Email this article INFLUENZA INFLAMMATION BIOMARKERS FEATURES
- Authors: Ospelnikova T.P.1, Morozova O.V.2, Andreeva S.A.3, Isaeva E.I.2, Kolodyazhnaya L.V.1, Kolobukhina L.V.2, Merkulova L.N.2, Burtseva E.I.2, Mukasheva E.A.2, Ershov F.I.2
-
Affiliations:
- Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
- Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
- Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
- Issue: Vol 95, No 3 (2018)
- Pages: 67-73
- Section: ORIGINAL RESEARCHES
- Submitted: 25.08.2019
- Accepted: 25.08.2019
- Published: 25.07.2018
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/416
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-3-67-73
- ID: 416
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. Analysis of inflammation biomarkers using reverse transcription with real time PCR (RT-PCR-RT) and multiplex immunofluorescent analysis xMAP with magnetic beads for the influenza infection. Materials and methods. Analysis of nasopharyngeal swabs, lymphocytes and blood sera of 10 patients with influenza and 10 donors was performed during the first 2 days of the disease by means of RT-PCR-RT and xMAP using the kit «37-plex» (BioRad). Results.The influenza virus A was revealed in 4 samples, the influenza virus B — in 6 swabs without mixed infections with other respiratory viruses. Analysis of the interferons (IFN) showed IFNα gene expression activation in patients’ lymphocytes but both the detection rate and the concentrations of IFNβ, IFNγ and IFNλ RNA were similar for patients and healthy donors. Among 37 inflammation biomarkers the concentrations of 7 proteins were enhanced including IFNα2, cytokines of TNF family (APRIL and BAFF), their soluble receptors sTNF-R1 and sTNF-R2, protein osteopontin and IL10. The concentrations of the complex of glycoprotein gp130 with the soluble receptor IL6 gp130/sIL-6Rβ and the matrix metalloprotease ММР-1 were reduced in patients’ sera. The polarization coefficient PI=[IL10]/[IFNγ]=0.53 for influenza samples suggested Th1 immune response. Conclusion. At the early stage of the influenza infection IFNα gene expression activation along with the induction of TNF family cytokines (APRIL and BAFF), their receptors (sTNF-R1 and sTNF-R2) and osteopontin as well as the inhibition of the complex gp130/sIL-6Rβ and metalloprotease ММР-1 were shown. Th1 immune response regulated by IL10 resulted in the recovery of the patients without complications.
Full Text
ВВЕДЕНИЕГрипп — острая респираторная инфекция с риском осложнений, включая
пневмонии, острую дыхательную недостаточность, инфекционно-токсиче -
ский шок, менингиты, острый дистресс-синдром, а также декомпенсацию
сопутствующих хронических заболеваний — бронхиальной астмы, хрониче-
ской обструктивной болезни легких, заболеваний печени, почек, сердечно-
сосудистой системы [11, 15, 17]. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистри-
руют 3 — 5 млн больных гриппом [8].
Лечение гриппа основано на применении терапевтических препаратов
прямого действия — ингибиторов нейраминидазы (занамивира, озельтамивир
фосфата — Тамифлю), релензы и отечественного аналога «Номидес» произ-
водства «Фармасинтез-Ритейл», а также амантадина и римантадина, направ-
ленных на трансмембранную область белка М2 вируса гриппа, и индукторов
интерферонов (арбидола, кагоцела, циклоферона и др.). Однако возникнове-
ние мутантных вариантов РНК-содержащего вируса гриппа, устойчивых к
действию этиотропных ингибиторов, и распространение иммунодефицитов
среди населения обусловливают необходимость поиска новых противовирус-
ных средств и их комбинированного использования.
При вирусной инфекции в результате презентации эндогенных антигенов
в комплексе с основным комплексом гистосовместимости MHC-1 происходит
индукция экспрессии генов Th1. Показано, что инфекция вирусом гриппа
типа А индуцирует ранние цитокины: IFNα, TNFα, IL1α и IL1β, которые
являются ответственными за локальные воспалительные реакции. Позднее
продуцируются IL6, белки воспаления макрофагов MIPs; хемокин IL8, обе-
спечивающий хемотаксис нейтрофилов; белки-хемоаттрактанты моноцитов
MCPs [2, 13, 18]. Ряд хемокинов RANTES, MIP1α, MCP1, MCP3 и IP10 инду-
цируют миграцию нейтрофилов или макрофагов в ткани [13, 18]. Поли-
функциональные цитокины IFNα, TNFα, IL1 и IL6 ассоциируют с лихора-
дочным состоянием, слабостью, сонливостью и анорексией. Помимо этого,
TNFα и IL1 повышают уровень молекул адгезии на эндотелии кровеносных
сосудов и, таким образом, стимулируют накопление нейтрофилов и макрофа-
гов в респираторном тракте [10].
Помимо индукции врожденной резистентности и Th1 поляризации преи-
мущественно клеточного адаптивного иммунного ответа дисбаланс цитокинов
при гриппозной инфекции может приводить к патогенному действию вслед-
ствие некроза тканей и увеличения проницаемости сосудов [3]. Цитокиновые
каскады, обусловленные синергичной активацией экспрессии генов цитоки-
нов и плейотропностью их действия, могут приводить к нарушениям защит -
ных систем организма и усилению патогенеза [2].
Цель данного исследования: анализ биомаркеров воспаления с использо-
ванием обратной транскрипции с ПЦР в реальном времени и мультиплекс-
ного иммунофлуоресцентного анализа xMAP на магнитных микросферах при
гриппе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследование 17 пациентов Инфекционной клинической больницы № 1
проводили в НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи в
феврале—марте 2015 г. Пациентов обследовали после поступления в стационар
на 1 — 2 сутки заболевания согласно правовым аспектам оказания медицин-
ской помощи с получением от них информированного письменного согласия.
Группу сравнения составили 10 практически здоровых волонтеров 25 — 55 лет
без клинических и лабораторно подтвержденных признаков респираторных
заболеваний.
Анализ носоглоточных смывов больных гриппом проводили посредством
ОТ-ПЦР-РВ. Диагноз с идентифицикацией возбудителя ОРВИ (вирусов
гриппа А и В) подтвержден посредством ОТ-ПЦР-РВ с использованием ком-
мерческих наборов «Амплисенс® Influenza virus A/B-FL», «АмплиСенс®
Influenza virus А/H1-swine-FL» и «АмплиСенс® Influenza virus A-тип-FL».
Другие респираторные вирусы (РНК риновирусов, респираторно-синцитиаль-
ного (РС) вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов,
коронавирусов видов ОС43, Е229, NL63, HKUI, ДНК аденовирусов групп B,
C и E и бокавируса) определяли с использованием набора «ОРВИ-АмплиСенс»
(«АмплиСенс», Москва).
Количественное определение РНК IFN α, β, γ, λ в мононуклеарных клет-
ках крови больных гриппом и здоровых доноров проводили посредством ОТ-
ПЦР-РВ в соответствии с [16].
Концентрации 37 биомаркеров воспаления определяли в сыворотке крови
с использованием набора «Bio-Plex ProTM Human Inflammation Panel 1 37-plex»
на анализаторе MAGPIX («BioRad», США).
Статистическое сравнение выборочных долей и количеств цитокинов про-
водили c использованием критерия Стьюдента и ПО «Biostat». Принят уровень
значимости различий при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация возбудителей респираторных инфекций в носоглоточных
смывах 10 больных методом ОТ-ПЦР-РВ показала наличие вируса гриппа
A(H3N2) — у четырех, гриппа В — у шести больных. Среднетяжелое течение
гриппа проходило с головной болью, ломотой, сухим кашлем вследствие тра-
хеита, температурой 37,7°С. У 1 пациента грипп осложнился лакунарной ангиной.
Необходимо отметить, что на начальных стадиях заболевания при среднетяжелом
течении гриппа у обследуемых пациентов концентрации лейкоцитов и скорость
оседания эритроцитов оставались в пределах физиологической нормы [6].
Тест определения функциональной активности на культуре клеток фибро-
бластов легких эмбриона человека, клетках почки зеленой мартышки Vero
сывороточного и бессывороточного ведения [16] выявил сниженные показа-
тели продукции IFN 1 и 2 типов у больных гриппом. Так, способность к про-
дукции IFN 1 и 2 типов лейкоцитами крови больных гриппом составила 40
[15; 80] и 8[3; 16] ед/мл; у практически здоровых людей в сезонный эпидеми-
ческий период — 160 [120; 320] и 24 [12; 48] ед/мл соответственно.
Анализ экспрессии генов IFN 3 типов показал преимущества определения
РНК в мононуклеарных клетках крови по сравнению с сыворотками как по
общему количеству положительных образцов, так и по количественным оцен-
кам (табл. 1).
Для IFNα были показаны как отличия частот детекции РНК в лимфоцитах
больных (41,2±12,3%) и здоровых людей (26,7±11,8%), так и концентрации
мРНК в 1 мл крови. Концентрации белка IFNα2 также были достоверно выше.
Содержание IFNβ в сыворотке крови больных гриппом и у здоровых не от-
личалось. Частота детекции РНК IFNγ (50%) и белка (2,9 пг/мл) в крови у
больных гриппом и у здоровых доноров (40% и 2,1 пг/мл, соответственно)
были статистически сходными. Отмечена высокая частота (80 — 100%) и уро-
вень экспрессии гена IFNλ у больных и здоровых.
Необходимо отметить, что в соответствии с количественными оценками
по данным ОТ-ПЦР-РВ и xMAP (табл. 1) содержание белков превышало ко-
личество молекул соответствующих мРНК в единице объема крови, что мог-
ло быть обусловлено как каскадным усилением при трансляции, так и большей
стабильностью белков по сравнению с РНК.
Мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ на магнитных микро-
сферах 37 белков воспаления показал (табл. 2) повышенное содержание 7
белков в крови больных гриппом по сравнению с показателями у здоровых
добровольцев, к которым относятся 4 белка семейства TNF, такие как APRIL/
TNFSF13 (P<0,05), BAFF/TNFSF13B (P<0,001), их растворимые рецепторы
sTNF-R1/sTNF-R2 (P<0,05), а также цитокины IFNα2 (P<0,05), IL10 (P<0,001),
белок остеопонтин (P<0,001). Концентрации двух маркеров: комплекса гли-
копротеина 130 с растворимым рецептором IL-6 gp130/sIL-6Rβ и матриксной
металлопротеиназы ММР-1 у больных гриппом были пониженными (P<0,05)
по сравнению с контролем.
Для оценки сбалансированности и направленности иммунного ответа
определяли коэффициенты поляризации (КП) [1] как соотношение концен-
траций IL10 и IFNγ в сыворотках крови больных гриппом и здоровых доноров,
которые составили 0,53 и 0,07, соответственно. Данные свидетельствуют о Th1
поляризации в результате эндогенной презентации антигенов при инфекции
вирусами гриппа A и В в начале заболевания с последующей индукцией пре-
имущественно клеточного иммунного ответа.
В эпидемический сезон 2014 — 2015 гг. в Москве зарегистрирована одно-
временная циркуляция штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В. Вирус гриппа
В проявлял высокую активность в течение всего эпидемического сезона в от-
личие от его появления в весеннее время в предыдущие годы [4].
При инфекции вирусами гриппа A и В качественные и количественные
отличия РНК IFN 3 типов в лимфоцитах крови больных гриппом (табл. 1 и 2)
и в клетках слизистой носоглотки [7] в первые 2 дня заболевания свидетель-
ствуют о дифференциальной индукции их экспрессии на входных воротах
инфекции, которая обеспечивает врожденную неспецифическую резистент-
ность с провоспалительными цитокинами Тh1 пути с последующим преиму-
щественно клеточным иммунным ответом. Активация экпрессии гена IFNα
на уровне транскрипции и трансляции в мононуклеарных клетках крови (табл.
1) при отсутствии РНК в смывах [7] сопровождалась синхронной ранней ин-
дукцией транскрипции РНК IFNβ и IFNγ в клетках слизистых оболочек при
полном отсутствии в клетках крови [7].
Повышенные концентрации только 7 из 37 анализируемых биомаркеров
воспаления коррелировали с элиминацией вируса без последующих аллерги-
ческих или аутоиммунных осложнений у больных гриппом. Из 7 биомаркеров
с повышенной концентрацией у больных гриппом 6 относятся к Th1 пути
(табл. 2). Для семейства TNF характерно не только увеличение продукции
собственно цитокинов APRIL и BAFF, способных к взаимодействию между
собой [20], но и двух растворимых рецепторов sTNF-R1 и sTNF-R2. Активация
цитокинов семейства TNF приводит к индукции преимущественно клеточ-
ного иммунного ответа Th1 типа, вызывает повышение проницаемости ка-
пилляров, а при избытках — повреждение эндотелия сосудов и возникновение
тромбов [5, 9]. Из двух белков семейства TNF с достоверно повышенными
концентрациями у больных гриппом APRIL при связывании с рецепторами
способен индуцировать апоптоз. Таким образом, необходимость связывания
APRIL с BAFF и со специфическими рецепторами обусловливает однона-
правленность и синхронность их регуляции [12, 20] у больных гриппом (табл.
2). Статистически значимый рост концентрации полифункцинального сиа-
лопротеина остеопонтина, как известно, обеспечивает индукцию цитокинов
семейства IL-12 и раннюю активацию лимфоцитов по Th1 пути [14].
Увеличение концентрации регуляторного противовоспалительного цито-
кина IL10 свидетельствует о своевременной регуляции воспаления и может
служить прогностическим маркером для больных гриппом. Достоверных из-
менений экспрессии генов других цитокинов Th2 пути не обнаружено.
Уменьшение концентрации комплекса гликопротеина 130 и растворимо-
го рецептора IL6 gp130/sIL-6Rβ, необходимого для активации IL6 индуци-
руемого каскада провоспалительных и противовоспалительных реакций на-
ряду с активацией Th17 иммунного ответа также свидетельствует о Th1
поляризации врожденного и адаптивного иммунитета в результате эндогенной
презентации внутриклеточных антигенов вируса гриппа в комплексе с MHCI.
Оценки КП=0,53 при гриппе позволяют количественно оценить преимуще-
ственно Th1 клеточный иммунный ответ.
Уменьшение концентрации только 1 из 3 исследованных матриксных ме-
таллопротеиназ — ММР-1, обеспечивающих регуляцию цитокиновой сети
посредством протеолитического гидролиза мембранных рецепторов [19], ве-
роятно, обусловлено завершением Th1 поляризации врожденной резистент-
ности в первые часы после заражения вирусом гриппа и индукцией вирус-
специфического преимущественно клеточного иммунитета на стадии начала
инфекционного заболевания.
Многократное преобладание количества молекул белков по сравнению с
мРНК более чем в 106 раз, вероятно, обусловлено регуляцией на стадии транс-
ляции и обеспечивает быстрое каскадное усиление биологической активности
цитокиновой сети, необходимое для подавления острой инфекции и элими-
нации вируса гриппа в течение нескольких суток.
На ранней стадии заболевания гриппом в клетках крови больных показа-
на активация экспрессии гена IFNα на стадии транскрипции и трансляции
наряду с индукцией цитокинов семейства TNF (APRIL и BAFF) и соответст-
вующих рецепторов (sTNF-R1 и sTNF-R2), а также активатора Т-лимфоцитов
— остеопонтина. Th1 поляризация врожденного иммунитета также обеспечи-
вается пониженными по сравнению с контрольной группой концентрациями
растворимого рецептора IL6 gp130/sIL-6Rβ, необходимого для индукции Th17
ответа, и металлопротеазы ММР-1, ответственной за протеолиз рецепторов
цитокинов. Своевременная регуляция цитокинов, опосредуемая IL10, обе-
спечивала восстановление пациентов без осложнений.
×
About the authors
T. P. Ospelnikova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
O. V. Morozova
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
S. A. Andreeva
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
E. I. Isaeva
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
L. V. Kolodyazhnaya
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
L. V. Kolobukhina
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
L. N. Merkulova
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
E. I. Burtseva
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
E. A. Mukasheva
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
F. I. Ershov
Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
References
- Головачева Е.Г., Афанасьева В.С., Афанасьева О.И., Осидак Л.В., Образцова Е.В., Королева Е.Г. Тип иммунного ответа как фактор тяжелого и осложненного течения гриппа. Молекулярная диагностика. 2017, 1: 248-249.
- Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях. Цитокины и воспаление. 2004, 3 (1): 3-6.
- Иванов В.В., Шипилов М.В. Провоспалительные цитокины и их значение при гриппе pH1N1. Медиц. вестник Северного Кавказа. 2012, 4: 70-72.
- Львов Д.К., Бурцева Е.И., Колобухина Л.В., Дерябин П.Г., Кириллова Е.С., Трушакова С.В. и др. Особенности эпидемического сезона 2014/2015 гг. по гриппу в разных регионах России. Инфекционные болезни. 2015, 4: 59-67.
- Недоспасов СА. Фактор некроза опухолей и лимфотоксин: молекулярная генетика, регуляция продукции и физиологическая роль. Генетика. 2003, 39 (2): 207-214.
- Новая популярная медицинская энциклопедия. Под ред. В.И.Покровского. М., Энциклопедия, 2004.
- Оспельникова Т.П., Морозова О.В., Андреева С.А., Исаева Е.И., Колодяжная Л.В., Ершов Ф.И. Цитокины при гриппе. Молекулярная диагностика. 2017, 1: 232-233.
- Руководство по вирусологии: Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Под ред. Д.К.Львова. М., Медицинское информационное агентство, 2013.
- Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма. Цитокины и воспаление. 2002, 1: 9-17.
- Фрейдлин И.С., Шейкин Ю.А. Эндотелиальные клетки в качестве мишеней и продуцентов цитокинов. Медицинская иммунология. 2001, 3 (4): 499-514.
- Biron C.A. Yet anotherrole for natural killer cells: cytotoxicity in immune regulation and viral persistence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012, 109 (6): 1814-1815.
- Bradley J.R. TNF-mediated inflammatory disease. J. Pathol. 2008, 214 (2): 149-160.
- Julkunen I., Pirhonen J., Ronni T. et al. Molecular pathogenesis of influenza A virus infection and virus-induced regulation of cytokine gene expression. Cytokine Growth Factor Rev. 2001, 12 (2-3): 171-180.
- Lund S.A., Giachelli C.M., Scatena М. The role of osteopontin in inflammatory processes. J. Cell Commun Signal. 2009, 3 (3-4): 311-322.
- Medzhitov R. Innate immunity: quo vadis? Nat. Immunol. 2010, 11 (7): 551-553.
- Ospelnikova T.P., Morozova O.V., Isaeva E.I. et al. Respiratory viruses and proinflammatory cytokines imbalance in adults and children with bronchial asthma. J. Infectious Diseases and Preventive Medicine. 2016, 4 (2): 1000138. doi: 10.4172/2329-8731.1000138.
- Seth R.B., Sun L., Chen Z.J. Antiviral innate immunity pathways. Cell. Research. 2006, 16: 141-147.
- Trinchieri G. Type interferon: friend or foe? J. Exp.Мed . 2010, 207: 2053-2063.
- Van Lint P., Libert C. Chemokine and cytokine processing by matrix metalloproteinases and its effect on leukocyte migration and inflammation. J. Leukoc Biol. 2007, 82 (6): 1375-1381.
- Wu Y., Bressette D., Carrell J.A. et al. Tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member TACI is a high affinity receptor for TNF family members APRIL and BLyS. J. Biol. Chem. 2000, 275 (45): 35478-35485.
Supplementary files
