The relatedness of Klebsiella pneumoniae strains based on phylogenetic analysis of uge and fim genes

Full Text

Введение

Klebsiella pneumoniae часто колонизирует кишечник детей и взрослых без клинических и лабораторных признаков микробного воспаления, в то же время указанный вид бактерий может быть оппортунистическим этиологическим агентом пневмонии, абсцесса, бактериемии, инфекции мочевыводящих путей [1], неонатального сепсиса [2][3]. Одним из возбудителей внутрибольничных, в том числе гнойно-септических, инфекций являются полирезистентные к антибиотикам и устойчивые к дезинфектантам штаммы K. pneumoniaе [4][5][6].

Среди представителей семейства энтеробактерий, с которыми ассоциировано развитие осложнений инфекционного характера у новорожденных в отделении реанимации, на долю K. pneumoniae приходится 48% [7]. В этиологической структуре пневмоний с летальным исходом у взрослого населения штаммы K. pneumoniae выявлены в 27,27% случаев [8]. В настоящее время выделяют две эволюционно сложившиеся линии, отличающиеся по степени вирулентности. Одну представляют так называемые классические штаммы, вторую — вирулентные, с выраженной продукцией слизи [9].

J.M. Vargas и соавт. описывают 16 генов вирулентности, имеющих разный вклад в патогенный потенциал [10]. Другие авторы также приводят результаты аналогичных исследований различных генов K. pneumoniae [9][11], выделенных при обследовании пациентов с различной выраженностью клинических проявлений в стационарах хирургического, пульмонологического, травматологического профилей, отделениях реанимации и интенсивной терапии. В то же время недостаточно данных, характеризующих бактериальные изоляты, обнаруженные в пробах кала новорождённых, в том числе недоношенных детей.

Значимость гена uge в реализации факторов патогенности, согласно исследованиям M.A. Regué (2004), заключается в кодировании фермента уридин-дифосфат-галактуронат-4-эпимеразы, необходимого для синтеза липополисахарида — компонента клеточной стенки грамотрицательных бактерий. При этом показано, что инактивация гена uge приводит к формированию авирулентных для лабораторных животных штаммов [12]. Распространенность генов в штаммах K. pneumoniae варьирует, по данным разных авторов, от 80% [12][13] до 90% [14]. У детей с гастроинтестинальными расстройствами данный показатель составляет 83,3% [15].

Ген fimH определяет синтез фимбрий, нитевидных структур белковой природы, расположенных на поверхности бактерий и обеспечивающих адгезию штаммов к клеткам хозяина [16]. Прикрепление к поверхности слизистых оболочек способствует бактериальной колонизации, формированию резистентности к факторам иммунной защиты и реализации патогенного потенциала за счет механического соединения с субстратом. Данный ген играет важную роль в развитии инфекций мочевыводящих путей [10].

В настоящее время недостаточно данных о том, какова частота встречаемости штаммов K. pneumoniae с генами факторов вирулентности uge и fim среди женщин, планирующих беременность, беременных, рожениц и родильниц, а также новорожденных. Это диктует необходимость проведения дальнейшего исследования распространенности K. pneumoniae (uge⁺, fim⁺) и определения степени гетерогенности выделенной популяции бактерий среди детей и взрослых. Оценить степень генетического разнообразия штаммов позволит филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей указанных генов.

Цель исследования — провести филогенетический анализ генов uge и fim штаммов K. pneumoniae для оценки гетерогенности изучаемой популяции и возможной кластеризации по локусу колонизации, временнóй и территориальной принадлежности.

Материалы и методы

Всего исследовано 65 штаммов K. pneumoniae, выделенных от 39 новорожденных и 24 женщин из проб фекалий (38), крови (2), мочи (3), последа (1), отделяемого цервикального канала (19), зева (1), шва (1). Две гемокультуры получены от одного пациента с интервалом в 2 нед, и 2 изолята выделены из отделяемого цервикального канала и шва одной пациентки. Биологический материал поступил в бактериологическую лабораторию от недоношенных детей, рожденных от матерей с различным сроком гестации (25–36 нед ± 3 дня), 3 женщин, планирующих беременность, 13 беременных, 5 рожениц и 3 родильниц.

Сбор клинического материала для исследования осуществляли в стерильные лабораторные контейнеры для взятия проб объемом 60 мл с завинчивающейся крышкой и ложкой. Пробы биологического материала транспортировали и хранили в соответствии с СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I–IV групп патогенности». Для культивирования бактерий посев материала выполняли на среду Эндо (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия), кровяно-сывороточный агар (основа — «Conda»; эритроциты барана — «ЭКОлаб»; сыворотка крови крупного рогатого скота — «БиолоТ»). Идентификацию штаммов K. pneumoniae и определение их антибиотикочувствительности проводили с использованием автоматического анализатора «VITEK 2 compact» («Bio Mérieux»).

ДНК бактериальных клеток выделяли из взвеси суточной культуры с использованием набора ДНК-экстран-2 («Синтол») согласно инструкции производителя. Наличие генов uge определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием реагентов, праймеров для гена uge 5’-TCTTCACGCCTTCCTTCACT-3’, 5’-GATCATCCGGTCTCCCTGTA-3’ и для fimH (кодирует белок фимбрий первого типа) 5'-TGCTGCTGGGCTGGTCGATG-3', 5'-GGGAGGGTGACGGTGACATC-3' производства ООО «Синтол». Визуализацию ПЦР продуктов осуществляли в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I в режиме реального времени на детектирующем амплификаторе «iCycler iQ5» («Bio Rad»). В состав смеси для амплификации входили 50 мкл реакционной смеси: 2,5× ПЦР буфер Б (KCl, ТрисНCl pH 8,8, 6,25 мМ MgCl₂ ), Syn-Taq ДНК-полимераза, глицерол, Tвин 20; дезоксинуклеозидтрифосфаты, 5 мкл dd H₂O, 25 мМ MgCl₂, по 1 мкл каждого праймера и 3,5 мкл образца ДНК. Режим амплификации: первоначальная денатурация — 5 мин при 95°C, последующие 35 циклов — 15 с при 94°C; отжига праймеров — 20 с при 55°C для uge и 60°C для fim; элонгации — 30 с при 72°C. Завершающим этапом каждого цикла была детекция продуктов амплификации.

Для оценки статистической значимости различий частоты встречаемости генов uge и fim в штаммах K. pneumoniae использовали программу статистической обработки данных SPSS, критерии χ² Пирсона с поправкой Йейтса, V Крамера.

Секвенирование генов uge и fim проводили по методу Сэнгера [17]. Типирование полученных последовательностей осуществляли с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)¹.

Выравнивание, филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), версия 6 [18].

Филограммы были построены по алгоритму «ближайшего соседа» с использованием нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank.

Расчет эволюционных дистанций между последовательностями производили согласно двухпараметрической модели М. Кимуры (Kimura 2-parameter). Статистическую значимость топологии филограмм оценивали методом повторных выборок на основании анализа 1000 псевдореплик. Достоверными считали построения дендрограммы при индексе в узлах не менее 70.

Результаты

При исследовании 65 штаммов K. pneumoniae, выделенных от пациентов учреждения родовспоможения, частота встречаемости гена uge составила 53,8% (35 из 65), fim — 23,1% (15 из 65), что свидетельствует о большей распространенности в изученных штаммах гена uge, чем fim (р < 0,001). Частота встречаемости гена uge ниже, чем в результатах, опубликованных в литературе [12][13][14], что может быть связано с характеристикой исследуемой выборки пациентов, которые были госпитализированы в многопрофильные или специализированные стационары с нозологической формой клебсиеллезной этиологии. Сравнительный анализ K. pneumoniaе, выделенных от новорожденных детей и женщин, не продемонстрировал статистически значимых различий в частоте встречаемости вышеназванных генов. Так, в группе штаммов, выделенных у детей, uge детектирован в 62,5% случаев (25 из 40), у женщин — в 40% (10 из 25; р = 0,130). Ген fim обнаружен в 17,5% штаммов (7 из 40), выделенных от детей, и в 32% штаммов (8 из 25), выделенных от женщин (р = 0,295). Оба гена были выявлены в 18,4% случаев (12 из 65), из них в 28% штаммов, выделенных от женщин, и в 12,5%, выделенных от детей (р = 0,216).

Для определения степени генетического родства проанализировано 18 нуклеотидных последовательностей гена uge, полученных в результате секвенирования по Сэнгеру. Проведенный филогенетический анализ показал, что все штаммы распределились по 7 кластерам (рис. 1).

В первый кластер вошли два штамма, выделенные из проб фекалий от пациентов двух педиатрических отделений в апреле и марте 2019 г., и близкородственные им штаммы, выделенные на Тайване в 2014 г. (AB924589), в США в 2006 г. (CP000647) и Таиланде в 2012 г. (CP03521).

Во второй кластер распределились два штамма, выделенные также из проб фекалий новорожденных детей из отделения патологии новорождённых недоношенных детей (ОПННД) в сентябре 2019 г. и феврале 2020 г., один штамм, полученный при исследовании пробы из цервикального канала от пациентки акушерско-физиологического отделения (ноябрь 2019 г.) после родоразрешения способом кесарева сечения. Следует отметить, что все штаммы, по данным бактериологического анализа, продуцировали бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС). Наиболее генетически близкий штамм был выделен в Оболенске в 2012 г. (KJ633804).

Третий кластер включал в себя последовательности гена uge K. pneumoniae, выделенные из проб кала двух недоношенных детей и проб из цервикального канала (декабрь 2019 г.). Один ребенок со сроком гестации 31 нед в возрасте 5 сут находился в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) (декабрь 2019 г.). Другой пациент в возрасте 11 сут сроком гестации 36 нед был госпитализирован в ОПННД (август 2019 г.). Генетически близкие штаммы обнаружены в Индии (2017 г. — CP030857), Китае (2014 г. — CP026160) и США (2014 г. — CP021740).

Четвертый кластер представлен БЛРС-продуцирующими штаммами, выделенными из проб кала недоношенных детей из ОРИТН (апрель 2019 г.) и ОПННД (сентябрь 2019 г.). В него же вошли изоляты, выделенные из эндотрахеального аспирата в 2013 г. (KX954847) и пробы мочи в 2014 г. (KP760057) в Оболенске.

В пятый кластер сгруппировались 3 штамма, выделенные от 2 детей из тройни. Два из них получены из гемокультуры одного ребёнка в возрасте 41 и 63 сут. При этом отсутствие микробного роста в крови в 1-е сутки жизни может свидетельствовать об исключении внутриутробного сепсиса. Другой штамм изолирован из кала второго ребёнка. Третий ребенок из тройни также выделял с калом K. pneumoniae, однако детектировать ген uge в нем не удалось. Установлена идентичность между штаммами, выделенными из крови одного ребёнка и из кала другого ребёнка. При этом в штамме, выделенном из пробы кала ребёнка с положительной гемокультурой, ген uge не обнаружен. На основании полученных результатов исследования можно с высокой долей вероятности предполагать экзогенную инфекцию кровотока, а не трансцитоз бактерий через стенку кишечника недоношенного новорождённого (эндогенную инфекцию). Следует также отметить, что наиболее генетически близкий штамм, найденный BLAST, также был получен из гемокультуры в 2013 г. в Канаде (CP012992). Полученные результаты свидетельствуют о возможном присутствии в разных локусах макроорганизма бактерий одного вида с отличающимся набором генов. Молекулярно-генетический мониторинг, направленный на выявление циркуляции штаммов с определенными генетическими детерминантами вирулентности, способствует обнаружению источника инфицирования.

Два штамма K. pneumoniae, один из которых выделен из пробы зева женщины 33 лет, планирующей беременность, а другой — из кала новорождённого в возрасте 8 сут, вместе с изолятами, зарегистрированными в Австралии в 2007 г. (CP042520), Китае в 2013 г. (CP030172) и Индии в 2017 г. (CP030877), образовали шестой кластер.

Седьмой кластер представлен штаммом, выделенным из пробы цервикального канала беременной женщины в возрасте 26 лет со сроком гестации 30 нед. Наиболее генетически близкие штаммы были выделены в Оболенске в 2014 г. (KX954839), в США в 2015 г. (CP034778) и в Канаде в 2019 г. (CP034778).

Следует отметить, что все выделенные в настоящем исследовании штаммы генетически отличались от гипервирулентных, описанных в исследовании А.И. Лев и группирующихся отдельным кластером [16].

Из 14 штаммов, имеющих ген fim, в 4 случаях нуклеотидные последовательности были успешно секвенированы. Филогенетический анализ показал, что все штаммы распределились по 4 кластерам (рис. 2).

В первый кластер вошел штамм 5, выделенный в феврале 2019 г. из зева женщины, планирующей беременность. Он группировался вместе с гипервирулентным штаммом CP034778, обладающим плазмидой вирулентности, выявленным в Канаде в 2018 г. в пробе фекалий пациента в возрасте старше 90 лет [19].

Во втором кластере сгруппировались штаммы, выделенные из цервикального канала в ноябре 2019 г., пробы крови пациентов в Великобритании в 2018 г. (CP034200) и Индии в 2017 г. (CP036327).

В третий кластер распределились штаммы, выделенные из отделяемого шва пациентки послеродового отделения в январе 2020 г., крови в Китае в 2017 г. (CP050275, CP050280) и пробы мочи в Чехии в 2018 г. (CP050371).

Штаммы, выделенные из цервикального канала в феврале 2020 г. в послеродовом отделении, в Китае в 2013 г. (CP026017), из мокроты в Непале в 2018 г. (AP021880), в Чехии в 2018 г. из пробы фекалий (CP050360), образовали четвертый кластер.

Из 65 штаммов 17 продуцировали БЛРС. Устойчивых к карбапенемам и аминогликозидам бактерий не выявлено. Для описания связи между геновариантами uge⁺/fim^–, uge⁺/fim⁺, uge^–/fim^–, uge^–/fim⁺ и антибиотикорезистентностью строили таблицы сопряженности и рассчитывали критерии χ² и V Крамера (поскольку оценивали более одной градации переменных). Статистический анализ показал, что χ² = 3,641; V Крамера = 0,237; р = 0,303, что свидетельствует об отсутствии связи между выявленными геновариантами штаммов и антибиотикорезистентностью за счёт БЛРС. Таким образом, с высокой долей вероятности можно утверждать, что гены uge и fim не обеспечивают молекулярные механизмы устойчивости к бета-лактамным антибиотикам.

Проведенный генетический анализ показал, что все штаммы в изучаемой популяции K. pneumoniae можно разделить на 4 группы:

1) штаммы, не имеющие генов uge и fim (n = 27);

2) изоляты, в которых детектирован ген uge (n = 23);

3) штаммы с геном fim (n = 3);

4) бактерии, содержащие оба гена (n = 12).

Таким образом, с целью дифференциации бактерий внутри каждой группы необходимы дополнительные методы исследования.

Обсуждение

Для оценки внутривидового разнообразия бактерий может быть использован метод мультилокусного сиквенс-типирования, при котором анализируют нуклеотидные последовательности 7 генов «домашнего хозяйства», присутствующих у всех штаммов K. pneumoniae, и выявляют клональные комплексы эпидемических генетических линий [20]. Однако указанный метод не позволяет анализировать гены факторов вирулентности. Использование для оценки степени родства детекции и анализа генетических детерминант вирулентности позволит не только определить субтиповую структуру штаммов, но и оценить их патогенный потенциал. Учитывая, что ген uge среди изучаемой популяции K. pneumoniae встречается чаще, чем fim, он может быть выбран для индикации и проведения молекулярно-генетического мониторинга, направленного на предупреждение распространения в стационаре бактерий, обладающих патогенным потенциалом, и профилактику инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Результаты филогенетического анализа последовательностей генов uge и fim демонстрируют гетерогенность изучаемой популяции штаммов K. pneumoniae, что подтверждено широкой географией и временем выявления наиболее генетически близких бактериальных изолятов. Отсутствие четкой кластеризации по временнóму и территориальному признаку, возрасту пациента и биологическому материалу исключает наличие общих молекулярно-генетических признаков, объединяющих группу штаммов из изучаемой популяции, отвечающих за тропность бактерий к определенным тканям человеческого организма. В то же время монофилитическое происхождение гипервирулентных штаммов, напротив, может указывать на мутации в гене uge, определяющие более выраженные вирулентные свойства. Следовательно, детекция вышеназванного гена предоставляет ценную дополнительную информацию для клинических суждений и является перспективным направлением для дальнейших исследований.

Отсутствие одновременного выявления на протяжении длительного времени штаммов одного субварианта свидетельствует, с одной стороны, о проведении эффективных противоэпидемических мероприятий, препятствующих длительной циркуляции штаммов среди пациентов стационара, с другой — о возможном существовании разных источников инфицирования.

Также необходимо отметить, что в международной базе генетической информации содержится недостаточное количество задепонированных нуклеотидных последовательностей изучаемых генов для оценки генетического родства штаммов K. pneumoniae, выделенных на территории России. Для выявления региональных особенностей циркуляции штаммов необходимо создание локальных баз данных. Использование таких подходов к определению идентичности и сравнению нуклеотидных последовательностей генов факторов вирулентности позволит разработать алгоритм проведения молекулярно-генетического мониторинга за циркуляцией штаммов в лечебном учреждении и оценки распространенности бактерий, обладающих разным патогенным потенциалом. 

About the authors

A. V. Ustyuzhanin

Ural Scientific Research Institute of Maternity and Child Care

Author for correspondence.
Email: ust103@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8521-7652

Aleksander V. Ustyuzhanin — PhD. (Med.), senior researcher, Scientific department of immunology, microbiology, pathomorphology and cytodiagnostics

620028, Yekaterinburg

Russian Federation

G. N. Chistyakova

Ural Scientific Research Institute of Maternity and Child Care

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0852-6766

Guzel’ N. Chistyakova — D. Sci. (Med.), Prof., Head, Scientific department of immunology, microbiology, pathomorphology and cytodiagnostics

620028, Yekaterinburg

Russian Federation

I. I. Remizova

Ural Scientific Research Institute of Maternity and Child Care

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4238-4642

Irina I. Remizova — PhD. (Biol.), senior researcher, Scientific department of immunology, microbiology, pathomorphology and cytodiagnostics

620028, Yekaterinburg

Russian Federation

References

Supplementary files