Система секреции 4-го типа у Clostridioides difficile: структурные особенности и её роль как фактора патогенности

Полный текст

Введение

Clostridioides difficile — грамположительный подвижный спорообразующий микроорганизм, вызывающий поражения кишечника человека — антибиотикоассоциированную диарею и колиты разной степени тяжести [1–3]. Патогенность C. difficile определяется способностью возбудителя вырабатывать хотя бы один из двух глюкозилирующих токсинов: TcdA и TcdB [4, 5], а также бинарный токсин (CDT), хотя роль последнего остаётся менее понятной [6–8]. Тяжесть течения заболевания, возможность развития его осложнений и переход в хронические формы, а также возникновение новых эндемичных штаммов зачастую связывают с дополнительными факторами, которые отвечают за адгезивные функции [9], спорообразование [10], формирование биоплёнок [11], модификацию клеточной стенки [12, 13] и транскрипцию [14–16]. Кроме этого, большую роль в патогенезе инфекции C. difficile играют белки систем чувства кворума (от англ. quorum-sensing) [17, 18], регулирующих, помимо прочего, уровень продукции токсинов [19], а большая группа генов резистентности к антибиотикам обусловливает беспрепятственное развитие инфекции при лечении заболевания антибактериальными препаратами [20–23].

Относительно недавно в геномах штаммов C. difficile были обнаружены нуклеотидные последовательности, предположительно кодирующие компоненты системы секреции 4-го типа (СС4Т) [24]. Данный секреторный аппарат играет ключевую роль в патогенезе инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями Agrobacterium tumefaciens [25], Legionella pneumophila [26], Helicobacter pylori и др. [27]. В то же время связь СС4Т с патогенезом заболеваний, вызываемых грамположительными возбудителями, только начинает привлекать внимание микробиологов [28–31]. Уже сейчас становится ясно, что изучение структуры и функции секреторного аппарата этой группы бактерий представляется важным не только для расшифровки инфекционных процессов, но и для создания средств терапии и профилактики заболеваний [28, 30]. В нашем обзоре мы постарались раскрыть особенности организации СС4Т C. difficile класса С, чтобы наметить направления и перспективы её дальнейших исследований.

Система секреции 4-го типа у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

СС4Т представляет собой многокомпонентную трансмембранную белковую структуру, которая участвует в доставке токсических эффекторов в клетку-мишень [25], горизонтальном транспорте мобильных генетических элементов (МГЭ) между микроорганизмами [23] и в обмене ДНК с внешней средой [27]. По строению секреторные аппараты 4-го типа разделяют на три класса: A, B и C (СС4Т-А, СС4Т-В, СС4Т-С соответственно) [32, 33]. Последний встречается исключительно у грамположительных бактерий и входит в состав элементов конъюгативного переноса ДНК: плазмид, интегративных и конъюгативных элементов и островков патогенности [33–35].

Прототипом секреторного аппарата 4-го типа является СС4Т-А грамотрицательного фитопатогена A. tumefaciens (рис. 1, а). Она получила название VirB/VirD4 и состоит из 12 субъединиц [25]. В её состав входят цитоплазматические АТФазы (VirD4, VirB4, VirB11), которые снабжают энергией транслокационный процесс и первыми связываются с эффекторными молекулами [36], компоненты комплексов внутренней (VirB3, VirB6, VirB8) и наружной (VirB7, VirB9, VirB10) мембран, формирующие трансмембранный канал [25], а также структурные белки пилей (VirB1, VirB2, VirB5) [37]. Такой секреторный аппарат успешно транспортирует в растительную клетку фрагмент Ti-плазмиды, запускающий опухолевые процессы в эукариотической клетке [25], и ряд вспомогательных белков [38, 39]. Обе группы молекул способствуют развитию опухолевидных образований у растений («галлов»), в которых в дальнейшем происходит пролиферация бактериальных клеток [25]. СС4Т-А связывают с вирулентностью не только фитопатогенов [40], но и патогенов человека. Так, у Helicobacter pylori эффекторные молекулы СС4Т-А запускают провоспалительный ответ в эпителиальных клетках желудка [41] и обусловливают неконтролируемое деление клеток хозяина [42].

В отличие от СС4Т-А A. tumefaciens, секреторные системы В-типа доставляют в эукариотические клетки-мишени преимущественно белковые эффекторы [43] и определяют патогенез таких заболеваний, как болезнь легионеров [26] и лихорадка Ку [44, 45]. Среди СС4Т-B грамотрицательных бактерий наиболее изученным является секреторный аппарат Dot/Icm у L. pneumophila — внутриклеточного патогена и возбудителя легионеллёза. Он участвует в транспорте свыше 300 эффекторных молекул, лишь небольшая часть которых охарактеризована. Последние участвуют в формировании специализированных «репликативных» фагосом в эукариотических клетках [46] и нарушают жизнедеятельность клетки-хозяина [47, 48], способствуя внутриклеточной пролиферации легионелл [49].

Конъюгативные СС4Т-С грамположительных микроорганизмов схожи по строению с вышеописанными системами и включают гомологи соответствующих субъединиц [33]. Так, плазмида pIP501 Enterococcus sp. (рис. 1, б) содержит;

• релаксазу TraA (необходима для образования одноцепочечного фрагмента ДНК);
• гидролазу TraG (гомолог VirB1), которая должна разрушать связи в пептидогликане при формировании секреторного аппарата;
• белки, формирующие канал через клеточную стенку — TraL (гомолог VirB6), TraM и TraH (последние два — предположительно гомологи VirB8);
• АТФазы TraE и TraJ (гомологи VirB4 и VirD4, соответственно) [50–52].

 

Рис. 1. Организация СС4Т.

а — схематическое изображение секреторного аппарата 4А типа Agrobacterium tumefaciens [25]; б — компоненты СС4Т-С трех конъюгативных транспозонов C. difficile 630 в сравнении с типичными представителями СС4Т-А (A. tumefaciens pTi1D1609) и СС4Т-С (Enterococcus faecalis pIP501).

Визуализацию осуществляли в программе «Genious», данные о каждом компоненте подтверждали с помощью баз данных NCBI, UniProt, а также с помощью отдельных попарных выравниваний. КВМ — комплекс внутренней мембраны; ККНМ — коровый комплекс наружной мембраны. *VirB1 в СС4Т-А, будучи литическим ферментом, разрушает связи в пептидогликане в процессе формирования трансмембранного канала, а также входит в состав пиля.

Fig. 1. T4SS organization.

a — schematic representation of the Agrobacterium tumefaciens type 4A secretion machinery [25]; b — T4SS-C components of three conjugative transposons of C. difficile strain 630 compared to representatives of T4SS-A (A. tumefaciens pTi1D1609) and T4SS-C (Enterococcus faecalis pIP501).

The visualization was performed using the Genious software; the data on each component were verified using NCBI and UniProt databases, as well as using separate pairwise alignments. IMC — the inner membrane complex; OMCC — the outer membrane core complex. *In T4SS-A, VirB1, being a lytic enzyme, breaks bonds within the peptidoglycan during the formation of a transmembrane channel; it also forms a part of the pilus assembly.

 

Из-за отсутствия наружной мембраны у грамположительных микроорганизмов секреторный аппарат СС4Т-С может быть представлен так называемыми «минимизированными» структурами, образованными только 4–7 субъединицами [34, 35] вместо 12 у A. tumefaciens [25] или 27 у L. pneumophila [53].

Если у грамотрицательных бактерий СС4Т прочно ассоциируется с патогенезом инфекций, то в грамположительных бактериях этот тип секреторного аппарата преимущественно рассматривают в качестве участника конъюгативных процессов и, как следствие, фактора распространения генов антибиотикоустойчивости (плазмиды pCW3 Clostridium perfringes, pIP501 Enterococcus sp. и др.) [51, 52, 54]. Однако можно предположить, что, по аналогии с секреторными системами A. tumefaciens и H. pylori, грамположительные бактерии способны использовать аппарат СС4Т как для доставки одноцепочечных молекул ДНК, так и для транслокации молекул, способствующих развитию инфекционных процессов, что уже подтверждается отдельными исследованиями. Обнаружено, что адгезины, секретируемые СС4Т-С плазмиды pCF10 Enterococcus faecalis, способствуют образованию биоплёнок и повышают вирулентность энтерококка [30]. Другим примером участия СС4Т-С в патогенезе инфекционных заболеваний являются данные о связи геномного островка патогенности Sp1 Streptococcus suis со вспышками синдрома токсического шока 1998 и 2005 гг. [55, 56]. В состав Sp1, который определяет адаптивные и вирулентные свойства стрептококка, входят гомологи только 4 генов СС4Т: VirB1, VirB4, VirD4 и VirB6 [56, 57]. Несмотря на простое строение, такая минимизированная секреторная система сохраняет свои функциональные свойства и не только вовлечена в конъюгативный перенос островка патогенности, но и непосредственно определяет вирулентность S. suis [28, 29]. Таким образом, секреция белковых факторов вирулентности и транслокация МГЭ СС4Т-С свидетельствуют в пользу участия данного аппарата в патогенезе инфекций, вызываемых грамположительными микроорганизмами, как это было показано ранее для грамотрицательных бактерий.

СС4Т-С у C. difficile

Несмотря на потенциальную значимость в патогенезе инфекции, СС4Т-С у C. difficile остаётся малоизученной [24, 58]. До сих пор не определён точный состав секреторного аппарата. Помимо ранее выделенных генов VirD4, VirB6 и VirB4 [24] с использованием биоинформационного анализа мы обнаружили ген, предположительно кодирующий гомолог VirB1 во всех трех конъюгативных транспозонах: CTn4, CTn2 и CTn5 (последние обозначены нами в данной статье CTn2/CTn5) [31]. В состав конъюгативной части оперонов CTn у C. difficile также входят гены метилтрансферазы, релаксазы, хеликазы и топоизомеразы. Вероятнее всего, они кодируют компоненты релаксосомы (рис. 1, б), необходимой для образования транспортируемых одноцепочечных молекул ДНК и её передачи секреторному аппарату, как это происходит при участии белка VirD2 A. tumefaciens [25] и релаксазы TraA плазмиды pIP501 [51]. Остаётся открытым вопрос о принадлежности к СС4Т-С продукта гена конъюгативного транспозона CD630_18580, который, согласно М. Bhatty и соавт. [34], является ортологом адгезина pCF10 E. faecalis [30] и может, по аналогии с белком энтерококков, оказаться фактором вирулентности C. difficile.

Важнейшими компонентами СС4Т бактерий являются белки VirB4 и VirD4, принимающие участие в транслокации в качестве источника энергии для транспорта биомолекул. Обе АТФазы относятся к консервативным белкам секреторного аппарата [58, 59] и, как следствие, являются оптимальными объектами для таксономических исследований [60]. Так, филогенетический анализ последовательностей VirB4- и VirD4-подобных АТФаз позволяет достоверно определить, к какому семейству (А, B или C) относится СС4Т, включающая эти ферменты (рис. 2). Из-за различий в строении VirB4 и VirD4 C. difficile транспозонов CTn4 и CTn2/CTn5 оказываются в отдельных кладах, которые вместе с АТФазами островка патогенности S. suis формируют три таксономически важных группы внутри СС4Т-С, что может указывать на их различную функциональную значимость.

 

Рис. 2. Филогенетические деревья VirD4- (а) и VirB4-подобных (б) белков грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Зелёной стрелкой обозначены АТФазы CTn4, оранжевой — CTn2/5. Выравнивание проводили методом MAFFT и K-align, деревья строили по методу максимальной схожести по модели Blosum62 [31].

Fig. 2. Phylogenetic trees of VirD4- (a) and VirB4-like (b) proteins of gram-positive and gram-negative bacteria.

The green arrow indicates CTn4 ATPases; the orange arrow indicates CTn2/5. The alignment was performed using MAFFT and K-align tools; trees were constructed using the maximum likelihood method and the Blosum62 matrix [31].

 

Единственная биохимическая работа, изучающая клостридиальный аппарат СС4Т и посвящённая данным белкам, была проведена недавно в нашей лаборатории [31]. Согласно нашим данным, оба фермента обладают Mg²⁺-зависимой АТФазной активностью, а максимальная скорость каталитической реакции достигается в присутствии ионов калия [31]. VirD4, но не VirB4 способна взаимодействовать с молекулами нуклеиновых кислот. Причём важную роль в этом взаимодействии играет трипофан-241, поскольку точечная замена W241A приводит к варианту белка, не способному адсорбировать ДНК [31]. VirB4 и VirD4 образуют олигомерные ферментативно-активные комплексы, а замена ключевых аминокислот в так называемых «Walker A» и «Walker B» мотивах, входящих в состав ферментативных доменов, не только снижает АТФазную активность, но и дестабилизирует олигомерный комплекс в целом [31]. Сходство обеих АТФаз с другими АТФазами СС4Т по аминокислотному строению (рис. 2), а также биохимическим и структурным особенностям [31] позволяет предположить, что данный секреторный аппарат способен транслоцировать белки, подобно системе секреции S. suis и E. faecalis. Однако эта гипотеза требует дополнительных подтверждений.

Наличие VirB4- и VirD4-подобных АТФаз у штамма 630 не является уникальным или единичным случаем. Для оценки частоты встречаемости АТФаз СС4Т-С среди представителей C. difficile оптимально подходят секвенированные аннотированные геномы, собранные до уровня хромосом. В базу данных NCBI для вида C. difficile на конец 2022 г. внесён 17 961 секвенированный геном¹, 92 из которых аннотированы и собраны до уровня хромосомы, а при исключении дублирующих вариантов установленным параметрам соответствуют 89 геномов (рис. 3). Половина таких геномов (45 штаммов) содержит АТФазы СС4Т-С в составе конъюгативных транспозонов, у остальных данные аминокислотные последовательности с помощью Blast-анализа не найдены [Сорокина и др., данные не опубликованы]. У 38 штаммов гены секреторного аппарата не повреждены (рис. 3), что может указывать на их функциональную активность. Только у C. difficile 630 присутствуют три варианта генов VirB4 и VirD4 АТФаз, расположенных в транспозонах CTn2, CTn4 и CTn5. В 10 геномах и VirB4, и VirD4 найдены в 2 локусах (транспозонах), чаще всего каждый из генов представлен одной копией. Особую интересную для дальнейших исследований группу представляют АТФазы СС4Т, демонстрирующие низкую гомологию с АТФазами известных транспозонов CTn4 или CTn2/CTn5 (менее 80% идентичности). СС4Т-С, включающие подобные «новые» варианты АТФаз, практически не отличаются по организации от таковых у CTn4 или CTn2/CTn5, за исключением отдельных случаев появления между генами топоизомеразы и хеликазы гена с мотивами, свойственными белкам клеточной стенки (потенциальных факторов вирулентности) [61, 62]. Определить, насколько однородной является последняя группа при таком объёме выборки, не представляется возможным. В целом проведённый нами таксономический анализ позволяет не только выявить штаммы с АТФазами, принадлежащими к уже известным подгруппам (CTn4 или CTn2/CTn5), но и обнаружить совершенно новые варианты секреторного аппарата.

 

Рис. 3. Распределение VirB4 и VirD4 АТФаз СС4Т-С среди штаммов C. difficile с аннотированными геномами в базе данных NCBI.

АТФазы могли быть представлены в геноме в 1 (1 локус), 2 (2 локуса) или 3 (3 локуса) вариантах. В случае если аминокислотные последовательности были идентичны более чем на 87% WP_011861117.1 (VirD4_Ctn4) и WP_011861114.1 (VirB4_Ctn4), мы причисляли их к группе CTn4. Если обе последовательности были идентичны более чем на 87% WP_011860784.1 (VirD4_Ctn2/5) и WP_042741540.1 (VirB4_Ctn2/5), то их относили к группе CTn2/5. При меньших значениях АТФазы причисляли к группе CTnX. Повреждёнными считались аминокислотные последовательности без мотивов WalkerA или WalkerB, для которых доказано участие в формировании олигомерных комплексов и формирующих активный центр фермента.

Fig. 3. Distribution of VirB4 and VirD4 T4SS-C ATPases among C. difficile strains with annotated genomes in the NCBI database.

In genomes, ATPases could be present in 1 (1 locus), 2 (2 loci), or 3 (3 loci) variants. If amino acid sequences were more than 87% identical to WP_011861117.1 (VirD4_Ctn4) and WP_011861114.1 (VirB4_Ctn4), we assigned them to the CTn4 group. If both sequences were more than 87% identical to WP_011860784.1 (VirD4_Ctn2/5) and WP_042741540.1 (VirB4_Ctn2/5), they were assigned to the CTn2/5 group. At lower values, ATPases were assigned to the CTnX group. The amino acid sequences lacking Walker A or Walker B motifs, which participate in the formation of oligomeric complexes and constitute the active center of the enzyme, were seen as damaged.

 

Выводы

Проблема инфекции C. difficile и в настоящее время не теряет актуальности, а с распространением внутрибольничных вспышек и появлением внебольничных форм растёт потребность в новых видах профилактики и лечения этого заболевания. Исходя из исследований последних лет можно заключить, что МГЭ способствуют высокой вирулентности C. difficile. Важнейшими компонентами МГЭ являются СС4Т, впечатляющее разнообразие которых среди грамположительных микроорганизмов вообще и C. difficile в частности говорит об их высокой эволюционной и, следовательно, медицинской значимости. Приспособленные вначале к переносу генов адаптивного ответа к неблагоприятным факторам среды, в дальнейшем СС4Т приобрели способность к осуществлению транспорта и белковых молекул — факторов вирулентности. Эти процессы убедительно показаны в работах по системам секреции патогенных грамотрицательных микроорганизмов. У грамположительных бактерий, в частности у C. difficile, подобный тип участия МГЭ в патогенезе инфекционных заболеваний значительно менее изучен. Не определён состав секреторного аппарата, в который, помимо охарактеризованных АТФаз VirB4 и VirD4, а также белка трансмембранного канала VirB6, как мы предполагаем, входят гомолог VirB1, компоненты релаксосомы и адгезины. Последние, будучи потенциальными факторами вирулентности, представляют особый интерес. Дальнейшая работа по изучению как состава и строения СС4Т-С в целом, так и её отдельных компонентов может способствовать существенному прогрессу в понимании патогенеза соответствующих инфекций и разработке патогенетически обоснованных подходов к профилактике и лечению заболеваний, вызываемых C. difficile.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution. Аll authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.

¹ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/taxonomy/1496/

Об авторах

Юлия Валерьевна Сорокина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Автор, ответственный за переписку.
Email: YV_Sorokina@gamaleya.org
ORCID iD: 0000-0002-1869-742X

н.с. отдела бактериальных инфекций

Россия, Москва

Юрий Фёдорович Белый

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Email: belyi@gamaleya.org
ORCID iD: 0000-0003-2312-1465

д.м.н., рук. отдела бактериальных инфекций

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы