ОСОБЕННОСТИ БИОМАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ГРИППЕ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Грипп — острая респираторная инфекция с риском осложнений, включая
пневмонии, острую дыхательную недостаточность, инфекционно-токсиче -
ский шок, менингиты, острый дистресс-синдром, а также декомпенсацию
сопутствующих хронических заболеваний — бронхиальной астмы, хрониче-
ской обструктивной болезни легких, заболеваний печени, почек, сердечно-
сосудистой системы [11, 15, 17]. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистри-
руют 3 — 5 млн больных гриппом [8].
Лечение гриппа основано на применении терапевтических препаратов
прямого действия — ингибиторов нейраминидазы (занамивира, озельтамивир
фосфата — Тамифлю), релензы и отечественного аналога «Номидес» произ-
водства «Фармасинтез-Ритейл», а также амантадина и римантадина, направ-
ленных на трансмембранную область белка М2 вируса гриппа, и индукторов
интерферонов (арбидола, кагоцела, циклоферона и др.). Однако возникнове-
ние мутантных вариантов РНК-содержащего вируса гриппа, устойчивых к
действию этиотропных ингибиторов, и распространение иммунодефицитов
среди населения обусловливают необходимость поиска новых противовирус-
ных средств и их комбинированного использования.
При вирусной инфекции в результате презентации эндогенных антигенов
в комплексе с основным комплексом гистосовместимости MHC-1 происходит
индукция экспрессии генов Th1. Показано, что инфекция вирусом гриппа
типа А индуцирует ранние цитокины: IFNα, TNFα, IL1α и IL1β, которые
являются ответственными за локальные воспалительные реакции. Позднее
продуцируются IL6, белки воспаления макрофагов MIPs; хемокин IL8, обе-
спечивающий хемотаксис нейтрофилов; белки-хемоаттрактанты моноцитов
MCPs [2, 13, 18]. Ряд хемокинов RANTES, MIP1α, MCP1, MCP3 и IP10 инду-
цируют миграцию нейтрофилов или макрофагов в ткани [13, 18]. Поли-
функциональные цитокины IFNα, TNFα, IL1 и IL6 ассоциируют с лихора-
дочным состоянием, слабостью, сонливостью и анорексией. Помимо этого,
TNFα и IL1 повышают уровень молекул адгезии на эндотелии кровеносных
сосудов и, таким образом, стимулируют накопление нейтрофилов и макрофа-
гов в респираторном тракте [10].
Помимо индукции врожденной резистентности и Th1 поляризации преи-
мущественно клеточного адаптивного иммунного ответа дисбаланс цитокинов
при гриппозной инфекции может приводить к патогенному действию вслед-
ствие некроза тканей и увеличения проницаемости сосудов [3]. Цитокиновые
каскады, обусловленные синергичной активацией экспрессии генов цитоки-
нов и плейотропностью их действия, могут приводить к нарушениям защит -
ных систем организма и усилению патогенеза [2].
Цель данного исследования: анализ биомаркеров воспаления с использо-
ванием обратной транскрипции с ПЦР в реальном времени и мультиплекс-
ного иммунофлуоресцентного анализа xMAP на магнитных микросферах при
гриппе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследование 17 пациентов Инфекционной клинической больницы № 1
проводили в НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи в
феврале—марте 2015 г. Пациентов обследовали после поступления в стационар
на 1 — 2 сутки заболевания согласно правовым аспектам оказания медицин-
ской помощи с получением от них информированного письменного согласия.
Группу сравнения составили 10 практически здоровых волонтеров 25 — 55 лет
без клинических и лабораторно подтвержденных признаков респираторных
заболеваний.
Анализ носоглоточных смывов больных гриппом проводили посредством
ОТ-ПЦР-РВ. Диагноз с идентифицикацией возбудителя ОРВИ (вирусов
гриппа А и В) подтвержден посредством ОТ-ПЦР-РВ с использованием ком-
мерческих наборов «Амплисенс® Influenza virus A/B-FL», «АмплиСенс®
Influenza virus А/H1-swine-FL» и «АмплиСенс® Influenza virus A-тип-FL».
Другие респираторные вирусы (РНК риновирусов, респираторно-синцитиаль-
ного (РС) вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов,
коронавирусов видов ОС43, Е229, NL63, HKUI, ДНК аденовирусов групп B,
C и E и бокавируса) определяли с использованием набора «ОРВИ-АмплиСенс»
(«АмплиСенс», Москва).
Количественное определение РНК IFN α, β, γ, λ в мононуклеарных клет-
ках крови больных гриппом и здоровых доноров проводили посредством ОТ-
ПЦР-РВ в соответствии с [16].
Концентрации 37 биомаркеров воспаления определяли в сыворотке крови
с использованием набора «Bio-Plex ProTM Human Inflammation Panel 1 37-plex»
на анализаторе MAGPIX («BioRad», США).
Статистическое сравнение выборочных долей и количеств цитокинов про-
водили c использованием критерия Стьюдента и ПО «Biostat». Принят уровень
значимости различий при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация возбудителей респираторных инфекций в носоглоточных
смывах 10 больных методом ОТ-ПЦР-РВ показала наличие вируса гриппа
A(H3N2) — у четырех, гриппа В — у шести больных. Среднетяжелое течение
гриппа проходило с головной болью, ломотой, сухим кашлем вследствие тра-
хеита, температурой 37,7°С. У 1 пациента грипп осложнился лакунарной ангиной.
Необходимо отметить, что на начальных стадиях заболевания при среднетяжелом
течении гриппа у обследуемых пациентов концентрации лейкоцитов и скорость
оседания эритроцитов оставались в пределах физиологической нормы [6].
Тест определения функциональной активности на культуре клеток фибро-
бластов легких эмбриона человека, клетках почки зеленой мартышки Vero
сывороточного и бессывороточного ведения [16] выявил сниженные показа-
тели продукции IFN 1 и 2 типов у больных гриппом. Так, способность к про-
дукции IFN 1 и 2 типов лейкоцитами крови больных гриппом составила 40
[15; 80] и 8[3; 16] ед/мл; у практически здоровых людей в сезонный эпидеми-
ческий период — 160 [120; 320] и 24 [12; 48] ед/мл соответственно.
Анализ экспрессии генов IFN 3 типов показал преимущества определения
РНК в мононуклеарных клетках крови по сравнению с сыворотками как по
общему количеству положительных образцов, так и по количественным оцен-
кам (табл. 1).
Для IFNα были показаны как отличия частот детекции РНК в лимфоцитах
больных (41,2±12,3%) и здоровых людей (26,7±11,8%), так и концентрации
мРНК в 1 мл крови. Концентрации белка IFNα2 также были достоверно выше.
Содержание IFNβ в сыворотке крови больных гриппом и у здоровых не от-
личалось. Частота детекции РНК IFNγ (50%) и белка (2,9 пг/мл) в крови у
больных гриппом и у здоровых доноров (40% и 2,1 пг/мл, соответственно)
были статистически сходными. Отмечена высокая частота (80 — 100%) и уро-
вень экспрессии гена IFNλ у больных и здоровых.
Необходимо отметить, что в соответствии с количественными оценками
по данным ОТ-ПЦР-РВ и xMAP (табл. 1) содержание белков превышало ко-
личество молекул соответствующих мРНК в единице объема крови, что мог-
ло быть обусловлено как каскадным усилением при трансляции, так и большей
стабильностью белков по сравнению с РНК.
Мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ на магнитных микро-
сферах 37 белков воспаления показал (табл. 2) повышенное содержание 7
белков в крови больных гриппом по сравнению с показателями у здоровых
добровольцев, к которым относятся 4 белка семейства TNF, такие как APRIL/
TNFSF13 (P<0,05), BAFF/TNFSF13B (P<0,001), их растворимые рецепторы
sTNF-R1/sTNF-R2 (P<0,05), а также цитокины IFNα2 (P<0,05), IL10 (P<0,001),
белок остеопонтин (P<0,001). Концентрации двух маркеров: комплекса гли-
копротеина 130 с растворимым рецептором IL-6 gp130/sIL-6Rβ и матриксной
металлопротеиназы ММР-1 у больных гриппом были пониженными (P<0,05)
по сравнению с контролем.
Для оценки сбалансированности и направленности иммунного ответа
определяли коэффициенты поляризации (КП) [1] как соотношение концен-
траций IL10 и IFNγ в сыворотках крови больных гриппом и здоровых доноров,
которые составили 0,53 и 0,07, соответственно. Данные свидетельствуют о Th1
поляризации в результате эндогенной презентации антигенов при инфекции
вирусами гриппа A и В в начале заболевания с последующей индукцией пре-
имущественно клеточного иммунного ответа.
В эпидемический сезон 2014 — 2015 гг. в Москве зарегистрирована одно-
временная циркуляция штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В. Вирус гриппа
В проявлял высокую активность в течение всего эпидемического сезона в от-
личие от его появления в весеннее время в предыдущие годы [4].
При инфекции вирусами гриппа A и В качественные и количественные
отличия РНК IFN 3 типов в лимфоцитах крови больных гриппом (табл. 1 и 2)
и в клетках слизистой носоглотки [7] в первые 2 дня заболевания свидетель-
ствуют о дифференциальной индукции их экспрессии на входных воротах
инфекции, которая обеспечивает врожденную неспецифическую резистент-
ность с провоспалительными цитокинами Тh1 пути с последующим преиму-
щественно клеточным иммунным ответом. Активация экпрессии гена IFNα
на уровне транскрипции и трансляции в мононуклеарных клетках крови (табл.
1) при отсутствии РНК в смывах [7] сопровождалась синхронной ранней ин-
дукцией транскрипции РНК IFNβ и IFNγ в клетках слизистых оболочек при
полном отсутствии в клетках крови [7].
Повышенные концентрации только 7 из 37 анализируемых биомаркеров
воспаления коррелировали с элиминацией вируса без последующих аллерги-
ческих или аутоиммунных осложнений у больных гриппом. Из 7 биомаркеров
с повышенной концентрацией у больных гриппом 6 относятся к Th1 пути
(табл. 2). Для семейства TNF характерно не только увеличение продукции
собственно цитокинов APRIL и BAFF, способных к взаимодействию между
собой [20], но и двух растворимых рецепторов sTNF-R1 и sTNF-R2. Активация
цитокинов семейства TNF приводит к индукции преимущественно клеточ-
ного иммунного ответа Th1 типа, вызывает повышение проницаемости ка-
пилляров, а при избытках — повреждение эндотелия сосудов и возникновение
тромбов [5, 9]. Из двух белков семейства TNF с достоверно повышенными
концентрациями у больных гриппом APRIL при связывании с рецепторами
способен индуцировать апоптоз. Таким образом, необходимость связывания
APRIL с BAFF и со специфическими рецепторами обусловливает однона-
правленность и синхронность их регуляции [12, 20] у больных гриппом (табл.
2). Статистически значимый рост концентрации полифункцинального сиа-
лопротеина остеопонтина, как известно, обеспечивает индукцию цитокинов
семейства IL-12 и раннюю активацию лимфоцитов по Th1 пути [14].
Увеличение концентрации регуляторного противовоспалительного цито-
кина IL10 свидетельствует о своевременной регуляции воспаления и может
служить прогностическим маркером для больных гриппом. Достоверных из-
менений экспрессии генов других цитокинов Th2 пути не обнаружено.
Уменьшение концентрации комплекса гликопротеина 130 и растворимо-
го рецептора IL6 gp130/sIL-6Rβ, необходимого для активации IL6 индуци-
руемого каскада провоспалительных и противовоспалительных реакций на-
ряду с активацией Th17 иммунного ответа также свидетельствует о Th1
поляризации врожденного и адаптивного иммунитета в результате эндогенной
презентации внутриклеточных антигенов вируса гриппа в комплексе с MHCI.
Оценки КП=0,53 при гриппе позволяют количественно оценить преимуще-
ственно Th1 клеточный иммунный ответ.
Уменьшение концентрации только 1 из 3 исследованных матриксных ме-
таллопротеиназ — ММР-1, обеспечивающих регуляцию цитокиновой сети
посредством протеолитического гидролиза мембранных рецепторов [19], ве-
роятно, обусловлено завершением Th1 поляризации врожденной резистент-
ности в первые часы после заражения вирусом гриппа и индукцией вирус-
специфического преимущественно клеточного иммунитета на стадии начала
инфекционного заболевания.
Многократное преобладание количества молекул белков по сравнению с
мРНК более чем в 106 раз, вероятно, обусловлено регуляцией на стадии транс-
ляции и обеспечивает быстрое каскадное усиление биологической активности
цитокиновой сети, необходимое для подавления острой инфекции и элими-
нации вируса гриппа в течение нескольких суток.
На ранней стадии заболевания гриппом в клетках крови больных показа-
на активация экспрессии гена IFNα на стадии транскрипции и трансляции
наряду с индукцией цитокинов семейства TNF (APRIL и BAFF) и соответст-
вующих рецепторов (sTNF-R1 и sTNF-R2), а также активатора Т-лимфоцитов
— остеопонтина. Th1 поляризация врожденного иммунитета также обеспечи-
вается пониженными по сравнению с контрольной группой концентрациями
растворимого рецептора IL6 gp130/sIL-6Rβ, необходимого для индукции Th17
ответа, и металлопротеазы ММР-1, ответственной за протеолиз рецепторов
цитокинов. Своевременная регуляция цитокинов, опосредуемая IL10, обе-
спечивала восстановление пациентов без осложнений.

Об авторах

Т. П. Оспельникова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова,
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

к.м.н.,

105064, Москва, М. Казенный пер., 5а

(495)917-49-00

Россия

О. В. Морозова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

С. А. Андреева

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Е. И. Исаева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Л. В. Колодяжная

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова,
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Л. В. Колобухина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Л. Н. Меркулова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Е. И. Бурцева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Е. А. Мукашева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Ф. И. Ершов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы