Модели in vitro для изучения вируса Зика

Полный текст

Введение

Вирус Зика был впервые выделен в 1947 г. в лесу Зика в Уганде из макаки резуса. Позже вирусспецифические антитела были обнаружены в крови инфицированных людей, это стало первым доказательством того, что вирус может передаваться человеку. Более поздние исследования выявили инфекцию в других регионах Африки, а также в азиатских странах. До 2007 г. вирусную инфекцию считали инфекцией ограниченного географического распространения [1-5].

Первая крупная вспышка лихорадки Зика произошла в 2007 г. на острове Яп в южной части Тихого океана, во время нее 73% жителей острова были инфицированы [6, 7]. Позже вспышки фиксировались во Французской Полинезии и на территориях Тихоокеанского региона, в 2014 г. — в Чили и Бразилии. В настоящее время наблюдается быстрая интродукция лихорадки Зика из эндемичных регионов. С 2014 г. в мире зарегистрировано 9252 завозных случая в 52 странах (Бельгия, Чехия, Франция, Германия, Греция, Венгрия, Италия, Нидерланды, Испания, Великобритания, США, Канада, Аргентина и др.)¹. За последние 7 лет на территории России было верифицировано 23 таких случая, связанных с поездками в Доминиканскую Республику, Мексику, Индию, Таиланд, Колумбию и Китай².

Как и при других альфаи флавивирусных инфекциях, при лихорадке Зика иногда наблюдается сопутствующая симптоматика, включая синдром Гийена-Барре (острая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия) [8-10] и микроцефалию у младенцев, родившихся у инфицированных матерей [11-14].

Для изучения вопросов патогенеза, патофизиологии, а также для рассмотрения фенотипических и пролиферативных свойств возбудителя вирусной инфекции Зика в последние годы стали широко использовать модели in vitro с применением клеточных систем.

Нашей целью было систематизировать и обобщить данные литературы последних лет по вопросам изучения вируса Зика на модели in vitro.

Основная часть

K.Himmelsbach с соавт. [15] изучили способность вируса Зика репродуцироваться в культуре клеток различного происхождения. Все клеточные линии (A549 — клетки эпителия легкого человека, CHO — клетки яичника китайского хомячка, COS7 — клетки почки африканской зеленой мартышки, HepG2/C3A — клетки печени человека, Huh7.5 — клетки печени человека, HaCaT — клетки кожи человека, N29.1 — клетки гипоталамуса мыши, SH-SY5Y — клетки нейробластомы костного мозга человека, Vero — клетки почки африканской зеленой мартышки и 293T — клетки почки человека) инфицировали полинезийским штаммом Зика азиатского генотипа. Через 48 ч в клетках определяли нагрузку специфической РНК и титры инфекционного вируса, используя ПЦР и заражение клеточной культуры.

Авторы установили, что наибольшая концентрация внутриклеточных инфекционных вирусных частиц была в культуре клеток Vero; достаточно высокая — в Huh7.5, COS7, 293T и A549; значительно меньшая — в N29.1 и SH-SY5Y; самая низкая — в HaCaT. В клетках CHO вирусные частицы не были обнаружены. Выраженный цитопатогенный эффект (ЦПЭ) наблюдался в культурах клеток A549 и Vero.

Концентрация фрагментов генома вируса Зика, выявляемых внутри клеток и в супернатанте при инфицировании этих же видов клеточных культур, оказалась приблизительно одинаковой [15].

J.F. Chan с соавт. [16] использовали 33 вида перевиваемых культур клеток органов и тканей различных млекопитающих и птиц: JEG-3, HEK, HeLa, HOSE6-3, LNCaP, 833KE, SF268, RD, ARPE19, Hep-2, Calu-3, HFL, Caco-2, Huh7, THP-1, U937, Raji, H9, Vero, LLC-MK2, PK-15, MDCK, CRFK, TP2, L929, BV2, 3T3, R28, RK3E, RK-13, BHK21, C6/36. Для изучения чувствительности клеточных линий к вирусу Зика были использованы изоляты двух генотипов:

• выделенный от больного в Пуэрто-Рико (штамм PRVABC59) в Южной Америке — представитель азиатского генотипа;
• изолированный из крови обезьяны макака резус в Уганде в 1947 г. (штамм MR766) — представитель восточно-африканского генотипа.

Анализ результатов тестирования 18 клеточных линий человеческого происхождения показал, что штаммы вируса Зика, выделенные в Южной Америке и в Уганде, в течение всего срока эксперимента (5 сут) вызывали ЦПЭ в 14 видах клеточных культур: клетки трофобластов линии JEG-3, клетки органов мочеполовой системы HEK, HeLa, HOSE6-3, LNCaP и 833KE, клетки нейромышечной системы SF268 и RD, клетки эпителия сетчатки глаза взрослого человека ARPE19, клетки органов дыхания Hep2, Calu-3 и HFL, клетки аденокарциномы ободочной кишки Caco-2 и линия клеток гепатокарциномы человека Huh7.

ЦПЭ на 3-й день эксперимента наблюдали в 8 из 14 клеточных культур: JEG-3, SF268, RD, ARPE19, Hep-2, HFL, Caco-2 и Huh7. Это коррелирует с динамикой экспрессии в клетках неструктурного вирусного белка NS1.

Наиболее выраженный ЦПЭ наблюдался в культурах клеток JEG-3, SF268, RD, Caco-2 и Huh7 (>50% пораженных клеток в монослое).

В течение всего срока эксперимента дегенеративные изменения регистрировали в 8 из 15 клеточных культур нечеловеческого происхождения: Vero, LLC-MK2, PK-15, CRFK, RK-13, BHK21, DF-1 и C6/36. Репродукцию вирусных частиц не генерировали клетки, полученные от мышей, крыс и летучих мышей [16].

S. Ramos da Silva и соавт. [17] инфицировали клеточные линии двумя африканскими (IbH30656 и MR766) и двумя азиатскими (PRVABC59 и H/FP/2013) штаммами вируса Зика. Чувствительность клеток-мишеней к вирусу Зика определяли по нарастанию титров вируса в культуре клеток, синтезу специфических белков в культуре, а также по репликации вирусного генома. В работе были использованы 14 клеточных линий различного происхождения, но только в клетках Vero авторы регистрировали значительное нарастание титра вируса. Все линии культур клеток человеческого происхождения, использованные в работе, были восприимчивы к штаммам вируса Зика, однако клетки 293T и HeLa показали избирательную восприимчивость только к африканским штаммам. Клетки 293T на высоком уровне экспрессировали неструктурный белок NS1 африканского штамма, но не белок NS1 азиатского штамма. Очевидных различий в репликации вирусного генома этих штаммов не обнаружено [17].

K.L. Barr и соавт. [18] исследовали супернатанты, собранные через 72 ч после инфицирования клеток вирусом Зика. Результаты показали, что культуры клеток WHC-17 и TB 1 Lu не восприимчивы к вирусу Зика, что было подтверждено с помощью ПЦР. Выраженную репликацию вируса Зика наблюдали в культуре клеток OK в отличие от клеток E.Derm, PK, FoLu, CRFK и LLC-MK2.

I. Vicenti с соавт. [19] изучили репликацию вируса в культуре клеток комаров Ae. albopictus (C6/36). В работе использовали два азиатских штамма вируса: первый (штамм SPH) был изолирован от больного человека, второй (штамм Mex 1-44) — из комаров рода Ae. aegypti, а также два штамма африканского происхождения (MR766 и IbH). Установлено, что африканские изоляты вируса быстрее реплицируются в клетках C6/36, чем в комарах рода Ae. aegypti. По данным K.A. Willard и соавт. [20], эти штаммы оказывали более выраженный ЦПЭ в клетках Vero.

I. Vicenti с соавт. [19] изучили также бляшкообразование в клеточных линиях человека (U87, A549, Huh7), комаров (С6/36) и обезьяны (Vero Е6). В культуре клеток Huh7 наблюдали формирование бляшек на 3-й день после инфицирования, а также максимальную продукцию вируса Зика. В культуре клеток C6/36 бляшки формировались медленнее и в меньшем количестве по сравнению с другими клеточными линиями.

Известно, что вирус Зика может передаваться половым путем, но в настоящее время мало данных о типах клеток, поддерживающих репликацию вируса и его персистенцию в репродуктивной системе человека. A. Kumar с соавт. [21] в этих целях использовали два основных типа клеток (Сертоли и Лейдига), поддерживающих сперматогенез [22]. До начала экспериментов штаммы восточно-африканского и азиатского генотипов пассировали в клетках C6/36 и титровали с использованием клеток Vero. Эксперименты с клетками Лейдига проводили после одного пассажа в культуре, тогда как клетки Сертоли были взяты в эксперимент между 3-5-м пассажами. Эти клеточные линии были инфицированы африканским (MR766) и американским (PRVABC59) штаммами вируса Зика. На основании полученных данных авторы сделали выводы, что клетки Сертоли более чувствительны к вирусу, т.к. на их поверхности находятся рецепторы семейства TAM Axl, которые опосредованно усиливают репликацию вируса Зика и поддерживают его персистентность в организме.

I. Vicenti и соавт. [19] установлено, что в первичной клеточной линии Сертоли вирус активно реплицируется в течение 6 нед, что представляет интерес для понимания персистенции вируса в мужской репродуктивной системе. Эти результаты были подтверждены ранее проведенными исследованиями на лабораторных животных (мышах) [23-25] и in vitro на клетках человека [26].

На основе полученных данных были сделаны выводы о том, что высокая восприимчивость клеток Сертоли к вирусу Зика может способствовать проникновению вируса в просвет семенных канальцев, длительно поддерживать репликацию вируса и обеспечивать возможность передачи вирусной инфекции половым путем. В первичных клеточных линиях Лейдига скорость репликации вируса Зика была значительно ниже, несмотря на то что в экспериментах на лабораторных мышах установлен факт размножения вируса в клетках мочеполовой системы животных [26, 27].

В одном из исследований [28] авторы изучали репликацию вируса Зика в клетках предстательной железы человека. Одна линия — 19I (стромальные клетки простаты) — получена из предстательной железы здорового донора, представляет собой нетрансформированные стволовые клетки, поддерживающие фенотип при пассировании в культуре в течение нескольких месяцев [29]. Вторая линия — это эпителиальные клетки аденокарциномы простаты LNCaP и органеллы простаты 19I, выделенные по методу [29].

В этих экспериментах были использованы три изолята вируса Зика:

• FLR, выделенный в культуре C6/36 из сыворотки крови человека в Колумбии в 2015 г. [30];
• FLA, полученный из первичных дендритных клеток крови больного во Флориде, который также был инфицирован в Колумбии в 2015 г.;
• HN16, выделенный от больного в Хьюстоне, штат Техас, и культивированный в клетках Vero [31].

Полученные данные свидетельствовали о том, что клетки предстательной железы и эпителиальные клетки человека репродуцируют вирус с различной активностью репродукции у разных штаммов. Установлено, что стромальная среда является оптимальной для репликации вируса, что вносит значительный вклад в понимание патогенеза передачи вируса половым путем [32-34].

Вирус Зика из-за способности заражать стволовые клетки нейронов-предшественников является причиной появления патологических процессов в головном мозге на ранних сроках развития эмбриона. C. Kaid с соавт. [35] изучили влияние вируса на стволовые клетки различного происхождения:

• клеточные линии из эмбриональных опухолевых клеток центральной нервной системы (ЦНС):
• DAOY — медуллобластома;
• USP13-MED — медуллобластома;
• USP7-ATRT — внутренняя атипичная тератоидная/рабдоидная опухоль;
• клетки опухоли, не связанные с ЦНС:
• MCF-7 — рак молочной железы;
• HCT-8 — колоректальный рак;
• DU-145 — рак предстательной железы, клетки получены из метастаза в головном мозге.

Для контроля были взяты плюрипотентные стволовые клетки и нейроны, полученные от человека.

Результаты исследования показали, что вирус Зика вызывает значительное снижение роста и гибель клеток культур DAOY, USP13-MED, выраженный ЦПЭ наблюдали в USP7-ATRT. В инфицированных культурах USP7-ATRT и USP13-MED авторы регистрировали дегенерацию более чем 50% клеток монослоя, а в культуре DAOY — только 40%. Репродукция вируса в клетках MCF-7 и HCT-8 отсутствовала.

На основе полученных данных авторы сделали вывод, что вирус Зика, нарушая плазматическую мембрану эмбриональных опухолевых клеток ЦНС, индуцирует гибель клеток. Все эмбриональные опухолевые клетки, выделенные из ЦНС, генерировали репродукцию вирусных частиц в высоких титрах начиная с 24 ч после заражения. Было отмечено, что через 72 ч эти клетки продуцировали уже неполноценные вирионы [35].

Заключение

Вирус Зика может инфицировать стволовые клетки, что приводит к аномальной дифференцировке и порокам развития головного мозга на ранних сроках эмбриогенеза [36].

Об авторах

Екатерина Владимировна Пименова

к.м.н., с.н.с. лаб. иммунодиагностики ФКУЗ «Волгоградский
научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 400131, Волгоград, Россия; доц. каф.
молекулярной биологии и генетики ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет», 400131, Волгоград, Россия

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekaterina-304@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8632-203X

Наталья Петровна Храпова

д.м.н., проф., г.н.c. лаб. иммунодиагностики ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 400131, Волгоград, Россия; проф. каф. молекулярной биологии и генетики ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет», 400131, Волгоград, Россия

Email: vari2@sprint-v.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-9782-6866

Татьяна Валерьевна Замарина

к.м.н., с.н.с. лаб. иммунодиагностики ФКУЗ «Волгоградский
научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 400131, Волгоград, Россия; доц. каф.
молекулярной биологии и генетики ФГБОУ ВО Волгоградский
государственный медицинский университет», 400131,
Волгоград, Россия

Email: vari2@sprint-v.com.ru
ORCID iD: 0000-0002-2965-0555

Список литературы

Дополнительные файлы