») 0,4 мг/мл — для МПО и 3,3′-диаминобензидина («Merck») 2 мг/мл — для ЦХО в фосфатно-цитратном буфере рН 5,0 с 0,033% H₂O₂ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 10% раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм [12].

Вирусную нагрузку в динамике SARS-CoV-2-инфекции устанавливали полуколичественным методом на основе изменения порогового цикла в ОТ-ПЦР-РВ (C_T(0)), через 1 ч (C_T(1)) — в вируссодержащей жидкости после контакта с клетками; 16 ч (C_T(16)), 24 ч (C_T(24)) и 48 ч (C_T(48)) — в ростовой среде инфицированных клеток.

Ферментативную активность клеток под действием SARS-CoV-2-инфекции определяли через 1, 16, 24, 48 ч после инокуляции вируса (п.и.в.) путём сравнения отношений удельных (в расчёте на 1 клетку) ферментативных активностей инфицированных и неинфицированных клеток: для каждого момента времени t вычисляли коэффициент изменения удельной ферментативной активности γ(t) по формуле:

$\gamma \left(t\right)=\frac{\tilde{D}\left(t\right)}{\tilde{z}\left(t\right)}\times \frac{z\left(t\right)}{D\left(t\right)}$,                                                                                                       (2)

где учтены оптическая плотность и количество живых клеток для неинфицированного (D(t) и z(t)) и инфицированного (D~(t) и z~(t)) образцов соответственно [13, 14]. Разумеется, имеет место априорное равенство:

$\gamma \left(t\right) = 1$.                                                                                                                           (3)

Статистическая обработка результатов основывалась на том, что в каждый момент времени t для каждого из 6 ферментов измерения осуществляли в 3 лунках с неинфицированными клетками и в 3 лунках с инфицированными клетками. Для этого в начале производили удаление поддерживающей среды, чтобы после промывки внести среды с соответствующими субстратами. Пронумеруем ферменты в произвольном порядке, используя индекс f = 1, 2, …6. Тогда в каждый момент времени t имеется 6 × 3 = 18 образцов вируссодержащей жидкости: C_Tjf(t), j = 1, 2, 3. При этом C_Tjf(1) представляли собой вирусную нагрузку в образцах в результате накопления вируса в среде de novo: после того как исходная вируссодержащая жидкость C_Tjf(0) в течение 1 ч находилась в контакте с клетками; C_Tjf(16), C_Tjf(24) и C_Tjf(24). Таким образом, для t = 1, 16, 24, 48 ч выборочное среднее <C_T(t)> и стандартное отклонение выборочного среднего m_CT определяются по стандартным формулам в следующей модификации:

$⟨C_T\left(t\right)⟩=\frac{1}{18}\times \sum _{f=1}^6\sum _{j=1}^3{C}_{Tjf}\left(t\right)$;                                                                              (4)

$m_{C_T}=\frac{1}{3\sqrt{34}}\times {\left(\sum _{f=1}^6\sum _{j=1}^3{(C_{Tjf}\left(t\right)-⟨C_T\left(t\right)⟩)}^2\right)}^{1/2}$.                                               (5)

Исходный образец был в единственном экземпляре, и его вирусную нагрузку характеризовало единственное значение C_T(0).

После проведения химических реакций, которые катализируются изучаемыми ферментами, измеряли оптическую плотность в 3 лунках с неинфицированными клетками (D_i(t), i = 1, 2, 3) и в 3 лунках с инфицированными (D~_j(t), j = 1, 2, 3) клетками. Перед этим в каждой лунке измеряли количество живых клеток: z_i(t) (i = 1, 2, 3) и z~_j(t) (j = 1, 2, 3). Оценку каждого значения z_i(t) и z~_j(t) осуществляли по 10 полям зрения в соответствии с (1)²: z_ik(t), k = 1, 2, …10 и z~_hk(t), h = 1, 2, …10. При этом все измерения D_i(t), z_ik(t), D~_j(t), z~_jh(t) при любых значениях коэффициентов независимы и равноправны. Существует 30 значений дроби D~_j(t)/z~_jh(t), 30 значений дроби z_ik(t)/D_i(t) и 900 вариантов их произведений вида (2), т. е. выборкa состоит из 900 значений γ(t). Поэтому выборочное среднее <γ(t)> и стандартное отклонение выборочного среднего m_γ(t) рассчитывали по стандартным формулам, модифицированным для данного случая:

$⟨\gamma \left(t\right)⟩=\frac{1}{900}\times \sum _{j=1}^3\sum _{k=1}^{10}\sum _{j=1}^3\sum _{h=1}^{10}\frac{{\tilde{D}}_j\left(t\right)}{{\tilde{z}}_{jh}\left(t\right)}\frac{z_{ik}\left(t\right)}{D_i\left(t\right)};$                                                         (6)

$m_{\gamma \left(t\right)}=\frac{1}{30\sqrt{899}}\times {\left(\sum _{j=1}^3\sum _{k=1}^{10}\sum _{j=1}^3\sum _{h=1}^{10}{\left(\frac{{\tilde{D}}_j\left(t\right)}{{\tilde{z}}_{jh}\left(t\right)}\times \frac{z_{ik}\left(t\right)}{D_i\left(t\right)}-⟨\gamma \left(t\right)⟩\right)}^2\right)}^{1/2};$               (7)

Достоверность различий между выборками из 900 значений для значений времени — γ(t₁) и γ(t₂), а также между выборками из 18 значений для значений времени С_Т(t₁) и С_Т(t₂), где t₁ = 1, 16, 24, 48 ч, t₂ = 1, 16, 24, 48 ч, t₁ ≠ t₂, оценивали с помощью критерия Манна–Уитни–Вилкоксона. Этот непараметрический критерий не требует априорных предположений о функции распределения случайных величин, реализацией которых являются значения γ(t) и С_Т(t). Достоверной считалась оценка при вероятности реализации альтернативной гипотезы р ≤ 0,05.

Результаты

Содержание SARS-CoV-2 в ростовой среде культуры адгезивных лейкоцитов показано на рис. 1 (здесь и далее следует иметь в виду, что большему значению С_Т соответствует меньшее содержание вируса в исследуемом образце). В течение 1-го часа п.и.в., когда имел место контакт вируссодержащей жидкости с клетками, происходило их инфицирование. После удаления вируссодержащей жидкости новые частицы в среде накапливались в результате репликации вируса в заражённых клетках. Учитывая тот факт, что это разные этапы инфекционного процесса, на динамических кривых рис. 1 сделан разрыв.

 

 

Рис. 1. Динамика вирусной нагрузки: меньшим значениям С_Т соответствуют более высокие значения концентрации вирионов, и наоборот.
В течение 1-го часа после инокуляции вируса концентрация вирионов падает вследствие их проникновения в клетки-мишени. После этого происходит смена среды и начинается накопление de novo дочерних вирионов, продуцируемых инфицированными клетками. *р ≤ 0,05 по сравнению со значением С_Т в предыдущий момент времени.

 

Через 1 ч п.и.в. (к окончанию процесса заражения) активность АТФазы адгезивных лейкоцитов под действием SARS-CoV-2-инфекции ex vivo дозозависимым образом снизилась относительно неинфицированного контроля (γ(1) < 1), но затем начала также дозозависимо повышаться: γ(16) ~ 1; γ(24) ≈ 1,2; γ(48) ≈ 1,6 (рис. 2, а). Возрастание АТФазной активности в период 16–48 ч было почти линейным при незначительном, но воспроизводимом превышении активности для дозы 3 lg(ТЦД₅₀) по сравнению с 2 lg(ТЦД₅₀).

 

Рис. 2. Изменения активности ферментов в результате инфекции SARS-CoV-2: АТФазы (а); АМФазы или 5’-нуклеотидазы (б); ЛДГ (в); СДГ (г); МПО (д); ЦХО (е).
По осям ординат — γ; по осям абсцисс — время после заражения, ч. *р ≤ 0,05 по сравнению со значением γ в предыдущий момент времени.

 

Активность АМФазы в процессе инфекции (рис. 2, б) изменялась иначе, нежели активность АТФазы. В начальный период инфекции уровень 5′-нуклеотидазы быстро повысился по сравнению с неинфицированным контролем и держался на этом уровне по меньшей мере 16 ч п.и.в., затем снижался к 24 ч (γ(24) ≈ 0,8 для обеих заражающих доз) и медленно возрастал в течение последующих 24 ч (γ(48) ~ 1).

Изменения активности ЛДГ (рис. 2, в) и СДГ (рис. 2, г) в процессе инфекции были аналогичны: сначала небольшой резкий рост (γ(1) ≈ γ(16) ≈ 1,2), затем возвращение к значению активности неинфицированного контроля (γ(24) ~ 1) и возрастание в течение последующих 24 ч (γ(48) ≈ 1,8). Снижение активности дегидрогеназ через 24 ч после инфицирования воспроизводится во всех случаях и, скорее всего, имеет дозозависимый характер (наиболее выраженный для СДГ).

Активность МПО в инфицированных клетках дозозависимым образом быстро снижалась по сравнению с неинфицированным контролем уже в течение 1 ч п.и.в. (рис. 2, д) и восстанавливалась к прежнему уровню через 24 ч (γ(24) ~ 1), после чего возрастала (γ(48) ≈ 1,4).

Активность ЦХО сначала дозозависимо снижалась (рис. 2, е), но затем возвращалась к уровню неинфицированного контроля уже через 16 ч п.и.в. (γ(16) ≈ γ(24) ≈ 1,0), после чего возрастала до γ(48) ≈ 1,2 для дозы 2 lg(ТЦД₅₀) и до γ(48) ≈ 1,4 для дозы 3 lg(ТЦД₅₀).

Обсуждение

Сирийские хомячки (Mesocricetus auratus) являются удобной экспериментальной моделью для воспроизведения коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 [1, 16, 17]. В данной работе мы использовали инфицирование ex vivo культуры адгезивных лейкоцитов, которая содержит основную фракцию нейтрофилов, претерпевающих комплекс морфофункциональных изменений при контакте с инфекционными агентами [18]. Нейтрофилы — важное звено врождённого иммунитета, являются достаточно короткоживущими лейкоцитами, и уже через 48 ч их адгезивная популяция быстро истощается (это, в частности, определяет выбранную нами продолжительность эксперимента).

Известно, что АМФаза (5′-нуклеотидаза) и АТФаза активно вовлекаются в процесс пространственного преобразования плазматической мембраны нейтрофилов при хемотаксисе [18, 19]. В частности, 5′-нуклеотидаза является регулятором уровня циклического АМФ, который обеспечивает передачу сигналов от плазмалеммы внутрь клетки и регулирует образование внеклеточного аденозина, который через специфические рецепторы опосредует цитозащиту и разнообразные физиологические эффекты (подавление воспаления, вазодилатацию, ингибирование тромбоза, антиадренергию и др.) [20]. При повреждении клетки повышается содержание АМФ и понижается — АТФ [21, 22]. Соответственно, увеличение активности АМФазы и снижение активности АТФазы было зафиксировано в течение первых 16 ч п.и.в. Ранние этапы повреждения коронавирусами клеток-мишеней связаны с рецептор-опосредованным слиянием вирус-клеточных мембран и формированием в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме инфицированной клетки специальных цистерн, в которых происходит сборка вирионов [23, 24]. Монотонное возрастание активности АТФазы, начиная примерно с 16 ч п.и.в., связано с активным синтезом вирусных белков (как структурных, так и регуляторных) и вирусспецифических РНК. Повторное возрастание активности АМФазы позже 24 ч п.и.в. (рис. 2, а, б), по-видимому, отражает процесс вторичного инфицирования лейкоцитов (в том числе в результате синцитиеобразования).

ЛДГ представляет собой цинксодержащий внутриклеточный фермент, который катализирует окисление молочной кислоты в пируват, принимает участие в обмене глюкозы, содержится практически во всех клетках организма и высвобождается при их повреждении [25]. Поэтому уровень сывороточной ЛДГ надёжно маркирует уровень неблагоприятных последствий воспалительных реакций и других патологических процессов. В частности, выявлена информативность уровня сывороточной ЛДГ для оценки клинической тяжести и мониторинга ответа на лечение при пневмонии у пациентов с COVID-19 [26]. СДГ относится к кофермент-независимым флавипротеинам и входит в мембраносвязанную дыхательную цепь мембран. Флавиновая группа этого фермента содержит 4 атома железа и ковалентно связана с белком, а ферментативная активность СДГ зависит от SH-групп [25]. СДГ млекопитающих не только участвует в образовании энергии в митохондриях, но также играет роль в чувствительности клетки к кислороду [27]. Дегидрогеназная активность инфицированных клеток сначала возрастает вследствие стимуляции вирусом репликационных процессов, а затем снижается в результате вирусиндуцированной цитодеструкции: на модели вируса иммунодефицита человека 1-го типа (Ortervirales: Retroviridae, Lentivirus) и иммортализованных клеточных линий различного происхождения показано, что величина и скорость такого дегидрогеназного сдвига пропорциональны заражающей дозе и уровню патогенности конкретного штамма (при одинаковой заражающей дозе) [13, 14]. В условиях описанного в данной статье эксперимента дегидрогеназная активность SARS-CoV-2-инфицированной первичной культуры адгезивных лейкоцитов сирийского хомячка (рис. 2, в, г) имеет два максимума: на 1-е сутки, который связан со входом вируса в клетку, и позже 1-х суток — в связи с продукцией вируса de novo (рис. 1, 2). Ещё одно объяснение (связанное с предыдущим): первый пик дегидрогеназной активности связан с жизнедеятельностью нейтрофилов, а второй — с более долгоживущими моноцитами (но пик максимума не был достигнут в связи с тем, что целью эксперимента было изучение в первую очередь биохимии инфицированных нейтрофилов).

МПО — гемопротеин, присутствующий в азурофильных гранулах нейтрофилов, выходящий при активации клетки в фаголизосому [28]. Этот фермент принимает участие в преобразовании супероксидного анион-радикала в гипохлорную кислоту, осуществляя защиту клетки от избыточного количества реактивных посредников кислорода [29]. После активации фагоцитов происходит дегрануляция, и МПО секретируется внутрь фагосомы либо во внеклеточное пространство. МПО является важной составной частью антимикробной активности фагоцитов, обеспечивающей врождённый неспецифический иммунитет. В ситуации in vivo МПО высвобождается во внеклеточную жидкость (в частности, в кровь), в том случае если по какой-либо причине нейтрофил не может фагоцитировать патоген, при клеточном лизисе или когда нейтрофил подвергается воздействию различных растворимых факторов [28].

При использовании автоматизированных цитохимических счётчиков клеток крови у пациентов с диагнозом COVID-19 отмечалось снижение активности МПО [9]. Вместе с тем при образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек, формирующих одну из линий защиты от патогенов (включая вирусы, в том числе — SARS-CoV-2), выявляется повышение активности МПО во внеклеточном пространстве [30–32]. Снижение содержания МПО в культуре адгезивных лейкоцитов в течение 1 сут п.и.в. (рис. 1, е) может объясняться тем, что под действием SARS-CoV-2-инфекции нейтрофилы экскретируют МПО во внеклеточное пространство и формируют подобные нейтрофильным внеклеточным ловушкам структуры ex vivo.

ЦХО локализуется главным образом на внутренней мембране митохондрий, где захватывает протоны из внутримитохондриального матрикса и, перенося электроны с цитохрома С на кислород, восстанавливает О₂ до Н₂О. Этот фермент играет важную роль в функционировании аэробного звена дыхательной цепи и производстве энергии в клетках эукариот [25]. Поэтому снижение активности ЦХО коррелирует со снижением активности АТФазы в первые часы п.и.в. (см. рис. 2, а и е). Кроме того, в лейкоцитах активность ЦХО служит достоверным показателем уровня окислительного метаболизма, и при гибели клеток её активность повышается [25] — именно этот эффект наблюдается в культуре адгезивных лейкоцитов к концу 1-х суток п.и.в. (рис. 2, е).

Обнаруженные изменения ферментативного спектра SARS-CoV-2-инфицированных лейкоцитов имеют дозозависимый характер (рис. 2): модуль таких изменений пропорционален заражающей дозе вируса. При анализе динамики ферментативной активности необходимо учитывать, что к концу 1-х суток п.и.в. клеточный состав культуры адгезивных лейкоцитов уменьшается за счёт короткоживущих нейтрофилов, но при этом в культуре остаются более долгоживущие клетки.

Разумеется, нельзя исключить, что инфицированные вирусом SARS-CoV-2 клетки Vero E6 продуцируют растворимые экзогенные факторы, способные повлиять на физиологию клеток при заражении, поскольку использовался вируссодержащий супернатант клеточной культуры Vero E6. Однако известно, что клетки линии Vero и Vero E6 не продуцируют интерферон I типа за счёт потери кластера генов интерферона I типа [33, 34] и являются дефектными по продукции интерферонов-α-1/13, α-2, α-4, α-6, α-8, α-14, α-17, α-21, β-1 и ω-1 [33]. Что касается остальных вируссодержащих растворимых факторов — они могут стать предметом дальнейших исследований.

Вывод

Обнаруженные изменения ферментативной активности в нейтрофилах, инфицированных SARS-CoV-2 ex vivo, свидетельствуют о снижении микробицидного потенциала этих клеток врождённого иммунитета, что является одной из причин дисфункции иммунной системы при COVID-19.

 

¹ Здесь и далее фотометрические измерения осуществляли с использованием спектрофотометра «Multiscan RC» («LabSystems»). Бланкирование проводили по раствору равного количества среды без соответствующих субстратов и клеток.

² Подсчёт жизнеспособных клеток в суспензионных культурах проще всего проводить в камере Горяева, извлекая небольшой объём ростовой среды с клеточной взвесью. Этот метод более удобен для однократного измерения (который не даёт достаточной статистической точности), но затруднителен в случае нескольких повторов; кроме того, достоверность результатов МТТ-тестов при работе с суспензионными клеточными культурами дополнительно снижается артефактным захватом клеток при промывке, что приходится компенсировать применением дозаторных наконечников специальной конструкции (S-tips) [15].

Об авторах

Светлана Алексеевна Абрамова

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: svetochey99@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2428-3186

аспирант, младший научный сотрудник лаб. патоморфологии

Россия, Владивосток

Ирина Николаевна Ляпун

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора

Email: irina-lyapun@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-5290-3864

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаб. патоморфологии

Россия, Владивосток

Елена Игоревна Дробот

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора

Email: eidrobot@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7672-1582

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаб. патоморфологии

Россия, Владивосток

Наталья Владимировна Крылова

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора; Дальневосточный федеральный университет

Email: krylovanatalya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9048-6803

доктор биол. наук, ведущий научный сотрудник, зав. лаб. респираторных инфекций, доцент каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины

Россия, Владивосток; Владивосток

Ольга Викторовна Иунихина

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора; Дальневосточный федеральный университет

Email: olga_iun@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-6723-582X

доктор биол. наук, ведущий научный сотрудник, зав. лаб. респираторных инфекций, доцент каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины

Россия, Владивосток; Владивосток

Валерия Александровна Лубова

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора

Email: valeri_priority@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4290-6164

научный сотрудник лаб. природно-очаговых инфекций

Россия, Владивосток

Евгений Константинович Мерлов

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора

Email: zhenya.merlov.2000@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1515-3221

младший научный сотрудник отд. экспериментальной биомедицины

Россия, Владивосток

Юрий Александрович Белов

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора; Дальневосточный федеральный университет

Email: bornley@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8313-5610

младший научный сотрудник, зав. центром молекулярной диагностики, ассистент каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины

Россия, Владивосток; Владивосток

Лариса Михайловна Сомова

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора

Email: l_somova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2023-1503

доктор мед. наук, профессор, главный научный сотрудник, зав. лаб. патоморфологии

Россия, Владивосток

Михаил Юрьевич Щелканов

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова Роспотребнадзора; Дальневосточный федеральный университет

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8610-7623

доктор биол. наук, директор, зав. каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины

Россия, Владивосток; Владивосток

Список литературы

Дополнительные файлы