Inclusion of site-specific mutations in the PB1-gene of a virulent A/WSN/33 (H1N1) strain of influenza A virus changes its phenotypic characteristics

V. Yu. Kost; Кост В. Ю.; O. A. Sukhova; Сухова О. А.; I. I. Akopova; Акопова И. И.; E. O. Gorbacheva; Горбачёва Е. О.; K. V. Lisovskaya; Лисовская К. В.; A. A. Rtishchev; Ртищев А. А.; S. G. Markushin; Маркушин С. Г.

doi:10.36233/0372-9311-2019-6-21-29

Включение сайт-специфических мутаций в РВ1-ген вирулентного штамма A/WSN/33 (H1N1) вируса гриппа А меняет его фенотипические характеристики

Авторы: Кост В.Ю.¹, Сухова О.А.¹, Акопова И.И.¹, Горбачёва Е.О.¹, Лисовская К.В.¹, Ртищев А.А.¹, Маркушин С.Г.¹
Учреждения:
1. ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Выпуск: Том 96, № 6 (2019)
Страницы: 21-29
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 13.12.2019
Дата принятия к публикации: 13.12.2019
Дата публикации: 13.12.2019
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/491
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-21-29
ID: 491

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель – изучение изменений фенотипических характеристик вирулентного штамма А/WSN/33 вируса гриппа А под влиянием включения сайт-специфических мутаций в его РВ1-гене.

Материалы и методы. С помощью двухступенчатой полимеразной цепной реакции в РВ1-гене штамма А/WSN/33(H1N1) были включены ts-мутации, взятые из генома холодоадаптированных (ХА) штаммов – доноров аттенуации А/Энн Арбор/6/60 (H2N2), А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и А/Краснодар/101/35/59 (H2N2). Исследовали ts- и att-фенотип полученных сайт-специфических мутантов, иммуногенность, а также снижение массы тела у инфицированных мышей.

Результаты. Показано, что включение ts-мутаций из генома ХА штаммов – доноров аттенуации в РВ1-ген вирулентного штамма А/WSN/33 (H1N1) приводит к различным изменениям его фенотипических характеристик.

Обсуждение. Анализ генома ХА штаммов – доноров аттенуации вируса гриппа указывает на исключительно важное значение функциональных дефектов в РВ1-белке для формирования аттенуационного фенотипа вируса.

Заключение. Технологию сайт-специфического мутагенеза можно использовать для модификации РВ1-гена вирулентного штамма вируса гриппа А с целью конструирования живых гриппозных вакцин нового поколения.

Ключевые слова

вирус гриппа А, аттенуация, холодоадаптированные штаммы – доноры аттенуации, сайт-специфический мутагенез, ts-фенотип, att-фенотип, иммуногенность

Полный текст

Введение

Использование генно-инженерных подходов при получении гриппозных живых вакцин значительно расширяет возможности их конструирования. В последнее время значительный интерес среди исследователей вызывает генно-инженерный подход, предполагающий прямое включение заранее изученных и охарактеризованных мутаций, взятых из геномов холодоадаптированных (ХА) штаммов доноров аттенуации, в геном вирулентного штамма вируса гриппа с целью его трансформации в аттенуированный вакцинный вариант. Эта стратегия теоретически должна обеспечить лучшую иммунную защиту по сравнению с используемыми в настоящее время реассортантными живыми гриппозными вакцинами на базе стандартных ХА доноров аттенуации.

Цель данной работы изучение изменений фенотипа вирулентного штамма А/WSN/33 вируса гриппа под влиянием включения в его геном отдельных ts-мутаций, локализованных в РВ1-гене ХА штаммов доноров аттенуации.

Данные литературы в последнее время свидетельствуют о том, что использование технологии сайт-специфических мутаций может значительно продвинуть разработку живых гриппозных вакцин как в медицине, так и в ветеринарии. Вместе с тем прогресс в этой области обозначил наличие серьёзных нерешённых проблем. Согласно данным литературы, основным источником сайт-специфических ts-мутаций является ХА штамм А/Энн Арбор/6/60, полученный д-ром Х. Маассабом более полувека назад [1]. Три мутации из РВ1-гена данного штамма (K391E, E581G, A661T), одна мутация из РВ2-гена (N265S) и одна из NP-гена (D34G) составляют стандартный набор для модификации генома подавляющего количества вирулентных штаммов вируса гриппа человека, животных и птиц [2-5]. Однако использование этого набора мутаций не позволяет полностью аттенуировать не только пандемический штамм, но и некоторые вирулентные сезонные варианты вируса гриппа человека [2, 3]. Для полной аттенуации пандемического штамма NY-1681 (H1N1) потребовалось включение 7 ts-мутаций в РВ1и РВ2-гены, включая ts-мутации из генома штамма А/Энн Арбор/6/60 [6].

По данным литературы, включение сайт-специфических мутаций даже в геном серологически близкородственного вируса не всегда бывает удачным. В этой связи для получения новых вакцинных гриппозных штаммов целесообразно увеличить арсенал аттенуирующих мутаций и провести сравнительное исследование ts-мутаций, взятых из генома других ХА штаммов вируса гриппа человека. В России в течение многих лет в качестве донора аттенуации для живых гриппозных вакцин используется ХА штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [7-9]. Генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию этого штамма, главным образом сосредоточены в РВ1-гене (K265N, V591I) и РВ2-гене (V478L). В другом недавно полученном ХА штамме А/ Краснодар/101/35/59 (H2N2) ts-мутация, ответственная за ts-фенотип, локализована в РВ1-гене (I147T) [10]. Потенциал данных ts-мутаций, а также ts-мутаций в РАи NPгенах этих штаммов в плане влияния на модификацию фенотипических характеристик вирулентных штаммов вируса гриппа изучен достаточно поверхностно. Исследования в этом направлении дали бы возможность сравнить эффективность описанных выше мутаций, а также расширить арсенал сайт-специфических мутаций, что весьма полезно для дальнейшего конструирования живых гриппозных вакцин. Основной мишенью для включения сайт-специфических мутаций остаются гены, кодирующие белки полимеразного комплекса, состоящего из трёх субъединиц: РВ1, РВ2 и РА. В данной работе мы попытались провести сравнительное исследование аттенуационного потенциала отдельных ts-мутаций, локализованных в РВ1-гене отечественных ХА штаммов-доноров А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и канонического штамма А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) при включении в их геном гетерологичного вирулентного штамма А/WSN/з3 (H1N1).

Материалы и методы

Вирусы. В работе был использован генно-инженерный штамм А/WSN/33, полученный методом обратной генетики с помощью набора плазмид pHW2000 [11], содержащих отдельные гены данного вируса.

Куриные эмбрионы (КЭ). Все использованные в работе сайт-специфические мутанты поддерживали путём пассажей в 10-11-дневных КЭ. Активность репродукции вирусов гриппа оценивали по результатам титрования в КЭ, инкубированных при 34, 37, 38 и 39 °С, и выражали в RCT (reproductive capacity at different temperatures). RCT₃₉ = (lg ЭИД₅₀/0,2 мл при 34 °С lg ЭиД₅₀/0,2 мл при 39 °С). Вирусы считали температурочувствительными (ts-фенотип), если RCT₃₉ > 5,0 Ig ЭИД50/0Д мл.

Культуры клеток. В опытах по трансфекции использовали клетки HEK293T и линию клеток MDCK, полученных из Института Пастера (Франция). Все клетки выращивали при 37 °С в СО₂-инкубаторе.

Мутагенез. Для генно-инженерных работ с вирусом гриппа штамма A/WSN/33 (H1N1) использовали 8-плазмидную трансфекционную систему на основе вектора pHW2000. Каждая из 8 плазмид содержала соответствующий ген вируса гриппа, фланкированный необходимыми регулирующими элементами для сборки вируса на клеточной культуре при трансфекции [11].

Мутагенез РВ1-гена проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) за 2 раунда. Для ПЦР использовали стандартный протокол по набору реактивов Tersus PCR Kit (кат. номер PK021). Для контроля длины ПЦР продукта проводили аналитический форез в 1,5% агарозном геле с добавлением буфера ТАЕ. Клонирование проводили с помощью так называемой Golden Gate реакции [12]: совмещение рестрикции-лигирования вставки с вектором в одной реакции. Для этого была получена линейная форма вектора pHW2000 с помощью ПЦР с праймеров, на 5’-концах которых находились сайты рестрикции BsmBI. Реакцию Golden Gate ставили в 10 мкл. Использовали рестриктазу Esp3I (BsmBI) (Fermentas/ThermoScientific), которую добавляли до 0,25 ед./мкл, 10* Fermentas Tango Buffer, Т4 ДНК лигаза (Сибэнзим, Россия) до 5 ед./мкл, дитиотреитол до 1 mM, АТФ до 1 mM и линейный вектор со вставкой по 50 нг (молярное соотношение вектор/вставка = 1/3). Реакцию проводили в амплификаторе с программой: 15 циклов каждый по 5 мин при 37 °С и 5 мин при 17 °С.

Трансформацию проводили на рубидиевых компетентных бактериальных клетках (комп. 10^-7,0) штамма DH5a. После разморозки во льду к клеткам добавляли ¹A часть лигазной смеси. Далее суспензию клеток инкубировали 1 ч во льду, проводили «хит шок» (2 мин при 42 °С на водяной бане), инкубировали во льду 2 мин, добавляли среду LB без антибиотика и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Клетки высеивали на чашки Петри с 1,5% агаром и средой LB с ампициллином (200 мкг/мл), инкубировали 16 ч при 37 °С. Скрининг удачных клонов, в которых плазмида содержала вставку нужной длины, проводили при помощи ПЦР с последующим электрофоретическим анализом. Контроль нуклеотидной последовательности осуществляли с помощью секвенирования.

Для выделения плазмиды из бактериальных клеток использовали Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit (кат. номер K0503). Концентрацию и чистоту (отношение 260/280 >1,8) измеряли на «NanoDrop 2000».

Рекомбинантная ДНК и обратно-генетические методы. В экспериментах использовали плазмиду pHW2000 [11], разработанную для получения вируса гриппа методом обратной генетики. Плазмида pHW2000, а также плазмиды со вставками генов штамма вируса гриппа А/WSN/33 были любезно предоставлены д-ром Р. Вебстером (Мемфис. США). Для накопления плазмид использовали штамм E. coli DH5alpha.

Накопление и концентрирование вирусов. Вирусы накапливали в КЭ по стандартной методике. Для последующего выделения РНК вирусы концентрировали центрифугированием.

Выделение вирусной РНК. Для последующей постановки ПЦР выделяли вирусную РНК при помощи набора для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови (ООО «Лаборатория Изоген», Москва).

Полимеразная цепная реакция в обратной транскрипции. Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР при помощи ревертазы M-MuLV (НПО «СибЭнзим», Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР ставили с высокоточной полимеразой Tersus (ЗАО «Евроген», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой агарозы осуществляли при помощи набора (Thermo Fisher Scientific, США).

Клонирование в Е. coli. Опыты по клонированию (работа с бактериями, рестрикция, лигирование и т.п.) проводили по стандартным методикам или в соответствии с рекомендациями производителя для соответствующих ферментов (Т4 ДНК лигаза, рестриктазы Esp3I и Eco31I).

Секвенирование вставок в полученных плазмидах проводило ЗАО «Евроген» на автоматическом секвенаторе «MegaBACE-500».

Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen, США) либо в кокультуре клеток 293Т и MDCK, либо в однодневном монослое клеток 293Т (плотность клеточного монослоя около 70%) в соответствии с методическим протоколом, прилагаемым к реагенту Lipofectamine LTX.

Репродукция вирусов в лёгких мышей. Изучали att-фенотип по следующей методике: группы самок беспородных мышей (по 5 голов на группу) инфицировали интраназально под лёгким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 10^5,0 ЭИД₅₀ (в дозе 50 мкл на мышь). Через 72 ч мышей усыпляли и извлекали лёгочную ткань. Из лёгочной ткани готовили 10% суспензию в ступках с тёртым стёклом. Инфекционный титр вируса в 10% суспензии лёгких определяли в КЭ и выражали в Ig ЭИД₅₀/0,2 мл. Все реассортанты были исследованы в трёх независимых опытах.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы Excel. Измерения проводили в трёх пробах, подсчитывали среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD). Данные представляли как М ± SD. Достоверность различий оценивали с помощью ί-критерия Стьюдента.

Результаты

Сравнительное изучение ts-фенотипа вариантов штамма J/WSN/33 вируса гриппа, имеющих сайт-специфические мутации в гене РВ1. Ts-маркёр является важнейшим маркёром аттенуации для штаммов кандидатов в живые гриппозные вакцины. Поэтому на первом этапе был исследован данный генетический признак у полученных сайт-спец-ифических мутантов. Как видно из данных табл. 1, включение мутаций из РВ1-гена ХА штаммов доноров аттенуации в геном вирулентного штамма А/WSN/33 приводило к снижению или к резкому снижению размножения при повышенной температуре (38-39 °С). Следует отметить, что выраженность ts-фенотипа сайт-специфических мутантов варьировала в широком диапазоне в зависимости от включения ts-мутаций из РВ1-гена того или иного ХА штамма донора аттенуации и количества включённых мутаций. Так, включение единичных ts-мутаций K391E, E581G, E457D или А661Т из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) в геном исходного вирулентного штамма А/WSN/33 (H1N1) приводило к незначительному изменению ts-фенотипа вируса. С другой стороны, включение большего количества ts-мутаций из РВ1-гена ХА штаммов А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) вызывало резкое снижение способности вируса реплицироваться при температуре 39 °С. Включение единичных ts-мутаций из генома ХА штамма А/Ленинград/134/17/57 в геном штамма А/WSN/33 также вызывало недостаточно глубокое изменение ts-фенотипа вирулентного штамма. Однако совместное включение двух мутаций из РВ1-гена А/Ленинград/134/17/57 в геном штамма А/WSN/33 приводило к резкому падению размножения вирулентного штамма в КЭ при 38-39 °С. Интересно отметить, что единичная ts-мутация из РВ1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) при включении в геном штамма А/WSN/33 (H1N1) способствовала резкой утрате способности к размножению вируса-реципиента в КЭ при непермиссивных условиях. Следует отметить, что субъединица РВ1 содержит каталитический центр полимеразного комплекса, что делает структуру данного белка более ригидной. Это обстоятельство затрудняет включение ts-мутаций из генома разных ХА штаммов доноров аттенуации. Многократные попытки включить в РВ1-ген штамма А/WSN/33 (H1N1) ts-мутации из разных ХА штаммов доноров аттенуации были безуспешными.

Таблица 1

Изучение ts-фенотипа трансфектантов на базе штамма A/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в РВ1-гене

Исходный вирус и трансфектант

Титр вируса в куриных эмбрионах при разной температуре инкубации (lg ЭИД₅₀/0,2 мл)

34 °С

37 °С

38 °С

39 °С

A/WSN/33

№ 1 А/Энн Арбор/6/60٭ (K391E, E581G, E457D٭٭)

№ 2 А/Ленинград/134/17/57 (K265N, V591I)

№ 3 А/Краснодар/101/35/59 (I147T)

№ 4 А/Энн Арбор/6/60 (E581G)

№ 5 А/ Энн Арбор/6/60 (К391Е)

№ 6 А/ Энн Арбор/6/60 (Е457D)

№ 7 А/Ленинград/134/17/57 (K265N)

№ 8 А/Ленинград/134/17/57 (V591I)

№ 9 А/Энн Арбор/6/60 (А661Т)

6.5 ± 0,5

6.5 ± 0,32

6.5 ± 0,4

6.5 ± 0,5

6,75 ± 0,25

6.5 ± 1,0

7.0 ± 0,2

7.0 ± 0,5

7.0 ± 1,0

6.5 ± 0,5

4.5 ± 0,74

5.0 ± 0,25

4.0 ± 0,7

6.5 ± 0,25

6.5 ± 0,5

7.0 ± 1,0

7.0 ± 0,25

6.5 ± 0,25

7.0 ± 0,75

6,25 ± 0,4

2.5 ± 0,5

2.5 ± 0,2

2.0 ± 0,5

5.5 ± 0,75

5.0 ± 0,56

5.5 ± 0,32

5.0 ± 0,4

6.0 ± 0,5

6.5 ± 0,56

6,25 ± 04

2,0 ± 0,2

< 1,0

4.5 ± 0,5

4,0 ± 0,4

4.5 ± 1,0

3.5 ± 0,4

5.5 ± 0,75

5.5 ± 1,0

П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 2, 3: * название ХА штамма, из генома которого были использованы мутации; ** в скобках указано количество мутаций и их локализация в РВ1-белке трансфектанта.

Изучение вирулентности полученных сайт-специфических мутантов для мышей. Анализ вирулентности исследованных трансфектантов для мышей свидетельствует о том, что включение ts-мутаций из РВ1-гена ХА штаммов в геном вирулентного штамма А/WSN^ приводит к снижению вирулентности данного штамма. В частности, как видно из данных табл. 2, включение двух ts-мутаций из РВ1-гена ХА штаммов А/Ленинград/134/17/57 (K265N, V591I) или одной ts-мутации из РВ1-гена (I147T) штамма А/Краснодар/101/35/59 в геном штамма А/WSN/33 значительно подавляло размножение этого штамма в лёгких мышей. С другой стороны, в лёгких мышей, инфицированных трансфектантами № 4 или 5, унаследовавшими единичные мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60, наблюдалось сниженное, но заметное размножение вируса. Как видно из наших данных, включение единичных ts-мутаций из РВ1-гена ХА штаммов в геном вирулентного штамма А/WSN/33, как правило, незначительно снижает его вирулентность. Исключением является ts-мутация I147T из РВ1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59. Включение этой мутации в геном вирулентного штамма А/WSN/33 значительно подавляло размножение вируса в лёгких мышей. Интересно отметить, что при заражении мышей реассортантом между ХА штаммом А/ Краснодар/101/36/59 и штаммом А/WSN/33, который содержал мутантный РВ1-ген от штамма А/Краснодар/101/35/59, наблюдалось более заметное подавление размножения вирулентного вируса в лёгких, при одинаковой дозе интраназального заражения (см. табл. 2). Данное явление можно рассматривать как влияние фенотипического окружения на проявление эффекта мутации.

Таблица 2

Изучение att-фенотипа трансфектантов на базе штамма А/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в РВ1-гене

Исходный вирус и трансфектанты	Титр вируса в лёгких мышей (lg ЭИД₅₀/1,0 г лёгочной ткани)
А/WSN/33	5,3 ± 0,4
№ 1 А/Энн Арбор/6/60® (K391E, E581G, E457D®®)	2,5 ± 0,4
№ 2 А/Ленинград/134/17/57 (K265N, V591I)	2,5
№ 3 А/Краснодар/101/35/59 (I147T)	< 1,0
№ 4 А/Энн Арбор/6/60 (Е58Ш)	3,5 ± 0,4
№ 5 А/ Энн Арбор/6/60 (K391)	4,5 ± 0,4
№ 7 А/Ленинград/134/17/57 (R265N)	2,5 ± 0,5
№ 8 А/Ленинград/134/17/57 (V591I)	4,0 ± 1.0
Реассортант А/Краснодар/101/35/59 x A/WSN/33, имеющий мутантный РВ1-ген от штамма А/Краснодар/101/35/59	1,3 ± 0,3

Изучение иммуногенности сайт-специфических мутантов. Проведён сравнительный анализ способности отдельных сайт-специфических мутантов индуцировать гуморальный иммунитет у мышей в ответ на интраназальное заражение. В качестве объектов изучения были выбраны трансфектант № 1, имеющий в геноме 3 мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60, трансфектант № 2, унаследовавший 2 мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Ленинград/134/17/57, и трансфектант № 3 с единичной мутацией в геноме из РВ1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59. Исследование гуморального ответа было проведено с целью оценить иммуногенность вирусов, реплицирующихся в пределах верхнего респираторного тракта мышей. Как видно из табл. 3, наивысший титр гуморальных антител (1 : 1280) был обнаружен у мышей, иммунизированных трансфектантом № 1, содержащим в геноме мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60. Этот факт можно было объяснить размножением остаточного вируса в лёгких мышей. Трансфектанты № 2 и 3, содержащие в геноме ts-мутации из РВ1-гена ХА штаммов А/Ленинград/134/17/57 и А/Краснодар/101/35/59, при интраназальной иммунизации мышей индуцировали умеренный уровень гуморального иммунного ответа (1 : 320, 1 : 160). Важно отметить, что в сыворотке крови иммунизированных мышей наблюдались антитела, способные реагировать с дрейфовыми вариантами.

Таблица 3

Изучение иммуногенности трансфектантов на базе штамма А/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в РВ1-гене

Трансфектанты	Титр сывороточных антител в РЗГА*** при взаимодействии вирусов с антисыворотками
	антигены
	А/WSN/33	А/Брисбен/07	А/Калифорния/09
№ 1 А/Энн Арбор/6/60٭ (К381Е, Е58Ю, E457D٭٭)	1 :1280	1 : 40	< 1 : 10
№ 2 А/Ленинград/134/ 17/57 (065N, V591I)	1 : 320	1 : 40	< 1 : 10
№ 3 А/Краснодар/101/35/59(I147T)	1 : 160	1 : 40	< 1 : 10

П р и м е ч а н и е. *** РЗГА реакция задержки гемагглютинирующей активности.

Изучение весовых характеристик мышей, инфицированных интраназально вариантами штамма А/WSN/SS вируса гриппа, содержащими сайт-специфические мутации в гене РВ1. Как показано на рисунке, у мышей, инфицированных интраназально вариантами штамма А/WSN/33, содержащими в гене РВ1 сайт-специфические мутации, унаследованные от различных ХА штаммов доноров аттенуации, наблюдались различные темпы снижения массы тела. У мышей, инфицированных исходным вирулентным штаммом А/WSN/33, отмечено быстрое и значительное снижение массы тела (20-25%) к 6-му или 7-му дню с момента заражения. Масса тела мышей, инфицированных трансфектантом, имевшем в РВ1-гене 3 мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (K391E, E581G,Е457D), не снижалась столь значительно. Наблюдалось снижение массы тела в пределах 10-12%. Этот факт свидетельствует о том, что наличие трёх мутаций из пяти, формирующих ts-фенотип ХА штамма А/ Энн Арбор/6/60 в геноме вирулентного штамма А/WSN/33, значительно снижает его вирулентный потенциал. Трансфектанты, имеющие в РВ1-гене единичные мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60, по динамике снижения массы тела занимали среднее положение между трансфектантом с тремя мутациями из ХА штамма А/ Анн Арбор/6/60 и исходным вирулентным штаммом А/WSN/33. Интересно отметить, что у мышей, инфицированных трансфектантом, имеющим в РВ1-гене только одну мутацию Ile147Thr из РВ1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (ffiN2), отмечено наименьшее снижение массы тела на протяжении всего срока наблюдения: не более 3-5% на 7-8-е сутки. Минимальное снижение массы тела наблюдалось и у мышей, инфицированных трансфектантом, содержащем в геноме две ts-мутации из РВ1-гена ХА штамма А/Ленинград/134/17/59 (K265N, V591I). Как видно из наших данных, интенсивность уменьшения массы тела у животных не коррелировала с количеством мутаций, включённых в геном вирулентного штамма.

Динамика снижения массы тела мышей, инфицированных штаммом А/WSN/33 и трансфектантами № 1, 2, 3 на базе этого штамма, содержащими мутации в РВ1-гене.

Группы самок беспородных мышей (по 5 голов в каждой) инфицировали интраназально под лёгким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 10^5,0 ЭИД (в объёме 50 мкл на мышь). Массу тела мышей измеряли ежедневно и рассчитывали в процентах от массы тела каждого животного в день заражения (0-й день). По оси абсцисс дни наблюдения; по оси ординат снижение массы тела мышей в процентах от массы тела каждого животного в день заражения (0-й день).

Обсуждение

Согласно данным литературы, РВ1-белок функционирует в качестве полимеразной каталитической субъединицы, вовлечённой в элонгацию вирусспецифической РНК [13]. Он включает консервативные мотивы и субдомены («пальцы» и «ладонь»), характерные для РНК-зависимых РНК-полимераз, ассоциированных с промоторными последовательностями вирионной и комплементарной РНК. Первые 15 аминокислотных остатков РВ1-белка связаны с С-концевым доменом РА-белка. Внешняя поверхность субдоменов («пальцы» и «ладонь») РВ1-белка тесно примыкает к линкерной последовательности РА-белка (аминокислотные последовательности 197-257), формируя многочисленные гидрофобные и полярные взаимодействия [14]. Специфическая область РВ1-белка взаимодействует с N-концевым доменом РВ2-белка. Каталитический центр РВ1-белка содержит три консервативных аминокислотных остатка (Asp 305, Asp 444, Asp 445), связанных с двумя ионами двухвалентных металлов, важных для синтеза вирусспецифической РНК [15].

Анализ генома ХА штаммов доноров аттенуации вируса гриппа свидетельствует о постоянном наличии ts-мутаций в различных доменах РВ1-гена в этих штаммах, что указывает на исключительно важное значение функциональных дефектов в РВ1-белке для формирования аттенуационного фенотипа вируса [4, 7, 10, 16]. В этой связи изучение возможности включения ts-мутаций из генома различных ХА штаммов в РВ1-ген вирулентного штамма с целью его аттенуации представляет теоретический и практический интерес. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что включение ts-мутаций, локализованных в РВ1-гене ХА штаммов-доноров А/Ленинград/134/17/57 ((H2N2) и А/Краснодар/101/35/59 (H2N2), в геном вирулентного штамма А^Б^33 (H1N1)) приводит к изменению его tsи att-фенотипа, при этом практически не влияя на снижение массы тела иммунизированных мышей, превращает его в аттенуированный вариант. При проведении сайт-специфического мутагенеза мы не наблюдали влияния нового фенотипического окружения на эффективность фенотипического проявления включенных мутаций. Мы объясняем это принадлежностью как ХА штаммов-доноров, так и штамма-реципиента к вирусам гриппа человека, обладающим сходным температурным оптимумом активности вирусной РНК-полимеразы. В связи с этим РВ1-субъединица, как часть полимеразного комплекса, выполняющая в инфицированных клетках каталитическую функцию, характеризуется повышенной ригидностью, что создаёт определённые трудности для одновременного включения tsмутаций из генома различных ХА штаммов-доноров. Наши многократные попытки включить одновременно в РВ1-ген ts-мутации из генома различных ХА штаммов-доноров не приводили к успеху. С другой стороны, в РВ2-ген штамма А/WSN/33, обладающий большей пластичностью, были одновременно успешно включены ts-мутации трёх ХА штаммов доноров аттенуации.

Заключение

Технология сайт-специфического мутагенеза может быть успешно использована для модификации РВ1-гена вирулентных штаммов вируса гриппа А с целью получения живых гриппозных вакцин нового поколения.

Финансирование. Исследования были проведены при финансовой поддержке ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.