Molecular genetic characteristics of Vibrio cholerae nonO1/nonO139 strains isolated on the territory of Russian Federation from patients with otitis

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Холерные вибрионы nonО1/nonО139 серогрупп (НАГ-вибрионы), естественные обитатели поверхностных водоемов, способны вызывать острые кишечные инфекции различной степени тяжести в виде спорадических случаев либо локальных вспышек [1]. Гораздо реже они являются этиологическими агентами внекишечных форм, выявляемых, как правило, у ослабленных пациентов, страдающих сопутствующими хроническими заболеваниями. Тем не менее в литературе имеется достаточно много сообщений о выделении НАГ-вибрионов из клинического материала при первичной бактериемии, поражениях кожи и мягких тканей, мочеполовой системы, желчевыводящих путей, пневмонии [2][3]. Не последнее место в этом списке занимают отиты (острые либо хронические), проявляющиеся в виде воспаления среднего уха или наружного слухового прохода [3]. Случаи отитов, вызванных НАГ-вибрионами, регистрировались в нынешнем столетии в Германии, Австрии и Венгрии [2][3]. В 2019 г. в Германии наблюдали случай хронического отита у ребёнка, заразившегося при купании в Балтийском море. В Израиле зарегистрировано развитие хронического отита у воднолыжника, заразившегося в 2011 г. в Австралии в результате перфорации барабанной перепонки при аварии и попадании речной воды в среднее ухо; этиологическим агентом оказался штамм О100 серогруппы [4]. Во Франции в 2017 г. НАГ-вибрион был выделен из отделяемого уха ребёнка, больного хроническим рецидивирующим мокнущим отитом; незадолго до обострения он купался в реке на территории страны [5]. В том же году в Испании НАГ-вибрион был выделен от больного c диагнозом «острый наружный отит»; заболевание проявилось после купания в Средиземном море [6]. Aналогичные случаи заражения при купании в водоёмах отмечены также в Швеции, Финляндии, Бельгии, Великобритании, Испании, Румынии, на Маврикии [3].

Авторы отмечают, что заражение людей происходит преимущественно в тёплое время года, что создаёт благоприятные условия как для купания, так и для размножения НАГ-вибрионов [5][6]; высказывалось даже предположение о том, что продолжающиеся изменения климата могут в скором времени привести к повышению заболеваемости людей за счёт инфицирования НАГ-вибрионами и другими представителями вибриофлоры в мировом масштабе [7].

НАГ-вибрионы крайне вариабельны по генотипическим свойствам за счёт высокой пластичности их геномов. В имеющихся публикациях генетические характеристики возбудителей внекишечных форм заболеваний ограничены ПЦР детекцией отдельных генов, реже — данными частичного секвенирования их участков. В базах National Center for Biotechnology Information (NCBI) были найдены только полногеномные сиквенсы (WGSs) штаммов-возбудителей наружных отитов, выделенных в Австрии. Эти сиквенсы частично проанализированы S. Lepuschitz и соавт. в плане обнаружения генов антибиотикорезистентности [8].

Наш интерес к НАГ-вибрионам, вызвавшим отиты, обусловлен тем, что в 2017–2020 гг. такие штаммы выделялись из отделяемого уха больных на территории России.

Целью настоящей работы явился биоинформационный анализ полных геномов штаммов V. cholerae nonO1/nonO139, выделенных от больных отитом на территории России, а также отдельных генов и продуктов их трансляции in silico.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили 7 штаммов V. cholerae nonO1/nonO139, выделенные от людей на территории России в 2017–2020 гг. Для сравнения в анализ был включен ещё 1 штамм, выделенный из крови больного с неизвестным диагнозом (табл. 1). Все штаммы получены из Музея живых культур (коллекция Референс-центра Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора).

 

Таблица 1. Клинические штаммы V. cholerae nonO1/nonO139, использованные в работе

Table 1. V. cholerae nonO1/nonO139 clinical strains used in this study

 

Полногеномное секвенирование (WGS) осуществляли на платформе MiSeq [9]. Сравнительный однонуклеотидный (SNP) анализ проводили согласно предложенной ранее схеме [10].

Отдельные гены и их кластеры идентифицировали в полных геномах с помощью программ «BLASTN v. 2.2.29»¹ и «BioEdit v. 7.2.5»². Трансляцию генов, сравнительный анализ их нуклеотидных последовательностей и аминокислотных (аа) продуктов осуществляли с использованием пакета программ «Vector NTI Advance 11» («Invitrogen»). Прототипами служили соответствующие последовательности референс-штамма V. cholerae N16061 и другие, отсутствующие в его геноме (табл. 2). Для определения наличия и локализации активных доменов в белках, а также выявления их гомологов у штаммов из других регионов мира выполняли BLASTP-анализ.

 

Таблица 2. Сиквенсы, использованные в сравнительном анализе в качестве прототипов

Table 2. Reference sequences used as prototypes in comparative analysis

 

Поиск в WGSs генетических детерминант лекарственной устойчивости проводили с использованием базы CARD³, а также нуклеотидных последовательностей отдельных генов, встречающихся у холерных вибрионов и отбранных в соответствии с набором включенных в исследование антибиотиков (табл. 3). Фенотипически чувствительность/устойчивость штаммов к антибактериальным препаратам определяли согласно МУК 4.2.2495-09⁴.

 

Таблица 3. Гены, использованные для идентификации детерминант антибиотикорезистентности в WGSs НАГ-вибрионов

Table 3. Genes used for identification of antibiotic resistance determinants in WGSs of NAGs

 

WGSs штаммов, полученные нами в рамках настоящего исследования, депонированы в NCBI GenBank (BioProject: PRJNA781803, BioSample ID SAMN23296539-23296546).

РЕЗУЛЬТАТЫ

С помощью SNP-анализа WGSs 8 штаммов НАГ-вибрионов была построена дендрограмма, отражающая их сходство и различия (рис. 1).

 

Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа (UPGMA) распределения 3683 SNP, расположенных в открытых рамках считывания. В исследование включали только те SNP, для которых в пределах 9 п.н. от исследуемого полиморфизма не зафиксировано других мутаций.

 

Как видно из рис. 1, все штаммы различались между собой по содержанию SNP, хотя некоторые обладали более выраженным сходством друг с другом и образовали несколько кластеров, что указывает на отсутствие общих источников инфицирования даже в случаях одного места и времени выделения.

Далее были проведены идентификация в WGSs детерминант факторов патогенности/персистенции и их сравнительный биоинформационный анализ.

BLAST-анализ показал, что все исследованные штаммы были лишены профагов CTX, preCTX и RS1, острова патогенности VPI, гена термостабильного токсина stn/sto, а также острова пандемичности VSP-I. Однако остров VSP-II был выявлен у двух штаммов (173 и 1175).

Вместе с тем штаммы могли существенно различаться как по наборам генетических детерминант, так и по их аллельному составу. Так, всего у 2 штаммов, выделенных в Москве в 2019 г., присутствовали гены cholix-токсина (ChxA): у 173 — chxAI, у 1175 — chxAII.

Интактный кластер RTX, ответственный за синтез цитотоксина-актиномодулятора MARTX, присутствовал у всех штаммов, однако ген собственно токсина rtxA отличался значительной вариабельностью по длине и числу молчащих и миссенс-мутаций, что отразилось на аа-составе продуктов разных аллелей. Как видно из рис. 2, только у 2 штаммов белки MARTX оказались наиболее близкими прототипному RtxA1 и содержали все характерные для него активные домены: актин-связывающий (ACD), инактивирующий Rho-ГТФазу (RID), цистеиновой протеазы (CPD) и α-β-гидролаз (α/βH), два других отличались от них не только длиной, но и отсутствием ACD. Белки оставшихся 4 штаммов, лишенные не только ACD, но и α/βH, содержали по 2 RID. Кроме того, у них появился новый домен, описанный программой «BLASTP» как «rtxA-подобный». На дендрограмме они образовали отдельный кластер.

 

Рис. 2. Дендрограмма, построенная по результатам AlignX-анализа MARTX НАГ-вибрионов (a) и топография доменов в их молекулах (б).

 

Ген гемолизина hlyA был интактным у всех 8 штаммов, хотя и представлен разными отличными от прототипа аллелями за счёт молчащих и миссенс-мутаций. Такая же картина наблюдалась и при анализе входящего в состав hly локуса гена металлопротеазы prtV. Оба гена имели «нормальную» (идентичную прототипу длину (соответственно 2226 и 2757 п.н.). Во всех геномах также присутствовали интактные гены других металлопротеаз — гемагглютинин протеазы HapA и коллагеназы VchC.

Кроме генов металлопротеаз, были идентифицированы гены сериновых протеаз vesA, vesC, ivaP, rssP, тогда как vesB найден только у 4 штаммов (1175, 118, 20284 и 41), у остальных он отсутствовал. Все исследуемые штаммы содержали разные аллели гена vesC, у четырех (173, 14980, 20377, 735) довольно близкие прототипу, у остальных они имели ряд делеций, кратных 3 нуклеотидам, в результате чего их продукты укоротились с 548 аа до 545 аа у штамма 118, 538 аа — у 1175 и 20284 аа, 534 аа — у 41, однако преждевременных стоп-кодонов не образовалось. Кроме того, у всех сохранились характерные активные домены и каталитическая триада Asp122, His75, Ser225 (у 3 последних — Ser219 за счёт предшествующей делеции 6 аа, однако остаток серина находился в короткой последовательности GDSGGPIFF, идентичной у всех штаммов). Также в типовых позициях находились S63, G159, Y277, Q279 (Q273), замещение которых на другие аа может приводить к блокировке активности белка [11].

Гены IvaP также различались по длине и нуклеотидному составу, однако их продукты имели те же домены, что у прототипа. В базах NCBI найдены их гомологи, принадлежащие штаммам из разных регионов мира (EGR2467683, KAA1203788, MBJ6933743, EGQ7641687 и др.). Гены ромбосортазы rssP также были представлены разными аллелями, из которых только один (штамма 735) был близок прототипу (со старт-кодоном TTG), тогда как 7 остальных были укорочены до 60 п.н. из-за SNP G58T и образования преждевременного стоп-кодона. Однако ниже этой открытой рамки считывания (ORF) образовалась вторая, со старт-кодоном GTG. Продукты этих ORF2 (183–185 аа), различаясь между собой по аа-составу, тем не менее имели все 4 характерных активных домена. Такие формы RssP широко представлены в NCBI и обозначены как ромбосортазы V. cholerae.

Значительным разнообразием отличались и гены cef (CHO cell elongating factor). Продукты всех 8 аллелей этого гена, несмотря на существенные различия, сохранили все характерные активные домены — Куница, лейциновую молнию, α/βH и LIP, а также субстрат-связывающий сайт GHSLG.

Что касается таких факторов, как контакт-зависимые системы секреции — 6-го и 3-го типов (T6SS и T3SS), то гены первой, входящие в состав основного кластера (vipAB, hiF, vasABCDEF, clpV, vasHIJKLM), присутствовали в WGSs всех 8 штаммов, тогда как гены эффектора vgrG3 отличались вариабельностью, и только у 2 штаммов (14980 и 735) сохранили полную последовательность, кодирующую концевой пептидокликан-связывющий домен PBD, у остальных были значительно укорочены. Также не у всех выявлены гены дополнительных кластеров T6SS [12]. Aux-1 отсутствовал у штаммов 118 и 173, у остальных обнаружен ген эффектора vgrG1 с последовательностью, кодирующей актин-связывающий домен ACD, но все были лишены tseL. Aux-2 не был найден у штаммов 20377 и 41, у остальных содержал гены эффекторов vasW и vasX. Aux-3 отсутствовал во всех WGS, а последовательности, гомологичные таковым Aux-4 [12], имелись у штаммов 1175, 41 и 735.

У одного из штаммов (118) присутствовал кластер T3SS, включая коровую область (гены регуляторов транскрипции vttR-A, B; структурных компонентов vcsN2, C2, T2, R2, Q2, U2, V2, J2, vspD; транслоконов vopH, A, M, I, W, F и 2 вариабельных фланкирующих участка: 3’ (ген предполагаемого фактора вирулентности acfA, транслоконов vopE, X) и 5’ (ген предполагаемых факторов вирулентности acfC, D и транслоконов vopG, K, Y, Z). Кроме того, в состав всех трех участков входили гены, функции которых пока не установлены. У штамма 118 структура кластера T3SS в целом совпадала с таковой референс-штамма АМ-19226, особенно коровой области, за исключением присутствия в ней дополнительной ORF длиной 1368 п.н., кодирующей белок-шаперон, после vopW. Почти все гены имели ту же длину, что у прототипа, но отличались значительным количеством SNP, ни один их которых не вызвал появления преждевременного стоп-кодона.

При анализе кластеров генов, обусловливающих продукцию маннозо-чувствительных пилей адгезии, установлено, что все изученные штаммы содержали изменённые гены структурных единиц пилей, ранее обозначенные нами как mshA-like и mshC-like [13]. Их продукты различались по аа-составу и на дендрограммах имели разную степень сходства друг с другом (данные не показаны), однако все сохраняли активные домены адгезинов. Белки MshA-like могли различаться и по длине (148–162 аа), тогда как MshC-like все содержали по 170 аа. Ни один не имел близкого родства с прототипными белками MshA (178 аа) и MshC (162 аа).

Кроме msh-кластера, у всех штаммов также присутствовали кластеры генов, ответственных за образование полисахаридов vpsI (vpsUABCDEFGYIJK), vpsII (vpsLMNOPQ) и матрикса биоплёнки rbm (rbmABCDEF), расположенного между ними. Все перечисленные гены у исследуемых штаммов в разной степени отличались как от прототипа, так и друг от друга по нуклеотидному составу, а некоторые и по длине, однако ни у одного не образовалось преждевременного стоп-кодона. Интактными оказались и гены регуляторов их экспрессии, локализованные в других участках генома — положительных (VpsR, VpsT) и отрицательных (CytR, HapR и H-NS). Наиболее гетерогенным оказался кластер vpsI: только у 5 штаммов (1175, 14980, 20284, 20377 и 735) его структура полностью совпадала с прототипом, хотя в самих генах обнаруживались различные SNP. Напротив, у остальных выявлены отклонения, состоящие в отсутствии генов vpsC, vpsG и появлении новых ORF, не идентифицированных программой «BioEdit». Так, у штаммов 173 и 41 при отсутствии идентифицируемых vpsF и vpsG на их месте находились 2 ORF. Согласно данным программы «BLASTP», продукт первой имел 99–100% идентичности ряду гипотетических белков холерных вибрионов (EGR4217822, EGQ7706406, EGQ7879351 и др.), однако самой программой был обозначен как белок синтеза полисахаридов семейства VpsF (WP_000660859). Продукт второй ORF также имел 99–100% гомологи в базе NCBI среди гликозилтрансфераз V. cholerae (WP_113629015, EEO14829, EGQ9982865, EGR2039702, EGR2114868 и др.). У штамма 118 перед геном, сходным с vpsI, находились 3 дополнительных ORF, имеющих гомологи в NCBI; продукт одной из них (ORF2) был гомологичен большей части молекул белков, обозначенных как рибозилтрансферазы (WP_108243855, EGQ7689606 и др.) и содержал соответствующие активные домены, тогда как продукты ORF1 и ORF3 одинаковой длины (374 аа), но с совершенно различным аа-составом, тем не менее содержали одинаковые потенциальные домены. Один из которых имеет отношение к синтезу полисахаридов, функция второго неизвестна, хотя он сходен с RimK α-глутаматлигаз.

Самой выраженной вариабельностью обладал ген vpsU. У всех исследуемых НАГ-вибрионов эти гены различались по нуклеотидному составу, у некоторых также по длине и старт-кодонам, а у штамма 118 он даже не был идентифицирован программой «BioEdit», однако в дальнейшем в его продукте программой «BLASTP» были выявлены те же домены низкомолекулярных тирозинфосфатаз, что и у VpsU.

Кластеры vpsII и rbm были более или менее близки прототипам (не считая SNP в генах), за исключением «неопознанного» гена rbmA штамма 20284, продукт которого был гомологичен гипотетическим белкам V. cholerae (WP_142569116, TQP27817, TQQ39191 и др.) и RbmA V. albensis (EEO04139).

Генов, гомологичных детерминантам антибиотикорезистентности (табл. 3), не выявлено почти у всех исследованных штаммов НАГ-вибрионов (табл. 4). Исключением явилось обнаружение гена blaP1 у штамма 735 и catB9 у него же и штаммов 118 и 14980. В то же время у всех выявлен ген nsfA, хотя его связь с устойчивостью к фуразолидону описана для ряда бактерий, но не для холерных вибрионов. Что касается детерминант эффлюкс-помп, участвующих в обеспечении множественной лекарственной устойчивости, то они присутствовали у всех штаммов. Не удалось выявить мобильных элементов (SXT, интегронов класса 1, плазмид) и связанных с ними интеграз. Фенотипически все исследованные штаммы были устойчивы к фуразолидону и чувствительны к большинству антибиотиков. Вместе с тем некоторые проявляли резистентность к отдельным препаратам — от 1 до 4 (табл. 4).

 

Таблица 4. Минимальная подавляющая концентрация (мг/л) штаммов V. cholerae nonO1/nonO139 и наличие генов антибиотикорезистентности

Table 4. Minimal inhibitory concentrations (mg/l) for V. cholerae nonO1/nonO139 strains and presence of genes associated with antibiotic resistance

Примечание. TET — тетрациклин, DOX — доксициклин, CMP — хлорамфеникол, AMP — ампициллин, CFT — цефтриаксон, NAL — налидиксовая кислота, CIP — ципрофлоксацин, STR — стрептомицин, KAN — канамицин, GEN — гентамицин, RIF — рифампицин, FUR — фуразолидон, SXT — триметоприм/сульфаметоксазол.У всех штаммов также выявлены гены эффлюкс-помп VC1634, vcmABDHN, vcrM и не выявлены SXT, интегроны 1 класса и плазмиды. R — устойчивость, I — промежуточная устойчивость; остальные значения соответствуют чувствительности в соответствии с МУК 4.2.2495-09.

Note. TET — tetracycline, DOX — doxycycline, CMP — chloramphenicol, AMP — ampicillin, CFT — ceftriaxone, NAL — nalidixic acid, CIP — ciprofloxacin, STR — streptomycin, KAN — kanamycin, GEN — gentamicin, RIF — rifampicin, SXT — trimethoprim/sulfamethoxazoleAll strains also shared efflux pump genes VC1634, vcmABDHN, vcrM, and lacked SXTelements, class 1 integrons and plasmids. R — resistance, I — intermediate resistance; the rest values correspond to sensitivity, in accordance with MUK 4.2.2495-09.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

SNP-анализ показал, что исследованные штаммы НАГ-вибрионов, выделенные от разных больных, в большей или меньшей степени различались. Эти данные подтвердили отсутствие общих источников инфицирования даже в случаях одного места и времени выделения, что не удивительно, поскольку внекишечные формы заболеваний возникают, как правило, спорадически и не связаны с локальными вспышками.

Наибольший интерес представлял сравнительный анализ структуры генов факторов патогенности, которые могли внести свой вклад в развитие заболеваний, а также факторов персистенции, обеспечивающих выживание в водоёмах, обычно служащих источниками инфекции при отитах. При этом многие биологически активные субстанции вибрионов совмещают в себе свойства тех и других, т.е. являются по сути факторами патогенности/ персистенции.

Гены одного из таких факторов — cholix-токсина — были выявлены у 2 из 8 штаммов, причём в виде разных аллелей: chxAI и chxAII. Продукты этих генов (в отличие от третьей известной формы ChxAIII) считаются причастным к развитию в основном внекишечных форм заболеваний, тогда как их роль в патогенезе острых кишечных инфекций остаётся спорной [14]; в то же время все 3 формы могут способствовать персистенции возбудителей в ассоциации с водными ракообразными [15].

Одним из существенных факторов патогенности холерных вибрионов считается высокомолекулярный цитотоксин-актиномодулятор MARTX, чья биологическая активность обусловлена присутствием в молекуле нескольких активных доменов: ACD, RID, CPD, α/βH. У нетоксигенных штаммов, в особенности у НАГ-вибрионов, кодирующий его ген rtxA может быть представлен множеством аллелей. Среди их продуктов зачастую встречаются белки, утратившие один или более доменов, иногда взамен приобретя новые [16]. Наиболее близкими к прототипному MARTX оказались продукты генов двух разных по происхождению штаммов, два других отличались от них не только длиной, но и отсутствием ACD. Белки оставшихся 4 штаммов, лишённые не только ACD, но и α/βH, содержали по 2 RID. Наибольший интерес представляет обнаружение у них rtxA-подобного домена (cd14729⁵), который не выявлялся в MARTX возбудителей кишечных инфекций, изученных нами ранее [16]. Этот домен ещё недостаточно охарактеризован, однако, согласно аннотации программы «BLASTP», встречается у ряда белков, включая MARTX этиологического агента наиболее опасных раневых инфекций V. vulnificus и дермонекротический токсин Pasteurella multicida — возбудителя пастереллеза, который у людей также может протекать в форме раневой инфекции. Поэтому не исключено, что данный изменённый фактор мог приобрести свойства других токсинов, способных участвовать в патогенезе.

В качестве мощного фактора патогенности может выступать гемолизин/цитолизин HlyA, особенно у нетоксигенных штаммов разных серогрупп [1]. В нашем случае кодирующий его ген был интактным у всех 8 штаммов, хотя и представлен разными отличными от прототипа аллелями за счёт молчащих и миссенс-мутаций. Такая же картина наблюдалась при анализе входящего в состав hly-локуса гена металлопротеазы PrtV, обладающей цитотоксической активностью за счёт деградации фибриногена, фибронектина и плазминогена, а также оказывающей летальное действие на водных беспозвоночных, питающихся бактериями [17]. Гены других металлопротеаз — гемагглютинин протеазы HA/P и коллагеназы VchC — также были интактными. Первая может выступать в роли токсина-актиномодулятора и обеспечивать конкурентоспособность вибрионов в разных экологических нишах, благодаря широкому спектру протеолитической активности, вторая, предположительно, способствует развитию раневых инфекций и утилизации коллагена гидробионтов в качестве источника питания [18].

Гены сериновых протеаз vesA, vesC, ivaP, rssP выявлены у всех штаммов, а vesB — только у 4, у остальных он отсутствовал. VesC способствует развитию воспалительной диареи [19], причастность к внекишечным формам заболевания и конкурентоспособности вибрионов нигде не описана, хотя можно предположить, что протеолитическая активность позволяет утилизировать белковые субстраты. VesA и VesB наряду с HA/P могут активировать А-субъединицу холерного токсина, что не актуально для нетоксигенных штаммов, но вносят (особенно вторая) значительный вклад в протеолитическую активность холерных вибрионов [20]. Поскольку холерные вибрионы обладают множеством протеаз, отсутствие гена vesB у 4 исследуемых штаммов вполне может компенсироваться экспрессией других генов. IvaP — сериновая протеаза семейства S8 — участвует в деградации фактора иммунной защиты макроорганизма интелектина, а также в переходе планктонных бактериальных клеток в биоплёнку и обратно [20]. Ромбосортаза (RssP) осуществляет посттранскрипционную модификацию Ves-протеаз, однако экспериментальные данные были получены с использованием прототипной RssP [21], тогда как активность ее изменённых форм неизвестна.

Значительным разнообразием отличались и гены cef, кодирующий цитотонический токсин, одновременно обладающий свойствами липазы/ эстеразы, ответственной за усвоение липидных субстратов и способной к разрушению поверхностно-активных веществ, в настоящее время часто загрязняющих поверхностные водоемы. Продукты всех 8 аллелей генов cef, несмотря на существенные различия, сохранили все характерные активные домены. Причастность Cef к патогенезу внекишечных форм заболеваний не известна, однако его способность повреждать ультраструктуру культивируемых клеток [22] не исключает такой возможности.

Важным фактором патогенности/персистенции холерных вибрионов является T6SS: в организме хозяина вызывает обездвиживание и гибель макрофагов, способствует колонизации кишечника [23], в объектах окружающей среды защищает вибрионы от поедания одноклеточными хищниками, питающимися бактериями, и участвует в колонизации хитина водных беспозвоночных, а в обоих нишах — убивает бактерий-конкурентов, продукты лизиса которых могут служить источниками питания [24]. Отсутствие у некоторых исследованных штаммов отдельных детерминант T6SS вызывает сомнения по поводу возможности её экспрессии, в особенности у штаммов 118, 173, 20377 и 41, поскольку у двух первых отсутствовал ген ключевого эффектора vgrG1, у двух вторых — vasX. Кроме того, у всех 8 штаммов отсутствовал ген tseL. Вместе с тем известно, что VgrG1, VasX и TseL необходимы для проявления устойчивости к поеданию простейшими, а последний и VgrG3 обеспечивают антагонистическую актиность по отношению к бактериям, причём степень утраты данных свойств зависит от числа отсутствующих либо повреждённых генов [25], поэтому для определения соответствующих фенотипов исследуемых штаммов требуются дополнительные экспериментальные исследования.

Наличие интактного кластера T3SS у одного из штаммов предполагает возможность экспрессии данной системы секреции. Известно, что она способствует колонизации кишечника и развитию тяжёлой летальной диареи у лабораторных животных [26]. Высказывалось предположение о её возможном вкладе в выживаемость вибрионов в объектах окружающей среды в ассоциации с водными организмами [27].

Одной из составляющих успешного переживания в водоёмах является способность вибрионов к биоплёнкообразованию. Кодируемые msh-кластером пили MSHA обеспечивают адгезию бактериальных клеток к абиотическим и биотическим поверхностям, предшествующую формированию биопленки, а её дальнейшее созревание зависит от экспрессии генов, организованных в 3 сцепленных кластера: vpsI-rbm-vps-II. Несмотря на существенные различия в структуре этих кластеров, мы полагаем, что все они находятся в функционально активном состоянии. Ранее нами были выявлены штаммы V. cholerae O1 серогруппы, обладающие сходной структурой генов mshA-like, mshC-like, vps, rbm и при этом в экспериментах in vitro образовавшие зрелые биоплёнки на стекле с гораздо большей скоростью по сравнению со штаммами, содержащими прототипные либо близкие им кластеры [9]. Не исключено, что именно эти изменения лежат в основе селективных преимуществ и НАГ-вибрионов. MSHA обычно связывают с персистенцией холерных вибрионов в водоёмах за счёт формирования биоплёнок на абиотических и биотических поверхностях и противостояния поеданию водными беспозвоночными, тогда как их роль в колонизации кишечника человека считается незначительной. Однако MSHA-подобные пили не чувствительны к маннозе, и в условиях эксперимента штаммы НАГ-вибрионов — возбудители острых кишечных инфекций с таким же генотипом — обладали адгезивной активностью [13]. Это позволяет предположить, что в отсутствие пилей TCP и других адгезинов они могут брать на себя роль ключевого фактора колонизации.

Для успешного лечения НАГ-инфекций крайне важны данные о спектрах резистентности штаммов-возбудителей. В литературе описан случай полного излечения больного, страдавшего от хронического отита в течение 3 лет, после непродолжительного применения ушных капель с правильно подобранным антибиотиком (ципрофлоксацином) [4]. Известны и другие случаи успешного лечения отитов препаратами, подобранными на основе антибиотикограмм [3][5][6]. В литературе встречаются сообщения о штаммах НАГ-вибрионов, устойчивых к одному и более антибактериальным препаратам и содержащих соответствующие генетические детерминанты в составе интегронов либо плазмид [28][29]. Изученные нами штаммы не содержали мобильных элементов SXT, интегронов 1 класса, плазмид и, соответственно, связанных с ними детерминант антибиотикорезистентности. В большинстве случаев их отсутствие коррелировало с чувствительностью к антибиотикам. Однако иногда наблюдалось несоответствие результатов изучения фено- и генотипов. Например, 5 из 8 штаммов были в различной степени устойчивы к ампициллину, и только у одного из них, самого устойчивого, были выявлены гомологи генов бета-лактамаз blaP1, blacarb7, bla-carb9, хотя все они обнаруживались в одной позиции, что указывает на присутствие одного гена в виде аллеля, характерного для этого штамма.

Что касается устойчивости всех изученных нами штаммов к фуразолидону, то не исключается, что она обусловлена продуктом гена nfsA, хотя сведения о связи между его экспрессией и реальной устойчивостью холерных вибрионов к нитрофуранам в литературе отсутствуют.

По одному штамму были устойчивы к цефтриаксону и налидиксовой кислоте, по 2 — к рифампицину и триметоприм/сульфаметоксазолу при полном отсутствии соответствующих генов. И наоборот, все 3 штамма, содержащие catB9, были чувствительны к хлорамфениколу. Аналогичные несоответствия были выявлены S. Lepuschitz и соавт. при изучении штаммов НАГ-вибрионов, выделенных из природного водоёма [8], несмотря на использование ими не только базы данных CARD, но и ResFinder⁶. Авторы считают, что на сегодняшний день эти базы являются недостаточно надёжными для оценки устойчивости НАГ-вибрионов и нуждаются в существенном пополнении.

С другой стороны, экспрессия генов не является единственным способом защиты от антимикробных агентов. Практически все холерные вибрионы, в том числе изученные нами штаммы, имеют эффлюкс-помпы, препятствующие проникновению антибиотиков в бактериальную клетку [30]. Кроме того, устойчивость зависит от внешних факторов и сложных регуляторных механизмов, требующих отдельного изучения.

В связи с вышеизложенным на данном этапе при выборе адекватного препарата для этиотропной терапии НАГ-инфекций следует полагаться в основном на фенотип.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённый анализ показал, что все изученные штаммы-возбудители отитов обладают достаточными наборами детерминант факторов патогенности для успешной реализации патогенетического потенциала, что, впрочем, характерно и для большинства НАГ-вибрионов, причастных к развитию других форм заболеваний (как внекишечных, так и кишечных). Эти наборы могут варьировать от штамма к штамму, но отсутствие одних генов может компенсироваться наличием других, что определяет способность вызывать различные патологические процессы в организме человека. Кроме того, НАГ-вибрионы как естественные обитатели поверхностных водоёмов хорошо приспособлены к длительному существованию в объектах окружающей среды за счёт целого ряда факторов персистенции, причём эти функции часто присущи факторам патогенности, поэтому мы назывем их факторами патогенности/персистенции. Продукция таких факторов находится под контролем ряда регуляторных белков, запускающих либо блокирующих экспрессию в зависимости от пребывания в той или иной экологической нише [1].

Несмотря на то что внекишечные формы НАГ-инфекций носят спорадический характер и не передаются от человека к человеку, выявление в последние годы штаммов-возбудителей на территории России вызывает настороженность и указывает на необходимость повышения внимания к данной группе микроорганизмов. В связи с этим представляется целесообразным включение тестов на присутствие НАГ-вибрионов в схему бактериологического анализа при отитах и других внекишечных инфекциях, этиологическим фактором которых могут быть эти микроорганизмы. В случаях их выделения требуется оперативное определение чувствительности к антибиотикам, что позволит обеспечить применение оптимальной схемы лечения больных или осуществить её своевременную коррекцию.

 

1. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

2. URL: http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit

3. Comprehensive Antibiotic Resistance Database. URL: https://card.mcmaster.ca

4. Методические указания 4.2.2495-09. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам. М., 2009. 59 c.

5. По базе данных CDD — Conserved Domains Database. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd

6. URL: http://www.genomicepidemiology.org

About the authors

Elena V. Monakhova

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Author for correspondence.
Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-9216-7777

D. Sci. (Biol.), chief researcher, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections

Russian Federation, Rostov-on-Don

Alexey S. Vodop'yanov

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-9056-3231

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of molecular biology of natural focal and zoonotic infections

Russian Federation, Rostov-on-Don

Vladimir D. Kruglikov

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-6540-2778

D. Sci. (Med.), Head, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections

Russian Federation, Rostov-on-Don

Nadezhda A. Selyanskaya

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-0008-4705

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections

Russian Federation, Rostov-on-Don

Ruslan V. Pisanov

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-7178-8021

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular biology of natural focal and zoonotic infections

Russian Federation, Rostov-on-Don

Alexey K. Noskov

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0003-0550-2221

Cand. Sci. (Med.), Director

Russian Federation, Rostov-on-Don

References

Supplementary files