Characterization of virulent Escherichia coli strains isolated from patients with urological infection

Full Text

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) — широко распространённые бактериальные инфекции, ежегодно поражающие в мире 150 млн человек [1]. Доминирующий возбудитель ИМП — уропатогенные Escherichia coli (uropathogenic Escherichia coli — UPEC), которые вызывают 90% внегоспитальных и 50% госпитальных урологических инфекций [2]. В России в 2018 г. E. coli были ведущим возбудителем ИМП в разных субпопуляциях пациентов — от 71 до 80% [3]. Около 50–60% взрослых женщин имеют хотя бы один эпизод ИМП в течение жизни [4]. UPEC-инфекции зачастую вызваны множественно резистентными E. coli, в частности, глобальным доминирующим клоном UPEC сиквенс-типа ST-131, несущим β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) [5]. У продуцентов БЛРС были идентифицированы гены bla_CTX-M (до 100% штаммов), bla_SHV (~63%), bla_TEM (~11%) [6]. Фенотип множественной резистентности ассоциирован с наличием также генетических детерминант, определяющих устойчивость к аминогликозидам (aac, aad, ant, aph), сульфаниламидам (dfr) и фторхинолонам (мутации в хромосомном гене gyrA), а также наличием интегронов класса 1 [7]. К генетическим детерминантам, ассоциированным с проявлением патогенных свойств UPEC, относятся гены адгезинов, токсинов, рецепторов сидерофоров, факторов противодействия иммунной системе макроорганизма, транспортёров капсул 2-й и 3-й групп, колицина V и островов патогенности [6]. В России все штаммы UPEC, выделенные в 2017–2018 гг., несли гены, ответственные за синтез сидерофоров (irp2, iuc, iroN), устойчивость и персистенцию (ompT) и факторы адгезии (fimH, iha) [8].

Штаммы UPEC характеризуются высокой степенью генетической гетерогенности, поэтому важное эпидемиологическое значение имеет молекулярно-генетическая характеристика, позволяющая определить принадлежность штаммов к филогенетическим группам (A, B1, B2, D, E и F), О-группам и сиквенс-типам. Штаммы UPEC, выделенные в разных регионах мира, преимущественно относятся к филогруппам B2 и D, серогруппам O8, O15, O25 и O75, сиквенс-типам ST131, ST69, ST73, ST10, ST127 и ST140 [9–11]. В России описаны штаммы UPEC филогенетических групп A, B1, B2, D, E и F [10][12] и серогрупп О1, О2, О6, О7, О8, О16, О25 и О75 [13, 14]. Публикации о сиквенс-типах штаммов UPEC, выделенных в России, отсутствуют.

Для определения вирулентности штаммов UPEC в последнее время широко используется хорошо охарактеризованная модель личинок большой восковой моли Galleria mellonella [5][15]. Адекватность использования данной модели обеспечивается наличием у личинок элементов иммунной системы (гемоциты гемолимфы, антимикробные пептиды и факторы опсонизации), аналогичных элементам иммунной системы человека [16]. Наибольшей вирулентностью для личинок G. mellonella обладали штаммы UPEC наиболее распространённых в мире генетических линий: ST69, ST73 и ST127, а также серогрупп О2 и О6 [15].

Целью данной работы была характеристика штаммов E. coli, выделенных от пациентов с внегоспитальными ИМП в ходе пилотного одноцентрового исследования в Ярославле, в том числе определение фенотипов и генотипов антибиотикорезистентности, идентификация генов вирулентности, оценка уровней вирулентности на модели личинок G. mellonella, определение принадлежности к филогенетическим группам, О-серогруппам и сиквенс-типам.

Материалы и методы

Биоэтические требования

Использованные в данном исследовании материалы не содержат персональных данных пациентов. В соответствии с требованиями Биоэтического комитета РФ каждый пациент подписывал информированное согласие при поступлении в лечебное учреждение на проведение лабораторных исследований.

Штаммы, условия культивирования и хранения

Штаммы E. coli (n = 20) выделены из образцов мочи от пациентов урологического отделения Инфекционной клинической больницы № 1 г. Ярославля при поступлении в лечебное учреждение, в рамках пилотного одноцентрового клинического исследования в декабре 2016 г. – январе 2017 г. Культуры E. coli выращивали на питательной среде ГРМ 1 (ФБУН ГНЦ ПМБ) в аэробных условиях при 37°C. Хранение культур осуществляли в 20% растворе глицерина при –70°C.

Видовая идентификация

Видовую идентификацию бактерий осуществляли с помощью высевов на дифференциально-диагностические питательные среды «Агар Эндо-ГРМ», «Агар Клиглера-ГРМ», «Железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной» и «Ацетатный агар» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия), с последующим подтверждением на приборе «MALDITOF Biotyper» («Bruker»).

Чувствительность к антимикробным препаратам

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) 17 антимикробных препаратов (АМП) 6 функциональных классов: β-лактамов (ампициллин, ампициллин/сульбактам, амоксициллин/ клавуланат, цефуроксим, цефотаксим, цефтазидим, азтреонам и меропенем), фторхинолонов (ципрофлоксацин, левофлоксацин и норфлоксацин), аминогликозидов (гентамицин), фосфомицинов (фосфомицин), нитрофуранов (фуразолидон, фурацилин и нитрофурантоин) и полимиксинов (колистин) («Sigma-Aldrich») определяли методом микроразведений в бульоне в соответствии с рекомендациями EUCAST Breakpoint tables v 9.0¹. В качестве стандартного использовали штамм E. coli ATCC25922, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Категорию резистентности штамма определяли в соответствии с [17].

Детекция генов антибиотикорезистентности и вирулентности

Гены, кодирующие β-лактамазы bla_TEM, bla_SHV, bla_CTX-M, bla_OXA-48 и bla_NDM, а также интегроны классов 1 и 2 выявляли методом ПЦР со специфичными праймерами [18]. Острова патогенности UPEC I₅₃₆, II₅₃₆, III₅₃₆, IV₅₃₆, I_J96, II_J96, I_CFT073 и II_CFT073 и гены, кодирующие факторы вирулентности UPEC, — фимбрии типа 1 fimH, P фимбрии papGI, papGII, papGIII, S фимбрии sfaS, F1C фимбрии focG, AFA/Dr адгезин afa/draBC, основной белок курли волокон csgA, гемолизин hlyA, цитотоксический некротический фактор cnf1, уропатогенный специфический белок usp, рецепторы сидерофоров сальмохелина iroN, иерсиниабактина fyuA и аэробактина iutA, протеазу внешней мембраны ompT, липопротеин наружной мембраны traT, транспортёры капсулы 2-го типа kpsMTII и 3-го типа kpsMTIII, основной белок колицина V cvaC — определяли методом ПЦР со специфичными праймерами [8][19].

Определение вирулентности штаммов

Идентификация филогенетических групп

Принадлежность штаммов UPEC к филогенетическим группам E. coli A, B1, B2, D, E и F определяли с помощью детекции генов, кодирующих геминовый рецептор внешней мембраны chuA, гипотетический протеин yjaA, анкирин-повторяющий белок А arpA, триптофансинтетазу α-SU trpA и эстеразу TspE4.C2, согласно [21].

Определение серологических О-групп

Серологические О-группы определяли методом ПЦР со специфичными праймерами на гены кластера липополисахаридов wzx_О1, wzx_О4, wzx_О16, wzx_О18, wzy_О2, wzy_О6, wzy_О15, wzy_О25, wzy_О75, wzy_О11, wzt_О9 и wzt_О89 [22].

Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ)

Сиквенс-типы штаммов E. coli определяли с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования 7 генов «домашнего хозяйства»: аденилаткиназы adk, фумаратгидратазы fumC, ДНК-гиразы gyrB, изоцитратдегидрогеназы icd, малатдегидрогеназы mdh, аденил-сукцинатдегидрогеназы purA и АТФ/ ГТФ-связывающего мотива гена recA с последующим определением аллельного профиля на сайте Уорикского университета (Великобритания)² [23].

Секвенирование нуклеотидных последовательностей

Последовательности ПЦР-продуктов секвенировали в ООО «СИНТОЛ» на генетическом анализаторе «ABI Prizm 3130xl» с использованием наборов для секвенирования «BigDye v3.1» и анализировали с помощью программ «Chromas»³ («Technelysium»), «Vector NTI 9» («Life Technologies») и BLAST⁴.

Полногеномное секвенирование

Полногеномное секвенирование штаммов E. coli проводили с использованием наборов «Nextera DNA Library Preparation Kit» («Illumina») и «MiSeq Reagent Kits v3» («Illumina») на платформе «Illumina MiSeq» согласно инструкции производителя. Единичные прочтения собирали в контиги с использованием программного обеспечения «SPAdes 3.9.0» [24]. Аннотировали собранные геномы с помощью сервера NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline [25]. Анализ полногеномных последовательностей проводили с использованием инструментов Центра геномной эпидемиологии⁵.

Филогенетический анализ

Филогенетический анализ штаммов E. coli проводили с использованием ресурсов NCBI «Blastn» и «Blast Tree View»⁶ на основании сравнения искусственно собранных последовательностей аллельных профилей генов МЛСТ.

Статистический анализ

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета «Microsoft Office 2010» и программы «SPSS Statistica 17.0» («IBM»). Проверку распределения на нормальность осуществляли с помощью критерия Колмогорова–Смирнова, нормальным считалось распределение при двусторонней асимптоматической значимости более 0,05. Различие сформированных групп вирулентности подтверждали методом двухвыборочного t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Различия считали значимыми при величине коэффициента достоверности p < 0,01.

Депонирование нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank

В базе данных GenBank размещены 9 полногеномных последовательностей штаммов UPEC: SERS01000000, SERT01000000, SERU00000000, SERV00000000, JACSYM000000000, SERW01000000, SERX00000000, JACSYL000000000, SERY00000000.

Результаты

Штаммы

Штаммы E. coli выделены от 20 женщин 23– 84 лет с урологическими диагнозами: хронический цистит (n = 12), инфекция мочевыводящей системы без установленной локализации (n = 3), цистит (n = 2), мочекаменная болезнь (n = 2) и гиперактивный мочевой пузырь (n = 1) (табл. 1).

 

Фенотипы и генотипы антибиотикорезистентности

Охарактеризованные штаммы UPEC отнесены к 2 категориям резистентности к АМП: резистентные (n = 11) и множественно резистентные (n = 9). Резистентные штаммы были устойчивы к препаратам 1–2-й функциональных групп: β-лактамам и нитрофуранам. Множественно резистентные штаммы были устойчивы к препаратам трех (β-лактамам, фторхинолонам и нитрофуранам), четырех (β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам и нитрофуранам) и пяти (β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам, полимиксинам и нитрофуранам) функциональных групп. При этом все штаммы были чувствительны к фосфомицину (МПК < 32 мг/л), нитрофурантоину (МПК < 64 мг/л) и меропенему (МПК < 0,5 мг/л).

В изучаемых штаммах UPEC выявлены гены β-лактамаз bla_TEM (n = 10), bla_CTX-M (n = 6), интегразы класса 1 (n = 8) и генные кассеты интегронов класса 1 dfrA17-aadA5 (n = 2), dfrA1 (n = 1) и aacA4-cmlA1 (n = 1). Генов bla_SHV, bla_KPC, bla_OXA-48 и bla_NDM не обнаружено. Шесть штаммов не имели детектируемых генов антибиотикорезистентности. Выявлено 5 вариантов сочетаний генетических детерминант резистентности: 1 ген bla_TEM определён у 4 штаммов, 1 ген bla_CTX-M — у 2, сочетание 2 генов bla_TEM+intl1 — у 3, 2 генов bla_CTX-M+intl1 — у 2, набор из 3 генов bla_TEM+bla_CTX-M+intl1 — у 3 штаммов. Генные кассеты интегронов несли детерминанты устойчивости к аминогликозидам aadA5 и aacA4, сульфаниламидам dfrA1 и dfrA17, хлорамфениколу cmlA1. У 5 интегронов генные кассеты отсутствовали (табл. 1).

Генотипы вирулентности штаммов UPEC

В изучаемых штаммах E. coli выявлены гены факторов вирулентности UPEC 7 функциональных групп: адгезинов fimH (n = 20), csgA (n = 20), focG (n = 4), papGII (n = 4), papGIII (n = 4) и sfaS (n = 3); сидерофоров fyuA (n = 15), iroN (n = 11) и iutA (n = 6); токсинов hlyA (n = 7), cnf1 (n = 5) и usp (n = 9); транспортёров капсулы kpsMTII (n = 13); факторов противодействия иммунитету ompT (n = 16) и traT (n = 11); колицина cvaC (n = 1); а также островов патогенности I₅₃₆ (n = 5), II₅₃₆ (n = 4), III₅₃₆ (n = 1), IV₅₃₆ (n = 15), II_J96 (n = 5) и II_CFT073 (n = 9). Гены адгезинов papGI и afa/draBC, транспортёра капсулы 3-го типа kpsMTIII и острова патогенности I_J96 и I_CFT073 в этих штаммах не обнаружены (табл. 2).

 

В разных штаммах UPEC было выявлено разное количество генов вирулентности — от 2 до 14. Гены адгезинов были идентифицированы во всех изучаемых штаммах, гены сидерофоров — в 18, гены факторов противодействия иммунитету — в 17, гены транспортеров капсулы — в 14, гены токсинов — в 9, ген колицина — в 1, острова патогенности — в 15 штаммах. Анализ сочетания факторов вирулентности разных функциональных групп показал, что 7 штаммов несли все 7 групп, 1 штамм — 6 групп, 4 штамма — 5 групп, 4 штамма — 4 группы, 2 штамма — 3 группы, 2 штамма — 1 группу.

Вирулентность штаммов UPEC для личинок G. mellonella

 

О-групповая принадлежность, филогенетические группы и сиквенс-типы штаммов UPEC

В ходе исследования идентифицированы 10 О-групп E. coli: О25 (n = 3), О2 (n = 2), O11 (n = 2), О18 (n = 2), О4 (n = 1), О6 (n = 1), O9 (n = 1), О15 (n = 1), О75 (n = 1) и O89 (n = 1). Для 5 штаммов О-группы не идентифицированы с помощью использованного метода типирования. Определена принадлежность штаммов к филогруппам A (n = 4), B1 (n = 3), B2 (n = 10), E (n = 1) и F (n = 2). Идентифицированы 14 ранее известных сиквенс-типов E. coli: ST14 (n = 1), ST58 (n = 1), ST69 (n = 1), ST-73 (n = 1), ST93 (n = 1), ST127 (n = 1), ST131 (n = 3), ST141 (n = 2), ST165 (n = 1), ST297 (n = 1), ST457 (n = 2), ST537 (n = 1), ST744 (n = 1) и ST1434 (n = 1), а также два новых, ранее не описанных сиквенс-типа ST10102 и ST9239 (табл. 2).

К филогруппе A отнесены штаммы О-групп О18, О89; к филогруппе B1 — О9; к филогруппе B2 — О2, О4, О6, О18, О25, О75; к филогруппе E — О15; к филогруппе F — О11 О-групп. Показано, что 3 штамма О25-группы принадлежат к сиквенс-типу ST131, 2 штамма О11-группы — к сиквенс-типу ST457, два штамма О2-группы — к сиквенс-типу ST141. Два штамма О18-группы отнесены к разным сиквенс-типам (ST14 и ST1434) и разным филогруппам (B2 и A; табл. 2).

Стоит отметить, что серогруппы О4, О6, О9, О11, О75 и О89 в данном исследовании идентифицированы только у высоковирулентных штаммов, а серогруппы О15 и О25 — только у слабовирулентных. Две серогруппы — О2 и О18 — были идентифицированы в группе как высоковирулентных, так и слабовирулентных штаммов. Филогруппы A, B1 и F определены только у высоковирулентных штаммов, в то время как филогруппа B2 — в обеих группах вирулентности. Среди 13 высоковирулентных для личинок G. mellonella штаммов E. coli определены 12 сиквенс-типов, среди 7 слабовирулентных штаммов — 5 сиквенс-типов, сиквенс-тип ST141 был идентифицирован как у 1 высоковирулентного, так и у 1 слабовирулентного штамма (табл. 2).

Филогенетическое дерево

Анализ филогенетического родства сиквенс-типов штаммов UPEC выявил два кластера: кластер I, включающий ST457; и кластер II, объединяющий все остальные сиквенс-типы. Кластер II состоит из двух подкластеров: IIa (ST69) и IIb, который включает в себя две подгруппы: IIb-1 (ST14, ST73, ST127, ST131, ST141, ST537 и ST10102) и IIb-2 (ST58, ST93, ST165, ST297, ST744, ST1434 и ST9239). Расположение изученных штаммов UPEC на филогенетическом дереве сиквенс-типов полностью совпадает с принадлежностью штаммов к филогенетическим группам: в кластер I входят штаммы группы F, в подкластер IIa — E, в подкластер IIb-1 — B2 и в подкластер IIb-2 — A и B1. В кластер I и подгруппу IIb-2 вошли только высоковирулентные для личинок G. mellonella штаммы, в подкластер IIa — один слабовирулентный штамм, в подгруппу IIb-1 — как высоковирулентные, так и слабовирулентные штаммы. Новые сиквенс-типы ST9239 (IIb-1) и ST10102 (IIb-2) филогенетически наиболее близки к сиквенс-типам ST297 и ST73 соответственно (рис. 2).

Интересно отметить, что только штаммы UPEC, относящиеся к филогруппе B2, серогруппам О2, О4, О6, О18, О25, О75 и подгруппе IIb-1 филогенетического дерева, несли гены адгезинов papGII, papGIII, sfaS и focG, гены токсинов hlyA, cnf1, usp и острова патогенности III536, IICFT073, I536, II536, IIJ96 (табл. 2).

Анализ полных геномов штаммов UPEC

Проанализированы 9 полногеномных последовательностей штаммов UPEC, которые характеризовались размерами 4,5–5,4 млн п.н. и ГЦ-составом 51–52%, несущих 4,3–5,2 тыс. генов (табл. 3). В геномах 7 штаммов выявлены генетические детерминанты, определяющие устойчивость к 10 функциональным классам АМП (β-лактамам, аминогликозидам, фениколам, фторхинолонам, полимиксинам, сульфаниламидам, тетрациклинам, макролидам, фосфомицинам и четвертичным аммониевым соединениям). Кроме того, у 8 штаммов идентифицированы гены белка MdfA, обеспечивающего чрезвычайно широкий спектр лекарственной устойчивости (табл. 4). Спектр выявленных генетических детерминант антибиотикорезистентности коррелировал с описанными выше фенотипами устойчивости штаммов к АМП: наличие генов β-лактамаз — с устойчивостью к β-лактамам, генов аминогликозид модифицирующих ферментов — с устойчивостью к аминогликозидам, гена mcr — с устойчивостью к колистину, мутаций в генах gyrA — с устойчивостью к фторхинолонам.

 

В геномах изучаемых штаммов обнаружены гены, кодирующие группы факторов вирулентности: адгезинов, сидерофоров, противодействия иммунитету макроорганизма, капсулообразования, токсинов, бактериоцинов и др. Отмечено значительное разнообразие геномов по количеству идентифицированных генов вирулентности — от 1 до 35. В геномах штаммов были выявлены до 6 генов адгезинов, до 6 генов сидерофоров, до 4 генов факторов противодействия иммунитету организма-хозяина, до 3 генов капсулообразования, до 5 генов токсинов, до 8 генов бактериоцинов и 1–5 генов других факторов вирулентности (табл. 5).

 

Обсуждение

Объектом данного исследования являлись штаммы уропатогенных E. coli — ведущего возбудителя ИМП как в России, так и во всём мире [2][3]. Показано, что около половины охарактеризованных нами штаммов UPEC относятся к категории множественно резистентных, устойчивы к АМП 3 и более функциональных классов (β-лактамам, фторхинолонам, нитрофуранам, аминогликозидам, полимиксинам), что согласуется с ранее опубликованными данными [3]. Поскольку все штаммы в нашем исследовании были чувствительны к фосфомицину, нитрофурантоину и меропенему, данные АМП могут рассматриваться в качестве препаратов выбора в клинической практике, что согласуется с данными, полученными для России [3].

Фенотипы множественной лекарственной устойчивости коррелировали с наличием генетических детерминант антибиотикорезистентности: генов β-лактамаз bla_TEM, bla_CTX-M и bla_OXA типов, генов аминогликозид-модифицирующих ферментов aac, aph и aad типов, гена колистин-модифицирующего фермента mcr, мутаций в гене ДНК-гиразы gyrA, обеспечивающих устойчивость к β-лактамам, аминогликозидам, колистину и фторхинолонам соответственно. Аналогичные гены были выявлены в штаммах UPEC в работе [6]. Обращает на себя внимание разнообразие идентифицированных аллелей эпидемически значимого гена БЛРС bla_CTX-M — 14, 15, 27 и 55, обнаруженных в трети изученных штаммов за достаточно короткий промежуток времени исследования у небольшой группы пациентов с внегоспитальными инфекциями. Это согласуется с большим разнообразием аллелей гена bla_CTX-M, описанным в исследовании европейских авторов для госпитальных и внегоспитальных штаммов UPEC [26], а также с увеличением доли БЛРС-продуцирующих штаммов UPEC в России [3]. Необходимо подчеркнуть, что в 2 штаммах идентифицирован ген устойчивости к антибиотику резерва колистину mcr-1.

В геномах изучаемых штаммов UPEC выявлено большое количество и разнообразие генетических детерминант вирулентности. Все штаммы имели гены fimH и csgA, что аналогично данным, описанным в работах других авторов [8][27]. Ген afa/draBC в изученных нами штаммах E. coli не обнаружен, в то время как в работе [27] встречаемость данного гена составляла 15%. В нашем исследовании представленность генов fyuA, iroN и iutA составляла 83, 50 и 45%, что принципиально не отличается от данных других авторов: 78, 36–68 и 67% соответственно [8][27]. Интересно отметить, что гены рецепторов сидерофоров в нашем исследовании чаще встречались в сочетаниях, чем индивидуально: fyuA + iroN (n = 6), fyuA + iutA (n = 3) и fyuA + iroN + iutA (n = 3). Гены факторов противодействия иммунитету макроорганизма ompT и traT были выявлены у большинства штаммов нашего исследования (83 и 61% соответственно), что аналогично другим данным — 75 и 71% соответственно [27]. Наличие генов focG и sfaS и оперона pap в нашем исследовании отмечено у 22, 17 и 44% изучаемых штаммов соответственно, что аналогично данным [8], но отличается от данных в других исследованиях — 50, 26 и 80% соответственно [27]. Ген hlyA в нашем исследовании идентифицирован у 39% штаммов, что примерно соответствует уровню встречаемости (42%) этого гена в исследовании российских авторов [8], но ниже, чем в работе [27] — 76%. Ген cnf1 в нашем исследовании встречался у 28% штаммов, а в работе [27] — у 83% штаммов. Таким образом, в нашем исследовании у подавляющего большинства штаммов присутствовали гены адгезинов, сидерофоров и факторов противодействия иммунной системе.

Фенотипическое проявление вирулентности исследуемых штаммов UPEC изучали на модели личинок G. mellonella, которая широко используется для характеристики бактериальных уропатогенов [15][16]. Показано, что множественно резистентным фенотипом обладали 6 высоковирулентных штаммов из 13, что указывает на вовлечённость в процесс объединения потенциалов вирулентности и антибиотикорезистентности UPEC.

Профили генов вирулентности, выявленные в нашей работе в полных геномах штаммов UPEC, различались у высоко- и слабовирулентных штаммов. Гены lpfA, papA_F12, focC, sfaD, ireA, air, neuC, kpsMII_K1, astA, cma, cvaC, cea, celb, mchB, mchC, mchF, mcmA, eilA, tcpC и epeA встречались только в геномах высоковирулентных штаммов, а гены papA_F43, afaD, ibeA, kpsMII_K5, sat, senB — только в геномах слабовирулентных штаммов.

Важно отметить, что исследованные в нашей работе внегоспитальные штаммы UPEC, как и во всем мире, характеризуются высокой степенью генетической гетерогенности: идентифицированы 3 филогенетические группы, 10 О-групп и 16 сиквенс-типов. По данным литературы, выявленные нами серогруппы О2, О6, О15, О25 и О75 относятся к числу часто встречающихся у UPEC [10][13][14]. Это согласуется также с тем, что в базе данных EnteroBase⁷ на 20.09.2020 серогруппы O2, O4, O6, O18, O25 и О75 были представлены более чем 10 штаммами UPEC каждая, а серогруппы O9, O11, О15 и O89 — менее чем 10 штаммами каждая. Стоит отметить, что штаммы серогруппы О6 охарактеризованы как высоковирулентные для личинок G.mellonella и в нашем исследовании, и в работе [15]. В то же время штаммы О15- и О25-групп были отнесены нами к слабовирулентным для личинок G. mellonella, а штаммы О2- и О18-групп — и к высоковирулентным, и к слабовирулентным штаммам, что не совпадает с результатами исследования [15].

Показано, что штаммы 11 сиквенс-типов, в том числе нового ST-9239, принадлежат к категории высоковирулентных, а 4 сиквенс-типов, в том числе нового ST-10102, — к категории слабовирулентных. Сиквенс-тип ST-131, описанный в нашей работе, характерен для штаммов UPEC во всём мире (65 упоминаний среди UPEC в базе данных EnteroBase на 20.09.2020). Другие характерные для UPEC сиквенс-типы ST69, ST73, ST127, ST14, ST58, ST93, ST141, ST457, ST537 и ST297, описанные в нашем исследовании, также представлены в базе данных EnteroBase (от 1 до 106 упоминаний среди UPEC на 20.09.2020). В нашей работе впервые описаны штаммы E. coli сиквенс-типов ST165, ST744 и ST1434, выделенные от человека с ИМП; ранее эти сиквенс-типы были ассоциированы с другими патогруппами E. coli (согласно базе данных EnteroBase на 20.09.2020). В нашем исследовании штаммы E. coli ST131 обладали слабой вирулентностью для личинок G. mellonella, что совпадает с результатами [15]. Интересно, что все штаммы этого сиквенс-типа в нашем исследовании принадлежали к серогруппе О25, а в упомянутой работе — не только к серогруппе О25, но и к другим серогруппам [15].

Высоко- и слабовирулентные штаммы UPEC подгруппы IIb-1 филогенетического дерева, относящиеся к характерным для UPEC филогруппе B2 и серогруппам О2, О4, О6, О18, О25 и О75, несли ген usp, кодирующий токсин — уропатогенный специфический белок Usp, что согласуется с опубликованными ранее данными о наличии ассоциации гена usp с сиквенс-типами ST131, ST69, ST73 и ST141 [9].

Полученные нами данные о принадлежности штаммов UPEC ST73 серогруппы О6 и ST127 серогруппы О4 к группе высоковирулентных для личинок G. mellonella аналогичны описанным в литературе [15]. В то же время штамм UPEC серогруппы О15 сиквенс-типа ST69 в нашем исследовании отнесён к слабовирулентным, а в работе [15] — к высоковирулентным UPEC. Особое внимание обращают на себя два высоковирулентных для личинок G. mellonella штамма E. coli (O11, ST457), которые характеризовались устойчивостью к резервному антибиотику колистину и несли ген mcr-1. Ранее mcr-1-позитивные штаммы UPEC такого же сиквенс-типа были описаны в Китае [28]. В России этот ген был детектирован ранее в штаммах E. coli сиквенс-типов ST156 и ST359 [29].

Заключение

Описано генетическое разнообразие изученных внегоспитальных штаммов UPEC, относящихся к 3 филогенетическим группам, 10 О-группам и 16 сиквенс-типам и несущих разные наборы генетических детерминант факторов патогенности и антибиотикорезистентности. Все штаммы отнесены к категории резистентных, у половины из них определена множественная лекарственная устойчивость, обусловленная наличием генов устойчивости к β-лактамам, фторхинолонам, аминогликозидам и др., что согласуется с общемировой тенденцией распространения антибиотикорезистентности среди внегоспитальных патогенов. Идентифицированы две группы штаммов UPEC по степени вирулентности на модели личинок G. mellonella — высоковирулентные и слабовирулентные, геномы которых существенно отличались по наличию наборов генов адгезинов, сидерофоров, токсинов, факторов противодействия иммунитету макроорганизма, капсулообразования и островов патогенности. Описаны штаммы UPEC, характеризующиеся одновременно высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью во внегоспитальной среде. Дальнейшее накопление данных позволит оценить эпидемиологическую ситуацию по ИМП, дать прогноз её развития в будущем, а также определить оптимальные направления терапии.

 

About the authors

P. V. Slukin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Author for correspondence.
Email: xopgi@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4976-0145

Pavel V. Slukin - researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

E. I. Astashkin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3559-9071

Eugeny I. Astashkin - Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

E. M. Aslanyan

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9538-9968

Elena M. Aslanyan - researcher, Disinfectology department

Obolensk

Russian Federation

M. G. Ershova

Infectious Clinical Hospital No. 1

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4691-648X

Marina G. Ershova - Head, Microbiology laboratory

Yaroslavl

Russian Federation

E. D. Poletaeva

Infectious Clinical Hospital No. 1

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7074-6989

Elena D. Poletaeva - bacteriologist, Microbiology laboratory

Yaroslavl

Russian Federation

E. A. Svetoch

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3185-1954

Edward A. Svetoch - D. Sci. (Vet.), Professor, chief researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

A. P. Shepelin

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8253-7527

Anatoly P. Shepelin - D. Sci. (Biol.), Deputy director for scientific and industrial Work

Obolensk

Russian Federation

N. K. Fursova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6053-2621

Nadezhda K. Fursova - Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratoty of antimicrobial agents, Molecular microbiology department

Obolensk

Russian Federation

References

Supplementary files