УСКОРЕННЫЙ СПОСОБ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ НА ОСНОВЕ ИЗОТЕРМАЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ

Цель. Разработка ускоренного способа генодиагностики дифтерии на основе изотермальной амплификации для выявления ДНК возбудителя. Материалы и методы. Исследование проводилось на типовых коллекционных штаммах из «ГКПМ-Оболенск», а также на 135 штаммах С. diphtheriae, выделенных в бактериологических лабораториях субъектов РФ и присланных в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Выделение штаммов проводили по МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13. Хромосомную ДНК выделяли стандартным методом кипячения, а также с помощью трех коммерческих наборов. Детекцию результатов амплификации осуществляли в горизонтальном электрофорезе в 1,5% агарозном геле. Результаты. Установлено, что разработанный способ генодиагностики позволяет выявлять ДНК токсигенных штаммов C.diphtheriae двух биоваров, а также ДНК нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae биовара mitis с механизмами отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленными наличием делеции или мобильного генетического IS элемента в гене tox. Нетоксигенные токонесущие штаммы С. diphtheriae с механизмом отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленным наличием транспозона в гене tox, идентифицируются как нетоксигенные. Оценка аналитической чувствительности в сравнительных исследованиях при использовании трех коммерческих наборов для выделения ДНК показала, что с помощью набора «Рибо-преп» чувствительность достигала 4,5x10¹ ГЭ/мл. Показана высокая специфичность разработанного способа, которая оценивалась на 18 штаммах 16 других представителей рода Corynebacterium и 20 типовых штаммах микроорганизмов, выделенных из ротоглотки или вызывающих заболевания дыхательных путей. Апробация разработанного способа проведена в модельных экспериментах на иммитантах клинических образцов путем заражения одноразовых стерильных сухих тампонов последовательными разведениями бактериальной культуры (с параллельным высевом на плотные питательные среды) и составила 10³ ГЭ/мл. Заключение. Разработанный способ ускоренной генодиагностики дифтерийной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, специфичностью и чувствительностью, позволяет выявлять 10³ - 4,5x10 ГЭ/мл C.diphtheriae в клиническом материале с одновременной верификацией токсигенных и нетоксигенных штаммов.

дифтерия, изотермальная амплификация, диагностика