Characterization of virulent Escherichia coli strains isolated from patients with urological infection

Cover Page


Cite item

Abstract

Objective. Urinary tract infections (UTIs) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) affect 150 million people annually.
Purpose: Characteristics of non-hospital strains of UPEC isolated from patients with UTI in Yaroslavl in 2016– 2017.
Materials and methods. Susceptibility of UPEC strains (n = 20) to antibacterials was measured by the serial dilution method; the antibiotic resistance and virulence genes, phylogroups, O-serogroups and sequence types were identified by PCR and whole genome sequencing. The virulence of the strains was studied using the model of Galleria mellonella larvae.
Results. UPEC strains were classified as resistant (n = 11) and multi-drug resistant (n = 9) pathogens. Betalactamase genes blaTEM (n = 10), blaCTX-M (n = 6), class 1 integrons (n = 8), and gene cassettes dfrA17-aadA5 (n = 2), dfrA1 (n = 1) and aacA4-cmlA1 (n = 1) were identified. UPEC-virulence genetic determinants coding adhesins fimH, papG, sfaS, focG, afa/draBC, csgA, siderophores iroN, fyuA, iutA, counteracting factors of host immunity ompT, traT, toxins hlyA, cnf1, usp, capsule transporter kpsMTII, colicin cvaC, and pathogenicity islands I536, II536, III536, IV536, IIJ96 и IICFT073 were detected. Highly virulent and slightly virulent for G. mellonella larvae UPEC strains were obtained with LD50 104–105 and 106–107 CFU, respectively. The phylogroups A, B1, B2, E and F, serogroups О2, О4, О6, O9, O11, О15, О18, О25, О75 and O89, known sequence types ST14, ST58, ST69, ST73, ST93, ST127, ST131, ST-141, ST165, ST297, ST457, ST537, ST744, ST1434 and novel ST9239 and ST10102 were revealed.
Conclusions. The identified genetic diversity of non-hospital UPEC strains is consistent with the observed global trend in the spread of human pathogens, which are characterized with both high virulence and multiple drug resistance. This makes possible to assess prospectively the current epidemiological situation, give a forecast for its development in the future, as well as determine the optimal therapeutic options.

Full Text

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) — широко распространённые бактериальные инфекции, ежегодно поражающие в мире 150 млн человек [1]. Доминирующий возбудитель ИМП — уропатогенные Escherichia coli (uropathogenic Escherichia coli — UPEC), которые вызывают 90% внегоспитальных и 50% госпитальных урологических инфекций [2]. В России в 2018 г. E. coli были ведущим возбудителем ИМП в разных субпопуляциях пациентов — от 71 до 80% [3]. Около 50–60% взрослых женщин имеют хотя бы один эпизод ИМП в течение жизни [4]. UPEC-инфекции зачастую вызваны множественно резистентными E. coli, в частности, глобальным доминирующим клоном UPEC сиквенс-типа ST-131, несущим β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) [5]. У продуцентов БЛРС были идентифицированы гены blaCTX-M (до 100% штаммов), blaSHV (~63%), blaTEM (~11%) [6]. Фенотип множественной резистентности ассоциирован с наличием также генетических детерминант, определяющих устойчивость к аминогликозидам (aac, aad, ant, aph), сульфаниламидам (dfr) и фторхинолонам (мутации в хромосомном гене gyrA), а также наличием интегронов класса 1 [7]. К генетическим детерминантам, ассоциированным с проявлением патогенных свойств UPEC, относятся гены адгезинов, токсинов, рецепторов сидерофоров, факторов противодействия иммунной системе макроорганизма, транспортёров капсул 2-й и 3-й групп, колицина V и островов патогенности [6]. В России все штаммы UPEC, выделенные в 2017–2018 гг., несли гены, ответственные за синтез сидерофоров (irp2, iuc, iroN), устойчивость и персистенцию (ompT) и факторы адгезии (fimH, iha) [8].

Штаммы UPEC характеризуются высокой степенью генетической гетерогенности, поэтому важное эпидемиологическое значение имеет молекулярно-генетическая характеристика, позволяющая определить принадлежность штаммов к филогенетическим группам (A, B1, B2, D, E и F), О-группам и сиквенс-типам. Штаммы UPEC, выделенные в разных регионах мира, преимущественно относятся к филогруппам B2 и D, серогруппам O8, O15, O25 и O75, сиквенс-типам ST131, ST69, ST73, ST10, ST127 и ST140 [9–11]. В России описаны штаммы UPEC филогенетических групп A, B1, B2, D, E и F [10][12] и серогрупп О1, О2, О6, О7, О8, О16, О25 и О75 [13, 14]. Публикации о сиквенс-типах штаммов UPEC, выделенных в России, отсутствуют.

Для определения вирулентности штаммов UPEC в последнее время широко используется хорошо охарактеризованная модель личинок большой восковой моли Galleria mellonella [5][15]. Адекватность использования данной модели обеспечивается наличием у личинок элементов иммунной системы (гемоциты гемолимфы, антимикробные пептиды и факторы опсонизации), аналогичных элементам иммунной системы человека [16]. Наибольшей вирулентностью для личинок G. mellonella обладали штаммы UPEC наиболее распространённых в мире генетических линий: ST69, ST73 и ST127, а также серогрупп О2 и О6 [15].

Целью данной работы была характеристика штаммов E. coli, выделенных от пациентов с внегоспитальными ИМП в ходе пилотного одноцентрового исследования в Ярославле, в том числе определение фенотипов и генотипов антибиотикорезистентности, идентификация генов вирулентности, оценка уровней вирулентности на модели личинок G. mellonella, определение принадлежности к филогенетическим группам, О-серогруппам и сиквенс-типам.

Материалы и методы

Биоэтические требования

Использованные в данном исследовании материалы не содержат персональных данных пациентов. В соответствии с требованиями Биоэтического комитета РФ каждый пациент подписывал информированное согласие при поступлении в лечебное учреждение на проведение лабораторных исследований.

Штаммы, условия культивирования и хранения

Штаммы E. coli (n = 20) выделены из образцов мочи от пациентов урологического отделения Инфекционной клинической больницы № 1 г. Ярославля при поступлении в лечебное учреждение, в рамках пилотного одноцентрового клинического исследования в декабре 2016 г. – январе 2017 г. Культуры E. coli выращивали на питательной среде ГРМ 1 (ФБУН ГНЦ ПМБ) в аэробных условиях при 37°C. Хранение культур осуществляли в 20% растворе глицерина при –70°C.

Видовая идентификация

Видовую идентификацию бактерий осуществляли с помощью высевов на дифференциально-диагностические питательные среды «Агар Эндо-ГРМ», «Агар Клиглера-ГРМ», «Железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной» и «Ацетатный агар» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия), с последующим подтверждением на приборе «MALDITOF Biotyper» («Bruker»).

Чувствительность к антимикробным препаратам

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) 17 антимикробных препаратов (АМП) 6 функциональных классов: β-лактамов (ампициллин, ампициллин/сульбактам, амоксициллин/ клавуланат, цефуроксим, цефотаксим, цефтазидим, азтреонам и меропенем), фторхинолонов (ципрофлоксацин, левофлоксацин и норфлоксацин), аминогликозидов (гентамицин), фосфомицинов (фосфомицин), нитрофуранов (фуразолидон, фурацилин и нитрофурантоин) и полимиксинов (колистин) («Sigma-Aldrich») определяли методом микроразведений в бульоне в соответствии с рекомендациями EUCAST Breakpoint tables v 9.01. В качестве стандартного использовали штамм E. coli ATCC25922, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Категорию резистентности штамма определяли в соответствии с [17].

Детекция генов антибиотикорезистентности и вирулентности

Гены, кодирующие β-лактамазы blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-48 и blaNDM, а также интегроны классов 1 и 2 выявляли методом ПЦР со специфичными праймерами [18]. Острова патогенности UPEC I536, II536, III536, IV536, IJ96, IIJ96, ICFT073 и IICFT073 и гены, кодирующие факторы вирулентности UPEC, — фимбрии типа 1 fimH, P фимбрии papGI, papGII, papGIII, S фимбрии sfaS, F1C фимбрии focG, AFA/Dr адгезин afa/draBC, основной белок курли волокон csgA, гемолизин hlyA, цитотоксический некротический фактор cnf1, уропатогенный специфический белок usp, рецепторы сидерофоров сальмохелина iroN, иерсиниабактина fyuA и аэробактина iutA, протеазу внешней мембраны ompT, липопротеин наружной мембраны traT, транспортёры капсулы 2-го типа kpsMTII и 3-го типа kpsMTIII, основной белок колицина V cvaC — определяли методом ПЦР со специфичными праймерами [8][19].

Определение вирулентности штаммов

Уровень вирулентности штаммов E. coli определяли на модели личинок G. mellonella, как описано в работе [15]. Оценивали количество особей, погибших в результате введения им в гемоцель суспензий бактерий в дозах 104, 105, 106, 107, 108 и 109 КОЕ/особь. Все эксперименты проводили в 3 повторностях. Расчёт среднелетальной дозы (ЛД50) штаммов E. coli для личинок проводили согласно методу Кербера в модификации Ашмарина [11]. В опытах использовали личинок G. mellonella, полученных из лабораторной культуры, поддерживаемой во ФБУН ГНЦ ПМБ.

Идентификация филогенетических групп

Принадлежность штаммов UPEC к филогенетическим группам E. coli A, B1, B2, D, E и F определяли с помощью детекции генов, кодирующих геминовый рецептор внешней мембраны chuA, гипотетический протеин yjaA, анкирин-повторяющий белок А arpA, триптофансинтетазу α-SU trpA и эстеразу TspE4.C2, согласно [21].

Определение серологических О-групп

Серологические О-группы определяли методом ПЦР со специфичными праймерами на гены кластера липополисахаридов wzxО1, wzxО4, wzxО16, wzxО18, wzyО2, wzyО6, wzyО15, wzyО25, wzyО75, wzyО11, wztО9 и wztО89 [22].

Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ)

Сиквенс-типы штаммов E. coli определяли с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования 7 генов «домашнего хозяйства»: аденилаткиназы adk, фумаратгидратазы fumC, ДНК-гиразы gyrB, изоцитратдегидрогеназы icd, малатдегидрогеназы mdh, аденил-сукцинатдегидрогеназы purA и АТФ/ ГТФ-связывающего мотива гена recA с последующим определением аллельного профиля на сайте Уорикского университета (Великобритания)2 [23].

Секвенирование нуклеотидных последовательностей

Последовательности ПЦР-продуктов секвенировали в ООО «СИНТОЛ» на генетическом анализаторе «ABI Prizm 3130xl» с использованием наборов для секвенирования «BigDye v3.1» и анализировали с помощью программ «Chromas»(«Technelysium»), «Vector NTI 9» («Life Technologies») и BLAST4.

Полногеномное секвенирование

Полногеномное секвенирование штаммов E. coli проводили с использованием наборов «Nextera DNA Library Preparation Kit» («Illumina») и «MiSeq Reagent Kits v3» («Illumina») на платформе «Illumina MiSeq» согласно инструкции производителя. Единичные прочтения собирали в контиги с использованием программного обеспечения «SPAdes 3.9.0» [24]. Аннотировали собранные геномы с помощью сервера NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline [25]. Анализ полногеномных последовательностей проводили с использованием инструментов Центра геномной эпидемиологии5.

Филогенетический анализ

Филогенетический анализ штаммов E. coli проводили с использованием ресурсов NCBI «Blastn» и «Blast Tree View»на основании сравнения искусственно собранных последовательностей аллельных профилей генов МЛСТ.

Статистический анализ

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета «Microsoft Office 2010» и программы «SPSS Statistica 17.0» («IBM»). Проверку распределения на нормальность осуществляли с помощью критерия Колмогорова–Смирнова, нормальным считалось распределение при двусторонней асимптоматической значимости более 0,05. Различие сформированных групп вирулентности подтверждали методом двухвыборочного t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Различия считали значимыми при величине коэффициента достоверности p < 0,01.

Депонирование нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank

В базе данных GenBank размещены 9 полногеномных последовательностей штаммов UPEC: SERS01000000, SERT01000000, SERU00000000, SERV00000000, JACSYM000000000, SERW01000000, SERX00000000, JACSYL000000000, SERY00000000.

Результаты

Штаммы

Штаммы E. coli выделены от 20 женщин 23– 84 лет с урологическими диагнозами: хронический цистит (n = 12), инфекция мочевыводящей системы без установленной локализации (n = 3), цистит (n = 2), мочекаменная болезнь (n = 2) и гиперактивный мочевой пузырь (n = 1) (табл. 1).

Таблица 1. Клинические данные и резистентность к АМП штаммов E. coli
Table 1. Clinical data and antibacterial resistance of E. coli strains


Примечание. ХЦ — хронический цистит; МКБ — мочекаменная болезнь; ИМВС — инфекция мочевыводящей системы без установленной локализации; ГАМП — гиперактивный мочевой пузырь; Ц — цистит; BL — бета-лактамы; QNL — хинолоны; AMI — аминогликозиды; NIT — нитрофураны; POL — полимиксины; R — резистентный штамм; MDR — множественно резистентный штамм.
Note. CC — chronic cystitis; UL — urolithiasis; UINL — urinary tract infection with no known localization; OB — overactive bladder; C — cystitis; BL — beta-lactams; QNL — quinolones; AMI — aminoglycosides; NIT — nitrofurans; POL — polymyxins; R — resistant strain; MDR — multiply resistant strain.

Фенотипы и генотипы антибиотикорезистентности

Охарактеризованные штаммы UPEC отнесены к 2 категориям резистентности к АМП: резистентные (n = 11) и множественно резистентные (n = 9). Резистентные штаммы были устойчивы к препаратам 1–2-й функциональных групп: β-лактамам и нитрофуранам. Множественно резистентные штаммы были устойчивы к препаратам трех (β-лактамам, фторхинолонам и нитрофуранам), четырех (β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам и нитрофуранам) и пяти (β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам, полимиксинам и нитрофуранам) функциональных групп. При этом все штаммы были чувствительны к фосфомицину (МПК < 32 мг/л), нитрофурантоину (МПК < 64 мг/л) и меропенему (МПК < 0,5 мг/л).

В изучаемых штаммах UPEC выявлены гены β-лактамаз blaTEM (n = 10), blaCTX-M (n = 6), интегразы класса 1 (n = 8) и генные кассеты интегронов класса 1 dfrA17-aadA5 (n = 2), dfrA1 (n = 1) и aacA4-cmlA1 (n = 1). Генов blaSHV, blaKPC, blaOXA-48 и blaNDM не обнаружено. Шесть штаммов не имели детектируемых генов антибиотикорезистентности. Выявлено 5 вариантов сочетаний генетических детерминант резистентности: 1 ген blaTEM определён у 4 штаммов, 1 ген blaCTX-M — у 2, сочетание 2 генов blaTEM+intl1 — у 3, 2 генов blaCTX-M+intl1 — у 2, набор из 3 генов blaTEM+blaCTX-M+intl1 — у 3 штаммов. Генные кассеты интегронов несли детерминанты устойчивости к аминогликозидам aadA5 и aacA4, сульфаниламидам dfrA1 и dfrA17, хлорамфениколу cmlA1. У 5 интегронов генные кассеты отсутствовали (табл. 1).

Генотипы вирулентности штаммов UPEC

В изучаемых штаммах E. coli выявлены гены факторов вирулентности UPEC 7 функциональных групп: адгезинов fimH (n = 20), csgA (n = 20), focG (n = 4), papGII (n = 4), papGIII (n = 4) и sfaS (n = 3); сидерофоров fyuA (n = 15), iroN (n = 11) и iutA (n = 6); токсинов hlyA (n = 7), cnf1 (n = 5) и usp (n = 9); транспортёров капсулы kpsMTII (n = 13); факторов противодействия иммунитету ompT (n = 16) и traT (n = 11); колицина cvaC (n = 1); а также островов патогенности I536 (n = 5), II536 (n = 4), III536 (n = 1), IV536 (n = 15), IIJ96 (n = 5) и IICFT073 (n = 9). Гены адгезинов papGI и afa/draBC, транспортёра капсулы 3-го типа kpsMTIII и острова патогенности IJ96 и ICFT073 в этих штаммах не обнаружены (табл. 2).

Таблица 2. Генетические детерминанты вирулентности, вирулентность для личинок G. mellonella, О-групповая принадлежность, филогенетические группы и сиквенс-типы изучаемых штаммов UPEC
Table 2. Genetic virulence determinants, virulence for larvae of G. mellonella, O-group affiliation, phylogenetic groups and sequence types of UPEC strains


Примечание. ОГ — О-группа; ФГ — филогенетическая группа; ST — сиквенс-тип; NI — не определяется использованным методом; «–» — отсутствие гена; жирным шрифтом выделены значения ЛД50 высоковирулентных штаммов; * — ST идентифицирован в данном исследовании.
Note. OG — O-group; PhG — phylogenetic group; ST — sequence type; NI — not determined by the method used, "–" — the absence of a gene; LD50 values of highly virulent strains are highlighted in bold; * — ST identified in this study.

В разных штаммах UPEC было выявлено разное количество генов вирулентности — от 2 до 14. Гены адгезинов были идентифицированы во всех изучаемых штаммах, гены сидерофоров — в 18, гены факторов противодействия иммунитету — в 17, гены транспортеров капсулы — в 14, гены токсинов — в 9, ген колицина — в 1, острова патогенности — в 15 штаммах. Анализ сочетания факторов вирулентности разных функциональных групп показал, что 7 штаммов несли все 7 групп, 1 штамм — 6 групп, 4 штамма — 5 групп, 4 штамма — 4 группы, 2 штамма — 3 группы, 2 штамма — 1 группу.

Вирулентность штаммов UPEC для личинок G. mellonella

На основании значений ЛД50 для личинок G. mellonella исследуемые штаммы разделены на 2 категории вирулентности: высоковирулентные штаммы с ЛД50 < 106 КОЕ (n = 13) и слабовирулентные с ЛД50 > 106 КОЕ (n = 7), как описано в работе [15]. Показано, что все штаммы в дозе более 1,0 × 108 КОЕ/особь вызывали гибель 100% личинок на 7-е сутки после заражения. При этом ~10% личинок погибали при заражении высоковирулентными штаммами в дозе 104 КОЕ/особь и слабовирулентными штаммами в дозе 106 КОЕ/особь. При заражающей дозе 106 КОЕ/особь выявлялись наибольшие различия в уровнях вирулентности штаммов двух категорий: высоковирулентные штаммы в этой дозе вызывали гибель ~90% личинок, а слабовирулентные — ~10% личинок. На этом основании доза заражения личинок 106 КОЕ/особь использована для дифференциации изучаемых штаммов E. coli по вирулентности (рис. 1). Доказана статистическая достоверность дифференциации штаммов на высоковирулентные и слабовирулентные для личинок G. mellonella в интервале доз заражения 105–107 КОЕ/особь при коэффициенте p < 0,01.

 

Рис. 1. Анализ вирулентности штаммов E. coli на модели личинок G. mellonella.
Fig. 1. Analysis of the virulence E. coli strains in the G. mellonella larvae model.

О-групповая принадлежность, филогенетические группы и сиквенс-типы штаммов UPEC

В ходе исследования идентифицированы 10 О-групп E. coli: О25 (n = 3), О2 (n = 2), O11 (n = 2), О18 (n = 2), О4 (n = 1), О6 (n = 1), O9 (n = 1), О15 (n = 1), О75 (n = 1) и O89 (n = 1). Для 5 штаммов О-группы не идентифицированы с помощью использованного метода типирования. Определена принадлежность штаммов к филогруппам A (n = 4), B1 (n = 3), B2 (n = 10), E (n = 1) и F (n = 2). Идентифицированы 14 ранее известных сиквенс-типов E. coli: ST14 (n = 1), ST58 (n = 1), ST69 (n = 1), ST-73 (n = 1), ST93 (n = 1), ST127 (n = 1), ST131 (n = 3), ST141 (n = 2), ST165 (n = 1), ST297 (n = 1), ST457 (n = 2), ST537 (n = 1), ST744 (n = 1) и ST1434 (n = 1), а также два новых, ранее не описанных сиквенс-типа ST10102 и ST9239 (табл. 2).

К филогруппе A отнесены штаммы О-групп О18, О89; к филогруппе B1 — О9; к филогруппе B2 — О2, О4, О6, О18, О25, О75; к филогруппе E — О15; к филогруппе F — О11 О-групп. Показано, что 3 штамма О25-группы принадлежат к сиквенс-типу ST131, 2 штамма О11-группы — к сиквенс-типу ST457, два штамма О2-группы — к сиквенс-типу ST141. Два штамма О18-группы отнесены к разным сиквенс-типам (ST14 и ST1434) и разным филогруппам (B2 и A; табл. 2).

Стоит отметить, что серогруппы О4, О6, О9, О11, О75 и О89 в данном исследовании идентифицированы только у высоковирулентных штаммов, а серогруппы О15 и О25 — только у слабовирулентных. Две серогруппы — О2 и О18 — были идентифицированы в группе как высоковирулентных, так и слабовирулентных штаммов. Филогруппы A, B1 и F определены только у высоковирулентных штаммов, в то время как филогруппа B2 — в обеих группах вирулентности. Среди 13 высоковирулентных для личинок G. mellonella штаммов E. coli определены 12 сиквенс-типов, среди 7 слабовирулентных штаммов — 5 сиквенс-типов, сиквенс-тип ST141 был идентифицирован как у 1 высоковирулентного, так и у 1 слабовирулентного штамма (табл. 2).

Филогенетическое дерево

Анализ филогенетического родства сиквенс-типов штаммов UPEC выявил два кластера: кластер I, включающий ST457; и кластер II, объединяющий все остальные сиквенс-типы. Кластер II состоит из двух подкластеров: IIa (ST69) и IIb, который включает в себя две подгруппы: IIb-1 (ST14, ST73, ST127, ST131, ST141, ST537 и ST10102) и IIb-2 (ST58, ST93, ST165, ST297, ST744, ST1434 и ST9239). Расположение изученных штаммов UPEC на филогенетическом дереве сиквенс-типов полностью совпадает с принадлежностью штаммов к филогенетическим группам: в кластер I входят штаммы группы F, в подкластер IIa — E, в подкластер IIb-1 — B2 и в подкластер IIb-2 — A и B1. В кластер I и подгруппу IIb-2 вошли только высоковирулентные для личинок G. mellonella штаммы, в подкластер IIa — один слабовирулентный штамм, в подгруппу IIb-1 — как высоковирулентные, так и слабовирулентные штаммы. Новые сиквенс-типы ST9239 (IIb-1) и ST10102 (IIb-2) филогенетически наиболее близки к сиквенс-типам ST297 и ST73 соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Филогенетическое дерево штаммов UPEC, построенное на основании искусственно собранных нуклеотидных последовательностей генов МЛСТ-профиля.

Точкой обозначены сиквенс-типы высоковирулентных штаммов, звездочкой — новые сиквенс-типы.

Fig. 2. Phylogenetic tree of UPEC strains, built on the basis of artificially assembled nucleotide sequences of MLST-profile genes.

The point denotes the sequence types of highly virulent strains, the asterisk — new sequence types.

Интересно отметить, что только штаммы UPEC, относящиеся к филогруппе B2, серогруппам О2, О4, О6, О18, О25, О75 и подгруппе IIb-1 филогенетического дерева, несли гены адгезинов papGII, papGIII, sfaS и focG, гены токсинов hlyA, cnf1, usp и острова патогенности III536, IICFT073, I536, II536, IIJ96 (табл. 2).

Анализ полных геномов штаммов UPEC

Проанализированы 9 полногеномных последовательностей штаммов UPEC, которые характеризовались размерами 4,5–5,4 млн п.н. и ГЦ-составом 51–52%, несущих 4,3–5,2 тыс. генов (табл. 3). В геномах 7 штаммов выявлены генетические детерминанты, определяющие устойчивость к 10 функциональным классам АМП (β-лактамам, аминогликозидам, фениколам, фторхинолонам, полимиксинам, сульфаниламидам, тетрациклинам, макролидам, фосфомицинам и четвертичным аммониевым соединениям). Кроме того, у 8 штаммов идентифицированы гены белка MdfA, обеспечивающего чрезвычайно широкий спектр лекарственной устойчивости (табл. 4). Спектр выявленных генетических детерминант антибиотикорезистентности коррелировал с описанными выше фенотипами устойчивости штаммов к АМП: наличие генов β-лактамаз — с устойчивостью к β-лактамам, генов аминогликозид модифицирующих ферментов — с устойчивостью к аминогликозидам, гена mcr — с устойчивостью к колистину, мутаций в генах gyrA — с устойчивостью к фторхинолонам.

Таблица 3. Характеристика полных геномов штаммов UPEC
Table 3. Characterization of the whole genome sequences of UPEC strains


Примечание. «SCPM-O-B» — State Collection of Pathogenic Microbes – Obolensk – Bacteria (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов – Оболенск – Бактерии).
Note. «SCPM-O-B» — State Collection of Pathogenic Microbes – Obolensk – Bacteria.

Таблица 4. Генетические детерминанты устойчивости к АМП, идентифицированные в полных геномах штаммов UPEC
Table 4. Genetic determinants of antibacterial drug resistance identified in the complete genomes of UPEC strains


Примечание. BL — β-лактамы; AMI — аминогликозиды; QNL — хинолоны; POL — полимиксины; SUL — cульфаниламиды; TET — тетрациклины; MKL — макролиды; FOS — фосфомицины; MDR — транспортёр, обеспечивающий множественную лекарственную устойчивость; QAC — четвертичные аммониевые соединения.
Note. BL — beta-lactams; AMI — aminoglycosides; QNL — quinolones; POL — polymyxins; SUL — sulfonamides; TET — tetracyclines; MKL — macrolides; FOS — fosfomycins; MDR — transporter providing multiple drug resistance; QAC — quaternary ammonium compounds.

В геномах изучаемых штаммов обнаружены гены, кодирующие группы факторов вирулентности: адгезинов, сидерофоров, противодействия иммунитету макроорганизма, капсулообразования, токсинов, бактериоцинов и др. Отмечено значительное разнообразие геномов по количеству идентифицированных генов вирулентности — от 1 до 35. В геномах штаммов были выявлены до 6 генов адгезинов, до 6 генов сидерофоров, до 4 генов факторов противодействия иммунитету организма-хозяина, до 3 генов капсулообразования, до 5 генов токсинов, до 8 генов бактериоцинов и 1–5 генов других факторов вирулентности (табл. 5).

Таблица 5. Генетические детерминанты вирулентности, идентифицированные в полных геномах штаммов UPEC
Table 5. Genetic determinants of virulence identified in the complete genomes of UPEC strains


Примечание. astA — ген термостабильного токсина EAST-1; sat — ген секретируемого токсин-автотранспортёра; senB — плазмидный ген энтеротоксина; air — ген энтероагрегативного иммуноглобулина; ireA — ген рецептора сидерофора; eilA — ген транскрипционного регулятора острова патогенности; gad — ген декарбоксилазы; etsC — ген белка секреции типа I; clbB — ген поликетидмегасинтаза; epeA — ген автотранспортёра; terC — ген белка резистентности к ионам теллурия; tcpC — ген белка, содержащего Tir-домен.
Note. astA — gene of thermostable toxin EAST-1; sat — gene of the secreted toxin-vehicle; senB — enterotoxin plasmid gene; air — gene of enteroaggregative immunoglobulin; ireA — siderophore receptor gene; eilA — gene for the transcriptional regulator of the island of pathogenicity; gad — decarboxylase gene; etsC — type I secretion protein gene; clbB — polyketide megasynthase gene; epeA — vehicle transporter gene; terC — gene for the protein of resistance to tellurium ions; tcpC — gene for a protein containing a Tir domain.

Обсуждение

Объектом данного исследования являлись штаммы уропатогенных E. coli — ведущего возбудителя ИМП как в России, так и во всём мире [2][3]. Показано, что около половины охарактеризованных нами штаммов UPEC относятся к категории множественно резистентных, устойчивы к АМП 3 и более функциональных классов (β-лактамам, фторхинолонам, нитрофуранам, аминогликозидам, полимиксинам), что согласуется с ранее опубликованными данными [3]. Поскольку все штаммы в нашем исследовании были чувствительны к фосфомицину, нитрофурантоину и меропенему, данные АМП могут рассматриваться в качестве препаратов выбора в клинической практике, что согласуется с данными, полученными для России [3].

Фенотипы множественной лекарственной устойчивости коррелировали с наличием генетических детерминант антибиотикорезистентности: генов β-лактамаз blaTEM, blaCTX-M и blaOXA типов, генов аминогликозид-модифицирующих ферментов aac, aph и aad типов, гена колистин-модифицирующего фермента mcr, мутаций в гене ДНК-гиразы gyrA, обеспечивающих устойчивость к β-лактамам, аминогликозидам, колистину и фторхинолонам соответственно. Аналогичные гены были выявлены в штаммах UPEC в работе [6]. Обращает на себя внимание разнообразие идентифицированных аллелей эпидемически значимого гена БЛРС blaCTX-M — 14, 15, 27 и 55, обнаруженных в трети изученных штаммов за достаточно короткий промежуток времени исследования у небольшой группы пациентов с внегоспитальными инфекциями. Это согласуется с большим разнообразием аллелей гена blaCTX-M, описанным в исследовании европейских авторов для госпитальных и внегоспитальных штаммов UPEC [26], а также с увеличением доли БЛРС-продуцирующих штаммов UPEC в России [3]. Необходимо подчеркнуть, что в 2 штаммах идентифицирован ген устойчивости к антибиотику резерва колистину mcr-1.

В геномах изучаемых штаммов UPEC выявлено большое количество и разнообразие генетических детерминант вирулентности. Все штаммы имели гены fimH и csgA, что аналогично данным, описанным в работах других авторов [8][27]. Ген afa/draBC в изученных нами штаммах E. coli не обнаружен, в то время как в работе [27] встречаемость данного гена составляла 15%. В нашем исследовании представленность генов fyuA, iroN и iutA составляла 83, 50 и 45%, что принципиально не отличается от данных других авторов: 78, 36–68 и 67% соответственно [8][27]. Интересно отметить, что гены рецепторов сидерофоров в нашем исследовании чаще встречались в сочетаниях, чем индивидуально: fyuA + iroN (n = 6), fyuA + iutA (n = 3) и fyuA + iroN + iutA (n = 3). Гены факторов противодействия иммунитету макроорганизма ompT и traT были выявлены у большинства штаммов нашего исследования (83 и 61% соответственно), что аналогично другим данным — 75 и 71% соответственно [27]. Наличие генов focG и sfaS и оперона pap в нашем исследовании отмечено у 22, 17 и 44% изучаемых штаммов соответственно, что аналогично данным [8], но отличается от данных в других исследованиях — 50, 26 и 80% соответственно [27]. Ген hlyA в нашем исследовании идентифицирован у 39% штаммов, что примерно соответствует уровню встречаемости (42%) этого гена в исследовании российских авторов [8], но ниже, чем в работе [27] — 76%. Ген cnf1 в нашем исследовании встречался у 28% штаммов, а в работе [27] — у 83% штаммов. Таким образом, в нашем исследовании у подавляющего большинства штаммов присутствовали гены адгезинов, сидерофоров и факторов противодействия иммунной системе.

Фенотипическое проявление вирулентности исследуемых штаммов UPEC изучали на модели личинок G. mellonella, которая широко используется для характеристики бактериальных уропатогенов [15][16]. Показано, что множественно резистентным фенотипом обладали 6 высоковирулентных штаммов из 13, что указывает на вовлечённость в процесс объединения потенциалов вирулентности и антибиотикорезистентности UPEC.

Профили генов вирулентности, выявленные в нашей работе в полных геномах штаммов UPEC, различались у высоко- и слабовирулентных штаммов. Гены lpfA, papA_F12, focC, sfaD, ireA, air, neuC, kpsMII_K1, astA, cma, cvaC, cea, celb, mchB, mchC, mchF, mcmA, eilA, tcpC и epeA встречались только в геномах высоковирулентных штаммов, а гены papA_F43, afaD, ibeA, kpsMII_K5, sat, senB — только в геномах слабовирулентных штаммов.

Важно отметить, что исследованные в нашей работе внегоспитальные штаммы UPEC, как и во всем мире, характеризуются высокой степенью генетической гетерогенности: идентифицированы 3 филогенетические группы, 10 О-групп и 16 сиквенс-типов. По данным литературы, выявленные нами серогруппы О2, О6, О15, О25 и О75 относятся к числу часто встречающихся у UPEC [10][13][14]. Это согласуется также с тем, что в базе данных EnteroBaseна 20.09.2020 серогруппы O2, O4, O6, O18, O25 и О75 были представлены более чем 10 штаммами UPEC каждая, а серогруппы O9, O11, О15 и O89 — менее чем 10 штаммами каждая. Стоит отметить, что штаммы серогруппы О6 охарактеризованы как высоковирулентные для личинок G.mellonella и в нашем исследовании, и в работе [15]. В то же время штаммы О15- и О25-групп были отнесены нами к слабовирулентным для личинок G. mellonella, а штаммы О2- и О18-групп — и к высоковирулентным, и к слабовирулентным штаммам, что не совпадает с результатами исследования [15].

Показано, что штаммы 11 сиквенс-типов, в том числе нового ST-9239, принадлежат к категории высоковирулентных, а 4 сиквенс-типов, в том числе нового ST-10102, — к категории слабовирулентных. Сиквенс-тип ST-131, описанный в нашей работе, характерен для штаммов UPEC во всём мире (65 упоминаний среди UPEC в базе данных EnteroBase на 20.09.2020). Другие характерные для UPEC сиквенс-типы ST69, ST73, ST127, ST14, ST58, ST93, ST141, ST457, ST537 и ST297, описанные в нашем исследовании, также представлены в базе данных EnteroBase (от 1 до 106 упоминаний среди UPEC на 20.09.2020). В нашей работе впервые описаны штаммы E. coli сиквенс-типов ST165, ST744 и ST1434, выделенные от человека с ИМП; ранее эти сиквенс-типы были ассоциированы с другими патогруппами E. coli (согласно базе данных EnteroBase на 20.09.2020). В нашем исследовании штаммы E. coli ST131 обладали слабой вирулентностью для личинок G. mellonella, что совпадает с результатами [15]. Интересно, что все штаммы этого сиквенс-типа в нашем исследовании принадлежали к серогруппе О25, а в упомянутой работе — не только к серогруппе О25, но и к другим серогруппам [15].

Высоко- и слабовирулентные штаммы UPEC подгруппы IIb-1 филогенетического дерева, относящиеся к характерным для UPEC филогруппе B2 и серогруппам О2, О4, О6, О18, О25 и О75, несли ген usp, кодирующий токсин — уропатогенный специфический белок Usp, что согласуется с опубликованными ранее данными о наличии ассоциации гена usp с сиквенс-типами ST131, ST69, ST73 и ST141 [9].

Полученные нами данные о принадлежности штаммов UPEC ST73 серогруппы О6 и ST127 серогруппы О4 к группе высоковирулентных для личинок G. mellonella аналогичны описанным в литературе [15]. В то же время штамм UPEC серогруппы О15 сиквенс-типа ST69 в нашем исследовании отнесён к слабовирулентным, а в работе [15] — к высоковирулентным UPEC. Особое внимание обращают на себя два высоковирулентных для личинок G. mellonella штамма E. coli (O11, ST457), которые характеризовались устойчивостью к резервному антибиотику колистину и несли ген mcr-1. Ранее mcr-1-позитивные штаммы UPEC такого же сиквенс-типа были описаны в Китае [28]. В России этот ген был детектирован ранее в штаммах E. coli сиквенс-типов ST156 и ST359 [29].

Заключение

Описано генетическое разнообразие изученных внегоспитальных штаммов UPEC, относящихся к 3 филогенетическим группам, 10 О-группам и 16 сиквенс-типам и несущих разные наборы генетических детерминант факторов патогенности и антибиотикорезистентности. Все штаммы отнесены к категории резистентных, у половины из них определена множественная лекарственная устойчивость, обусловленная наличием генов устойчивости к β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам и др., что согласуется с общемировой тенденцией распространения антибиотикорезистентности среди внегоспитальных патогенов. Идентифицированы две группы штаммов UPEC по степени вирулентности на модели личинок G. mellonella — высоковирулентные и слабовирулентные, геномы которых существенно отличались по наличию наборов генов адгезинов, сидерофоров, токсинов, факторов противодействия иммунитету макроорганизма, капсулообразования и островов патогенности. Описаны штаммы UPEC, характеризующиеся одновременно высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью во внегоспитальной среде. Дальнейшее накопление данных позволит оценить эпидемиологическую ситуацию по ИМП, дать прогноз её развития в будущем, а также определить оптимальные направления терапии.

 

×

About the authors

P. V. Slukin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Author for correspondence.
Email: xopgi@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4976-0145

Pavel V. Slukin - researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

E. I. Astashkin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3559-9071

Eugeny I. Astashkin - Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

E. M. Aslanyan

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9538-9968

Elena M. Aslanyan - researcher, Disinfectology department

Obolensk

Russian Federation

M. G. Ershova

Infectious Clinical Hospital No. 1

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4691-648X

Marina G. Ershova - Head, Microbiology laboratory

Yaroslavl

Russian Federation

E. D. Poletaeva

Infectious Clinical Hospital No. 1

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7074-6989

Elena D. Poletaeva - bacteriologist, Microbiology laboratory

Yaroslavl

Russian Federation

E. A. Svetoch

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3185-1954

Edward A. Svetoch - D. Sci. (Vet.), Professor, chief researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

A. P. Shepelin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8253-7527

Anatoly P. Shepelin - D. Sci. (Biol.), Deputy director for scientific and industrial Work

Obolensk

Russian Federation

N. K. Fursova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6053-2621

Nadezhda K. Fursova - Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

References

  1. Öztürk R., Murt A. Epidemiology of urological infections: a global burden. World J. Urol. 2020; 38: 2669–79. https://doi.org/10.1007/s00345-019-03071-4
  2. Javed S., Mirani Z.A., Pirzada Z.A. Phylogenetic group B2 expressed significant biofilm formation among drug resistant uropathogenic Escherichia coli. Libyan. J. Med. 2021; 16(1): 1845444. https://doi.org/10.1080/19932820.2020.1845444
  3. Палагин И.С., Сухорукова М.В., Дехнич А.В., Эйдельштейн М.В., Перепанова Т.С., Козлов Р.С. Антибиотикорезистентность возбудителей внебольничных инфекций мочевых путей в России: результаты многоцентрового исследования «ДАРМИС-2018». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2): 134–46. https://doi.org/10.36488/cmac.2019.2.134-146
  4. Medina M., Castillo-Pino E. An introduction to the epidemiology and burden of urinary tract infections. Ther. Adv. Urol. 2019; 11: 1756287219832172. https://doi.org/10.1177/1756287219832172
  5. Zhong Z.X., Cui Z.H., Li X.J., Tang T., Zheng Z.J., Ni W.N., et al. Nitrofurantoin combined with amikacin: a promising alternative strategy for combating MDR uropathogenic Escherichia coli.Front. Cell Infect. Microbiol. 2020; 10: 608547. https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.608547
  6. Naziri Z., Derakhshandeh A., Soltani Borchaloee A., Poormaleknia M., Azimzadeh N. Treatment failure in urinary tract infections: A warning witness for virulent multi-drug resistant ESBL-producing Escherichia coli. Infect. Drug Resist. 2020; 13: 1839–50. https://doi.org/10.2147/IDR.S256131
  7. Sun D.H., Lv D.F., Mi Z.H., Hu L.Q., Huang Y., Gao X., et al. Investigation of antibiotic resistance determinants and virulence factors of uropathogenic Escherichia coli. J. Antibiot. (Tokyo). 2020; 73(5): 314–9. https://doi.org/10.1038/s41429-020-0284-7
  8. Казанцев А.В., Осина Н.А., Глинская Т.О., Кошелева О.Н., Максимов Ю.В., Девдариани З.Л. и др. Факторы вирулентности и филогенетическая характеристика уропатогенных штаммов Eschericihia coli, выделенных на территории г. Саратова. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; (4): 56–60. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2019-4-56-60
  9. Nüesch-Inderbinen M.T., Baschera M., Zurfluh K., Hächler H., Nüesch H, Stephan R. Clonal diversity, virulence potential and antimicrobial resistance of Escherichia coli causing community acquired urinary tract infection in Switzerland. Front. Microbiol. 2017; 8: 2334. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02334
  10. Noie Oskouie A., Hasani A., Ahangarzadeh Rezaee M., Soroush Bar Haghi M.H., Hasani A., Soltani E. A relationship between O-serotype, antibiotic susceptibility and biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli. Microb. Drug. Resist. 2019; 25(6): 951–8. https://doi.org/10.1089/mdr.2018.0330
  11. Baldiris-Avila R., Montes-Robledo A., Buelvas-Montes Y. Phylogenetic classification, biofilm-forming capacity, virulence factors, and antimicrobial resistance in uropathogenic Escherichia coli (UPEC). Curr. Microbiol. 2020; 77(11): 3361–70. https://doi.org/10.1007/s00284-020-02173-2
  12. Кузнецова М.В., Проворова С.В., Кубарев О.Г., Юдин Д.П., Каримова Н.В., Баяндина Н.В. и др. Сравнительная характеристика штаммов уропатогенной Escherichia coli, выделенных в условиях поликлиники и стационара. Урология. 2018; (6): 37–44. https://doi.org/10.18565/urology.2018.6.37-44
  13. Аминева Э.М., Бахарева Л.И. Характеристика Escherichia coli, выделенной из мочи пациентов при различных клинических ситуациях. Вестник Челябинского государственного университета. 2013; (7): 51–2.
  14. Казанцев А.В. Определение принадлежности к О-серогруппе по результатам молекулярно-генетического анализа уропатогенных штаммов Escherichia coli, выделенных от пациентов, находящихся на госпитализации в урологических отделениях на территории г. Саратов, с симптомами пиелонефрита и цистита. В кн.: Материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Аспирантские чтения – 2018». Самара; 2018.
  15. Alghoribi M.F., Gibreel T.M., Dodgson A.R., Beatson S.A., Upton M. Galleria mellonella infection model demonstrates high lethality of ST69 and ST127 uropathogenic E. coli. PLoS One. 2014; 9(7): e101547. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101547
  16. Tsai C.J., Loh J.M., Proft T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 2016; 7(3): 214–29. https://doi.org/10.1080/21505594.2015.1135289
  17. Magiorakos A.P., Srinivasan A., Carey R.B., Carmeli Y., Falagas M.E., Giske C.G., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18(3): 268–81. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2011.03570.x
  18. Кузина Е.С., Асташкин Е.И., Лев А.И., Агеева Е.Н., Карцев Н.Н., Светоч Э.А. и др. Интегроны классов 1 и 2 в госпитальных штаммах грам-отрицательных бактерий, выделенных в Москве и регионах Российской Федерации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019; 37(1): 17–24. https://doi.org/10.17116/molgen20193701117
  19. Sabaté M., Moreno E., Pérez T., Andreu A., Prats G. Pathogenicity island markers in commensal and uropathogenic Escherichia coli isolates. Clin. Microbiol. Infect. 2006; 12(9): 880–6. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2006.01461.x
  20. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Наука; 1962.
  21. Clermont O., Christenson J.K., Denamur E., Gordon D.M. The Clermont Escherichia coli phylo-typing method revisited: improvement of specificity and detection of new phylo-groups. Environ. Microbiol. Rep. 2013; 5(1): 58–65. https://doi.org/10.1111/1758-2229.12019
  22. Iguchi A., Iyoda S., Seto K., Morita-Ishihara T., Scheutz F., Ohnishi M., et al. Escherichia coli O-genotyping PCR: a comprehensive and practical platform for molecular O serogrouping. J. Clin. Microbiol. 2015; 53(8): 2427–32. https://doi.org/10.1128/JCM.00321-15
  23. Alikhan N.F., Zhou Z., Sergeant M.J., Achtman M. A genomic overview of the population structure of Salmonella. PLoS Genet. 2018; 14(4): e1007261. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007261
  24. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5): 455–77. https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021
  25. Angiuoli S.V., Gussman A., Klimke W., Cochrane G., Field D., Garrity G., et al. Toward an online repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (meta)genomic annotation. OMICS. 2008; 12(2): 137–41. https://doi.org/10.1089/omi.2008.0017
  26. Edowik Y., Caspari T., Williams H.M. The amino acid changes T55A, A273P and R277C in the beta-lactamase CTX-M-14 render E. coli resistant to the antibiotic nitrofurantoin, a first-line treatment of urinary tract infections. Microorganisms. 2020; 8(12): 1983. https://doi.org/10.3390/microorganisms8121983
  27. Kudinha T., Kong F., Johnson J.R., Andrew S.D., Anderson P., Gilbert G.L. Multiplex PCR-based reverse line blot assay for simultaneous detection of 22 virulence genes in uropathogenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2012; 78(4): 1198–202. https://doi.org/10.1128/AEM.06921-11
  28. Yu H., Qu F., Shan B., Huang B., Jia W., Chen C., et al. Detection of the mcr-1 colistin resistance gene in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae from different hospitals in China. Antimicrob. Agents Chemother. 2016; 60(8): 5033–5. https://doi.org/10.1128/AAC.00440-16
  29. Ageevets V., Lazareva I., Mrugova T., Gostev V., Lobzin Y., Sidorenko S. IncX4 plasmids harbouring mcr-1 genes: further dissemination. J. Glob. Antimicrob. Resist. 2019; 18: 166–7. https://doi.org/10.1016/j.jgar.2019.07.002

Copyright (c) 2022 Slukin P.V., Astashkin E.I., Aslanyan E.M., Ershova M.G., Poletaeva E.D., Svetoch E.A., Shepelin A.P., Fursova N.K.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies