Interaction of causative agents of sapronoses with the land plant Lithospermum erythrorhizon

Cover Page


Cite item

Abstract

Background. A significant role in the ecology of the sapronotic pathogens Yersinia pseudotuberculosis and Listeria monocytogenes and in the epidemiology of the infections they cause is played by land plants used for food. These microorganisms are often found on plant substrates, they multiply on various vegetable and root crops. In this regard, it is relevant to study the viability and biological activity of Y. pseudotuberculosis and L. monocytogenes in contact with various land plants, including those that are not eaten, but are used in medicine.
Aim. Study of the interaction of sapronotic pathogens Y. pseudotuberculosis and L. monocytogenes with callus cultures of the land plant Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zucc.
Materials and methods. The studies included strains of Y. pseudotuberculosis 512 serotype 1b, pYV+, 82MD+ and L. monocytogenes NCTC (4b) 10527 from the Collection of Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, and cell culture from the roots of red-root gromwell Lithospermum erythrorhizon line VC-39 (from the Collection of FSC of the East Asia Terrestrial Biodiversity FEB RAS).
Before the study, Y. pseudotuberculosis and L . monocytogenes were cultured 18–20 hours on nutrient agar pH 7.1–7.2. A working dilution of microorganisms was prepared (106 micobial cells per 1 ml) and applied at a dose of 100 μl to the surface of plant calli. Material samples were taken in dynamics after 3 and 14 days and prepared for scanning electron microscopy.
Results. Y. pseudotuberculosis and L. monocytogenes formed biofilms on the surface of plant cells within 3 days after the start of the experiment. It was noted that Y. pseudotuberculosis destroyed the components of the plant cell membrane.
Conclusion. New data obtained during the study expand the understanding of environments and forms of habitation, as well as the potential for pathogenicity of sapronotic pathogens in the environment.

Full Text

Введение

К настоящему времени имеются данные о способности возбудителей сапронозов [1], в частности Yersinia pseudotuberculosis [2], Listeria monocytogenes [3], а также зоонозов [4] использовать разные среды обитания. Значительную роль в экологии этих микроорганизмов и в эпидемиологии вызываемых ими инфекций играют растения [5][6]. Анализ многочисленных вспышек, вызванных Y. pseudotuberculosis [7] и Y. enterocolitica [8], показал, что чаще всего факторами передачи этих бактерий человеку являются овощи и корнеплоды, а также блюда, приготовленные из них, в которых они размножаются и накапливаются в значительных количествах, поддерживая высокую степень вирулентности.

Имеются сведения о том, что сок многих овощей, например, моркови, свёклы, капусты, содержит аттрактанты для Y. pseudotuberculosis [9]. На этом основании авторами сделано предположение о роли хемотаксиса названных бактерий при обсеменении ими овощей. В экспериментах с помощью сканирующей электронной микроскопии выявлено, что Yersinia и некоторые другие энтеробактерии формируют микроколонии на поверхности кусочков корма, яичной скорлупы, листьев капусты [10]. Также выявлена способность этих бактерий формировать биоплёнки на поверхности каллусов женьшеня — Panax ginseng C.A. Mey штамм R-1 [11]. Исследования в этом направлении своевременны и актуальны.

В представленной статье основное внимание сосредоточено на изучении взаимодействия бактерий — возбудителей сапронозов — с каллусами наземного растения воробейника краснокорневого (Lithospermum erythrorhizon) — ВК. Это травянистое многолетнее растение распространено на Дальнем Востоке России, в Приморье, Приамурье, а также в Китае, Монголии, Японии и Корее. В лечебных целях применяются его корни, листья и плоды.

Основными биоактивными метаболитами в корнях ВК являются шиконин и его производные [12][13]. Согласно многочисленным исследованиям, шиконин эффективен при воспалениях, лечении ран, а также есть сведения о его выраженном противораковом эффекте в отношении различных типов опухолей вследствие ингибирования пролиферации клеток и их миграций, индукции апоптоза, автофагии, некроза и значимом антиоксидантном действии [14][15].

Известно о противогрибковом [16] и противовирусном [17] действии экстрактов из ВК. Культура клеток из корней ВК-39 продуцирует эфиры шиконина, на основе которых производят шикониновое масло. Оно эффективно ингибирует грамположительную микрофлору (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. lutea, Bacillus subtilis и др.), обладает противогрибковым действием, является эффективным нестероидным противовоспалительным препаратом, т.к. нормализует продукцию ключевых медиаторов воспаления — интерлейкинов-1 и -2, γ-интерферона, снижает отёк и сосудистую проницаемость в очаге острого воспаления. Антимикробное и противовоспалительное действие этого средства сочетается с его способностью регенерировать эпителий после различных поражений.

Имеющиеся данные свидетельствуют об актуальности исследований в этом направлении для расширения и углубления познания механизмов, используемых патогенными для человека и животных бактериями — возбудителями сапронозов — при обитании их в разных средах, в частности, клетках наземных растений, а также создания на этой основе новых диагностических и лечебных препаратов [18–21].

Цель исследования: изучение взаимодействия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes с каллусными культурами ВК.

Материалы и методы

В работе использованы штаммы бактерий Y. pseudotuberculosis 512 1b серотипа, pYV+, 82MD+ и L. monocytogenes NCTC (4b) 10527, изолированные от больных (Коллекция НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова) и культура клеток из корней ВК, линия ВК-39 (Коллекция ФНЦ биоразнообразия ДВО РАН).

Перед исследованиями Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes культивировали на питательном агаре при рН 7,1–7,2 в течение 18–20 ч. Готовили рабочее разведение микроорганизмов (106 микробных клеток на 1 мл) и наносили их на поверхность каллусов растений в дозе 100 мкл. В динамике через 3 и 14 сут брали пробы материала и готовили их для сканирующей электронной микроскопии. Каллусы ВК культивировали на агаризованной питательной среде W0, содержащей дополнительно 2 мг/л кинетина, 0,2 мг/л индол-3-уксусной кислоты и 0,25 мг/л CuSO4, в пробирках в темноте при 25 ± 1ºС [14]. Через 30 сут каллусы переносили на свежую аналогичную питательную среду, затем через неделю добавляли исследуемые бактерии. Начальная масса каллусов составила 0,20–0,22 г. Условия культивирования не меняли до конца эксперимента.

В динамике через 3 и 14 сут после добавления бактерий брали пробы материала для сканирующей электронной микроскопии. Образцы фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,2 в течение 24 ч. Промывали пробы в том же буфере в течение 24 ч. Затем дополнительно фиксировали их в 1% ОsО₄, приготовленном на дистиллированной воде (20 мин), и промывали в дистиллированной воде в течение 5 ч. Пробы обезвоживали с использованием установки «BAL-TEC CPD 030» («Bal-Tec»), закрепляли на столиках для сканирующей электронной микроскопии, используя двустороннюю ленту, и напыляли хромом толщиной 10–15 нм («Q150 TES», «Quorum Technologies»). Приготовленные препараты анализировали с использованием сканирующего электронного микроскопа «Evo40» («Carl Zeiss»). Разгонное напряжение составило 29 кВ.

Результаты

С помощью сканирующей электронной микроскопии исследован характер взаимодействия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes с каллусными культурами ВК.

В контроле клетки культуры на протяжении всего периода наблюдения (14 сут) имели целостную поверхность без признаков разрушения (рисунок, а).

Через 3 сут после заражения клеток ВК Y. pseudotuberculosis на поверхности растительных клеток бактерии формировали биоплёнку, состоящую из палочек длиной до 2,5 мкм, объединённых длинными контактными отростками (рисунок, г, д). Часть микроорганизмов имела неровную поверхность, что отражало начальный этап их фрагментации в ходе формирования бесструктурного матрикса — компонента биоплёнки. Через 14 сут после начала эксперимента зрелая биоплёнка покрывала бóльшую часть поверхности клеток ВК. Под действием бактерий нарушалась целостность оболочек растительных клеток, в результате чего обнажалась сеть полисахаридных волокон, входящих в состав клеточных стенок. Бактериальная биоплёнка была представлена бесструктурным матриксом и погружёнными в него бактериальными клетками (рисунок, д), длина некоторых экземпляров достигала 8 мкм.

На 3-и сутки после внесения L. monocytogenes в культуру клеток ВК на поверхности растений имелись участки, покрытые формирующейся бактериальной биоплёнкой (рисунок, б). Группы коротких (длиной около 1 мкм) палочек были соединены длинными контактными отростками, формирующими сетчатые структуры на поверхности клеток ВК. На 14-е сутки после заражения поверхность растительных клеток покрывала зрелая биоплёнка, состоящая из тяжей бесструктурного матрикса и бактериальных клеток (рисунок, в). При этом поверхность растительных клеток выглядела целостной, без признаков разрушения.

Сканирующая электронная микроскопия возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes при взаимодействии с каллусными культурами ВК.

а — стерильная культура клеток ВК, контрольный образец (14-е сутки после начала эксперимента); б — формирование биоплёнки L. monocytogenes на поверхности клеток культуры (3-и сутки), бактериальные клетки (черная стрелка) объединены сетью контактных отростков (белые стрелки); в — L. monocytogenes (черная стрелка) погружены в бесструктурный матрикс (белая стрелка), покрывающий поверхность растительных клеток (14-е сутки); г — биоплёнка, образованная Y. pseudotuberculosis на поверхности растительных клеток (3-и сутки), бактерии (чёрные стрелки) объединены контактными отростками (белая стрелка); д, е — биоплёнка Y. pseudotuberculosis (черные стрелки) на поверхности растительных клеток (14-е сутки), бактериальные клетки погружены в аморфный матрикс (белые стрелки).

Scanning electron microscopy of the causative agents of sapronosis Y. pseudotuberculosis and L. monocytogenes in interaction with callus cultures of the Lithospermum erythrorhizon.

a — sterile culture of L. erythrorhizon cells, control sample (14 days) after the start of the experiment; b — formation of L. monocytogenes biofilm on the surface of cultured cells (3 days), bacterial cells (black arrow) are united by a network of contact projections (white arrows); c — L. monocytogenes (black arrow) immersed in a structureless matrix (white arrow) covering the surface of plant cells (14 days); d — biofilm formed by Y. pseudotuberculosis on the surface of L. erythrorhizon cultured cells, the third day after the start of the experiment; bacteria (black arrows) are united by contact projections (white arrow); e, f — biofilm of Y. pseudotuberculosis (black arrows) on the surface of L. erythrorhizon cells (14 days), bacterial cells are immersed in an amorphous matrix (white arrows).

Обсуждение

В настоящее время активно развиваются исследования, касающиеся мест и форм обитания возбудителей инфекционных заболеваний, их жизнеспособности, биологической активности и вирулентности. Известно, что Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes относятся к возбудителям сапронозов. Названные микроорганизмы обнаружены в разных наземных объектах, в том числе в растениях, употребляемых в пищу. Имеющиеся данные о важной роли растений в развитии патологии человека и животных не вызывают сомнений и требуют дальнейшего изучения.

Основными результатами проведённого исследования являются следующие:

1. Получены новые данные о способности возбудителей сапронозов Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes длительный период времени обитать на клетках ВК, не употребляемого в пищу, но используемого для получения лечебных и профилактических препаратов.

2. Установлено, что Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes образовывали биоплёнки на поверхности каллусов ВК.

3. Обнаружено, что Y. pseudotuberculosis, в отличие от L. monocytogenes, разрушали компоненты оболочки растительных клеток, что, очевидно, может способствовать проникновению бактерий внутрь этих клеток.

Заключение

Новые сведения о жизнеспособности возбудителей сапронозов в наземных растениях, применяемых, в частности, для лечения, расширяют представление о биологической активности этих микроорганизмов и требуют дальнейших исследований.

×

About the authors

N. F. Timchenko

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: ntimch@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6051-292X

Nelly F. Timchenko - D. Sci. (Med.), Professor, leading researcher

Vladivostok

Russian Federation

М. G. Еliseikina

A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5361-6261

Marina G. Eliseikina - Cand. Sci. (Biol.), senior researcher

Vladivostok

Russian Federation

G. K. Tchernoded

Federal Scientific Center of the East Asia Terrestrial Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7570-2881

Galina K. Тсhernoded - researcher

Vladivostok

Russian Federation

O. V. Grishchenko

Federal Scientific Center of the East Asia Terrestrial Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0123-7195

Olga V. Grishchenko - researcher

Vladivostok

Russian Federation

А. V. Rakov

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1917-9189

Alexey V. Rakov - Cand. Sci. (Med.), senior researcher

Vladivostok

Russian Federation

M. Yu. Shchelkanov

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology; A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8610-7623

Mikhail Yu. Shchelkanov - D. Sci. (Biol.), Associate Professor, director

Vladivostok

Russian Federation

References

  1. Терских В.И. Сапронозы (о болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания). Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1958; 35(8): 118–20.
  2. Сомов Г.П. Еще раз о сапронозах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985; 62(5): 98–104.
  3. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток; 2004.
  4. Erickson M.C., Jue-Yin L., Payton A.S., Cook P.W., Bakker H.C.D., Bautista J., et al. Survival of Salmonella enterica and Escherichia coli 0157:H7 Sprayed onto the Foliage of Field-grown cabbage plant. J. Food Prot. 2019; 82(3): 479–85. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-18-326
  5. Пушкарева В.И., Ермолаева С.А. Экспериментальное обоснование роли растений в эпидемиологии сапронозных инфекций. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(5): 113–21. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-113-121
  6. Пушкарева В.И. Бактериальные патогены: миграция от их естественных резервуаров человеку. Успехи современной биологии. 2019; 139(5): 457–65. https://doi.org/10.1134/S0042132419040070
  7. Nuorti J.P., Niskanen T., Hallanvuo S., Mikkola J., Kela E., Hatakka M., et al. A widespread outbreak of Yersinia pseudotuberculosis 03 infection from iceberg lettuce. J. Infect. Dis. 2004; 189(5): 766–74. https://doi.org/10.1086/381766
  8. Espenhain L., Riess M., Müller L., Colombe S., Ethelberg S., Litrup E., et al. Cross-border outbreak of Yersinia enterocolitica 03 associated with imported fresh spinach, Sweden and Denmark, March 2019. Euro Surveill. 2019; 24(24): 1900368. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2019.24.24.1900368
  9. Венедиктов В.С., Тимченко Н.Ф., Антоненко Ф.Ф., Степаненко В.И. Хемотаксис Yersinia pseudotuberculosis как механизм поиска тканевых мишеней организма хозяина. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1988; 65(5): 77–81.
  10. Павлова И.Б., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование патогенных бактерий на объектах внешней среды. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998; 55(5): 13–7.
  11. Тимченко Н.Ф., Елисейкина М.Г., Чернодед Г.К., Грищенко О.В., Булгаков В.П. Взаимодействия Yersinia pseudotuberculosis с каллусами Panax ginseng C.A. Mey. Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2019; (3): 4–7. https://doi.org/10.5281/zenodo.3559604
  12. Yaron S., Römling V. Biofilm formation by enteric pathogens and its role in plant colonization and persistence. Microb. Biotechnol. 2014; 7(6): 496–516. https://doi.org/10.1111/1751-7915.12186
  13. Найда Н.М., Опалихина В.А. Морфобиологические особенности воробейника краснокорневого в условиях Ленинградской области. Вестник студенческого научного общества. 2018; 9(1): 63–4.
  14. Журавлев Ю.Н., Булгаков В.П., Писецкая Н.Ф., Козыренко М.М., Старун Т.В., Артюков А.А. и др. Штамм культивируемых клеток растений Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc — продуцент шиконина. Патент РФ №1707073; 1992.
  15. Bulgakov V.P., Kozyrenko M.M., Fedoreyev S.A., Mischenko N.P., Denisenko V.A., Zvereva L.V., et al. Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithohttps://doi.org/10.1016/s0367-326x(00)00343-9
  16. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология – здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2004; (3): 93–8.
  17. Guo C., He J., Song X., Wang M., Jiang P., Li Y., et al. Pharmacological properties and derivatives of shikonin — A review in recent years. Pharmacol. Res. 2019; 149: 104463. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2019.104463
  18. Таран Л.М., Слободенюк Е.В., Башаров А.Я. Фармакологические свойства шиконина и его производных. Дальневосточный медицинский журнал. 2015; (1): 98–103.
  19. Sasaki K., Yoshiaki F., Abe H. The anti-candida activity of shikonin. Yakugaki Zasshi. J. Pharm. Soc. Japan. 2000; 120(6): 587–9. https://doi.org/10.1248/yakushi1947.120.6_587
  20. Yan Y., Tan F., Miao H., Wang H., Cao Y. Effect of shikonin against Candida albicans biofilms. Front. Microbiol. 2019; 10: 1085. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01085
  21. Zhang Y., Han H., Sun L., Qiu H., Lin H., Yu L., et al. Antiviral activity of shikonin ester derivative PPM-034 against enterovirus 71 in vitro. Braz. J. Med. Biol. Res. 2017; 50(10): e6586. https://doi.org/10.1590/414-431X20176586

Copyright (c) 2022 Timchenko N.F., Еliseikina М.G., Tchernoded G.K., Grishchenko O.V., Rakov А.V., Shchelkanov M.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies