Генетическое разнообразие мутаций, влияющих на гемолитическую активность бактерий Bordetella pertussis при культивировании in vitro

Полный текст

Введение

Грамотрицательные бактерии Bordetella pertussis вызывают острое контагиозное инфекционное заболевание у человека, называемое коклюшем. В роде Bordetella принято выделять «классические» виды — B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica, а также «новые» виды — B. avium, B. petrii, B. holmesii, B. hinzii, B. trematum и B. ansorpii. В последние годы описаны ещё 3 вида: B. bronchialis, B. flabilis, B. sputigena [1].

Среди факторов вирулентности возбудителя коклюша выделяют две основные группы: токсины и адгезины. К токсинам относят коклюшный токсин, аденилатциклазный токсин (АЦТ), трахеальный цитотоксин, дермонекротический токсин, липополисахаридный эндотоксин. К адгезинам — филаментозный гемагглютинин, агглютиногены, или фимбрии 2 и 3, белок наружной мембраны пертактин, белок BrkA и другие компоненты системы секреции Bordetella III типа. Считается, что гемолизином у бактерий B. pertussis является АЦТ [2], однако в настоящее время имеются данные о влиянии белка FhaB на гемолиз эритроцитов in vitro при взаимодействии с АЦТ [3].

Важной особенностью генома бактерий рода Bordetella является наличие в хромосоме повторяющихся инсерционных последовательностей — IS-элементов [4]. Количество и разнообразие IS-элементов отличается у разных представителей рода. Максимальное число IS481 и IS1002 зарегистрировано в хромосоме B. pertussis [4]. Считается, что IS-элементы принимали участие в эволюции бактерий рода Bordetella от общего предшественника B. bronchiseptica [5].

В патогенезе коклюша особую роль играет двухкомпонентная система BvgAS, состоящая из гистидинкиназы BvgS и белка — регулятора транскрипции BvgA. Система BvgAS выступает ключевым регулятором, контролирующим процесс транскрипции генов, отвечающих за вирулентность бактерий B. pertussis [6–8]. Дополнительно система BvgAS регулирует многие внутриклеточные процессы, включая метаболизм B. pertussis и взаимодействие «микроб–хозяин» [8]. Уровень продукции и степень фосфорилирования BvgA~P определяет уровень транскрипции bvg-зависимых генов. Уровень фосфорилирования BvgA~P определяется активностью и количеством фосфокиназы BvgS, зависящей от ряда факторов, в том числе от условий культивирования. В зависимости от функционирования системы BvgAS бактерии B. pertussis могут находиться в вирулентном состоянии — I фаза (Bvg⁺), авирулентном — IV фаза (Bvg^–) или в промежуточной фазе Bvgⁱ, каждая из которых вносит вклад в патогенез коклюша, сохранение бактерий в организме человека и их передачу новому хозяину.

Несмотря на отсутствие информации о факторах, оказывающих воздействие на работу системы BvgAS в живом организме, описаны некоторые условия, изменяющие степень вирулентности бактерий B. pertussis при культивировании in vitro на плотных питательных средах [6–8]. Так, снижение температуры культивирования до 27°С, добавление в питательную среду 50 мМ сульфата магния или никотиновой кислоты способствуют переходу бактерий в авирулентную фазу.

Изменение фазового состояния бактерий B. pertussis может происходить в результате нарушения структуры оперона вирулентности bvgAS. Описаны два типа индуцированных мутаций, вызывающих изменение фенотипа B. pertussis. Первые мутанты без гемолитической активности (с отсутствием зон гемолиза на питательных средах с добавлением крови, Hly^–-мутанты) были отобраны при культивировании лабораторного вирулентного штамма B. pertussis Tohama I в присутствии эритромицина [9]. Основной фенотипической характеристикой Hly^–-мутантов было отсутствие зон гемолиза вокруг отдельных колоний, выросших на среде Борде–Жангу с добавлением крови барана. Частота выявления Hly^–-мутантов охарактеризована авторами как 10^–5–10^–6. В 1989 г. опубликована работа S. Stibitz и соавт., в которой было проведено картирование и секвенирование мутантной по гемолитической активности области B. pertussis Tohama I. Показано, что Hly^–-мутанты содержали frameshift (f.s.) мутацию, связанную с приобретением цитозина в последовательности из 6 цитозинов в гене bvgS [10]. Другой тип мутантов B. pertussis в штамме Tohama I был выделен S. Stibitz в 1998 г. [11]. Мутанты по оперону bvgAS оказались жизнеспособными в селективных условиях, характеризующихся суперпродукцией мутантного белка ВvgA, клонированного в составе плазмиды. Автором были охарактеризованы 15 инсерционных мутантов B. pertussis, выживших в указанных условиях, у 7 из которых определены соответствующие последовательности. Пять мутантов содержали IS481, 2 мутанта — IS1002 в сctagс-сайте оперона bvgAS [12]. В наших исследованиях было показано, что мутанты B. pertussis, подобные полученным в экспериментах in vitro, обнаружены у поздних реконвалесцентов коклюша, у бессимптомных носителей, контактных с больными коклюшем [13], а также при экспериментальном коклюше у низших обезьян Старого Света на поздней стадии инфекционного процесса [14].

В последние десятилетия от больных коклюшем выделены различные типы нокаутных и регуляторных мутантов по генам вирулентности fhaB, katA, prn, brkA B. pertussis, содержащих инсерции IS-элементов. Предполагается, что накопление в популяции таких мутантов B. pertussis связано с широким использованием в ряде стран бесклеточных коклюшных вакцин [15–18].

Нами предложена гипотеза, согласно которой IS-элементы принимают участие в регуляции экспрессии генов вирулентности и генов «домашнего хозяйства» возбудителя коклюша, что является одним из механизмов длительного сохранения бактерий B. pertussis и формирования персистенции в организме человека и обусловливает циркуляцию и поддержание очагов антропонозной инфекции.

Целью настоящего исследования явились поиск и характеристика спонтанных инсерционных мутантов бактерий B. pertussis по генам вирулентности bvgAS, cya и fhaB, ответственным за фенотип Hly^–, формирующихся в процессе культивирования бактерий in vitro.

Материалы и методы

В работе использованы штаммы бактерий B. pertussis из коллекции НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи: вирулентные бактерии B. pertussis 475 и изогенные им аттенуированные бактерии B. pertussis 4МKS Str^RNal^RCm^R [19]; вирулентные бактерии B. pertussis лабораторного штамма Tohama I и его авирулентные мутанты B. pertussis 347 bvgAS::Tn5 Str^RKm^R.

Бактерии B. pertussis культивировали на казеиново-угольном агаре («Медгамал») с добавлением крови барана в концентрации 15% при 35°С в течение 24–36 ч для роста культуры и в течение 72–96 ч для формирования колониеобразующих единиц (КОЕ). Подсчёт количества колоний, характеристику их размера и формы проводили визуально. Отсутствие посторонней микрофлоры контролировали с помощью световой микроскопии после окрашивания по Грамму.

Для выделения ДНК бактерий B. pertussis использовали набор для выделения ДНК-сорб-B («Амплисенс»). Для очистки продуктов амплификации — набор для выделения и очистки ДНК из агарозного геля («Евроген»).

Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ) использовали амплификатор «CFX96 Touch» («Bio-Rad»), для ПЦР — прибор фирмы «Терцик».

Последовательность нуклеотидов продуктов амплификации определяли на приборе «3130 GeneticAnalyzer» («AppliedBiosystems/Hitachi»).

Результаты

Метод регистрации интеграции IS-элементов в оперон bvgAS

Среди описанных мутаций в генах вирулентности возбудителя коклюша особого внимания, согласно нашей гипотезе, заслуживают инсерционные мутации — интеграции IS-элементов в специфический сайт оперона bvgAS B. pertussis. В предыдущих работах нами описаны метод и тест-системы для выявления мутаций в опероне bvgAS, содержащем интеграции IS-элементов 481 и 1002 в определённой, на тот момент единственной известной ориентации, которую мы условно обозначили ориентация (1) [13].

С целью выявления мутантов B. pertussis, содержащих интеграции IS-элементов 481 и 1002 с ранее не описанной противоположной ориентацией по отношению к известной ориентации (1), нами модифицирована разработанная ранее система ПЦР-РВ. Новая ориентация условно обозначена как ориентация (2).

Интеграции IS-элементов 481 и 1002 в ориентации (2) — IS481 (2) и IS1002 (2), положение праймеров и зондов схематически изображены на рис. 1. В табл. 1 представлены нуклеотидные последовательности зондов и праймеров, в том числе фланкирующих специфические сайты NctagN, расположенные в структуре генов cya и fhaB.

 

Рис. 1. Структура участка хромосомы B. pertussis, содержащего интеграцию IS481 (2) или IS1002 (2) в cctagg-сайте оперона bvgAS.

Заштрихованные стрелки показывают положение интегрированного элемента IS481 (синяя стрелка) или IS1002 (красная стрелка) в сctagg сайт оперона bvgAS (синие сплошные стрелки). Темными пятиугольниками обозначено положение праймеров, использованных для амплификации. Цветными треугольниками обозначено положение ДНК-зондов, использованных в реакции гибридизации ПЦР-РВ.

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, использованные для регистрации интеграций IS-элементов 481 и 1002 в ориентации (2) — IS481 (2) и IS1002 (2) — в гены bvgAS, cya и fhaB

Праймер/зонд	Нуклеотидная последовательность
ПЦР-РВ
Bp111	GGTCAATCGGGCATGCTTATGG
BVG300	ACGTCGAACGGAGGAATGTC
R6G481, зонд	(R6G)TCGCCGACCCCCCAGTTCACTCAAG(BHQ1)
Rox1002, зонд	(ROX)ACCACGCCATCGCAACTCAGGGCA(BHQ2)
ПЦР bvgAS::IS; ПЦР cya::IS; ПЦР fhaB::IS
CyaF	CCATGTCGAGCTGGCCCGTG
CyaR	GGCCACTTCTCGACCGTGCC
FhaB1-F	GGCTGAGCCGTTTCGACCTT
FhaB1-R	CACGGTCGTTCAGCGCAACA
SF	GTCGCTGGTGGAACTGATAG

 

Температурно-временной профиль ПЦР-РВ и ПЦР для регистрации интеграций IS481 и IS1002 в ориентации (2) и в NctagN-сайт оперона bvgAS и генов cya и fhaB представлен в табл. 2.

 

Таблица 2. Температурно-временны́е профили ПЦР-РВ и ПЦР для регистрации интеграций IS-элементов в NctagN сайт оперона bvgAS, cya и fhaB

Мишень	Праймеры/зонд	Температура, °С	Время, с	Количество циклов
ПЦР-РВ bvgAS::IS481 (2)	Bp111-BVG300/R6G481	95	300	1
		95 60	20 50	$\left.\begin{array}{r}\\ \end{array}\right\}$40
ПЦР-РВ bvgAS::IS1002 (2)	Bp111-BVG300/Rox1002	95	300	1
		95 60	20 50	$\left.\begin{array}{r}\\ \end{array}\right\}$40
ПЦР bvgAS::IS	SF-BVG300	95	300	1
		95 63 72	20 30 30	$\left.\begin{array}{r}\\ \\ \end{array}\right\}$40
ПЦР cya::IS	CyaF-CyaR	95	300	1
		95 67 72	20 30 30	$\left.\begin{array}{r}\\ \\ \end{array}\right\}$40
ПЦР fhaB::IS	FhaB1-F-FhaB1-R	95	300	1
		95 67 64	20 30 30	$\left.\begin{array}{r}\\ \\ \end{array}\right\}$40

 

Специфичность выбранных праймеров и зондов подтверждена определением нуклеотидной последовательности соответствующих продуктов амплификации. Количество геном-эквивалентов (ГЭ) ДНК B. pertussis и интеграций IS481 (1) и IS1002 (1) определяли с помощью тест-систем ПЦР-РВ (BpIS-Q) и ПЦР-РВ BpIS-INT1 [13] соответственно. Количество интеграций IS481 (2) и IS1002 (2) оценивали по значениям предельных циклов реакции. Соответствующий набор реактивов, по аналогии с набором для количественной оценки интеграций IS-элементов в ориентации (1) обозначен как BpIS-INT2. Частоту интеграций, как и прежде, рассчитывали по соотношению N_IS/N_ГЭ, где N_IS — количество интеграций, а N_ГЭ — количество ГЭ в 5 мкл раствора исследуемой ДНК.

Фенотип бактерий B. pertussis 4МKS, 475, Tohama I и Tohama 347 и молекулярно-генетическая характеристика их популяций

В рамках настоящего исследования был проведён анализ популяций бактерий лабораторного штамма B. pertussis Tohama I и его Bvg^–-мутанта B. pertussis Tohama 347, а также вирулентных бактерий B. pertussis 475 и изогенных аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS с целью выявления инсерционных мутантов в генах вирулентности bvgAS, cya и fhaA, ответственных за фенотип Hly^–, формирующийся при культивировании бактерий B. pertussis in vitro.

B. pertussis представляют собой медленно растущие, прихотливые к условиям культивирования бактерии. Для фенотипической дифференциации фазовых состояний бактерий B. pertussis при культивировании на твёрдой питательной среде с добавлением крови могут быть использованы характеристики КОЕ: размер, форма колоний и наличие зон гемолиза. Bvg⁺-колонии — выпуклые, ровные, блестящие мелкие (1–2 мм), образуют выраженные зоны гемолиза; Bvg^–-колонии — плоские, шероховатые, более крупные (2,0–2,5 мм), зон гемолиза не образуют.

КОЕ бактерий B. pertussis, выросших на казеиново-угольном агаре (КУА) с кровью, проанализированы по перечисленным параметрам. Культуру B. pertussis из ампулы высевали на чашку Петри с КУА с добавлением крови (высев), после инкубации при 35°С в течение 24–36 ч пересевали плотным штрихом на такую же чашку Петри (первый пассаж). После контроля микробиологической чистоты методом световой микроскопии осуществляли ещё один пересев (2-й пассаж). Культуру 3-го пассажа использовали для рассева ампульной культуры до отдельных колоний методом титрования (анализ ампульной культуры). Параллельно отдельные колонии 2-го пассажа, выросшие на среде КУА с кровью, анализировали по морфологии и наличию зон гемолиза. Три КОЕ каждого штамма, соответствующие критериям вирулентных бактерий B. pertussis, пересевали штрихом на свежие чашки Петри с КУА с добавлением крови, из выросшей культуры выделяли ДНК, одновременно рассевали бактерии методом титрования до формирования КОЕ на среде КУА с кровью. КОЕ анализировали по морфологии и наличию зон гемолиза (анализ культуры из отдельных КОЕ). В рамках настоящего исследования охарактеризовано 500–1000 КОЕ каждого штамма вирулентных и аттенуированных бактерий B. pertussis, выращенных из ампульной культуры и отдельных КОЕ.

Проведён фенотипический и молекулярно-биологический анализ бактерий B. pertussis, высушенных в разное время в разных лабораториях. КОЕ ампульных культур 3-го пассажа бактерий B. pertussis 4МKS и B. pertussis 475 в подавляющем большинстве содержали бактерии в вирулентной Bvg⁺-фазе, интеграции IS-элементов в опероне bvgAS регистрировали в ПЦР-РВ с низкой частотой — менее 10^–4 на одну бактериальную клетку. В рассевах ампульных культур все выросшие колонии имели фенотип Bvg⁺.

В отдельных случаях в бактериях B. pertussis 4МKS из 3-го пассажа ампульной культуры, высушенной более 4 лет назад, суммарная частота инсерционных мутантов в обеих ориентациях составила (2–5) × 10^–2 (табл. 3). При рассеве регистрировали около 2–3% Hly^–-КОЕ. Колонии имели плоскую и шероховатую форму и размер 2,0–2,5 мм, Hly⁺-колонии — 1–2 мм.

 

Таблица 3. Доля Hly^–-колоний и регистрация событий интеграции IS-элементов в опероне bvgAS бактерий B. pertussis 475, B. pertussis 4МKS и B. pertussis Tohama I при их культивировании на среде КУА с кровью

Штамм	Ампульная культура		Культура из КОЕ
	Hly–,%	bvgAS ::IS*	Hly–, %	bvgAS ::IS*
B. pertussis 475	НО	5 × 10–5	НО	3 × 10–5
B. pertussis 4МKS	2	(2–5) × 10–2	НО	2 × 10–4
B. pertussis Tohama I	95	4 × 10–2	НО	5 × 10–4
B. pertussis Tohama 347	100	≤ 10–6	100	≤ 10–6

Примечание. *Приведена суммарная частота интеграции по всем IS-элементам. Для ПЦР использована ДНК, выделенная из 3-го пересева ампульной культуры или КОЕ; НО — не обнаружено.

 

Схожие результаты были получены при исследовании ампульных культур B. pertussis Tohama I. Частота интеграций IS481 (1) в опероне bvgAS, зарегистрированная с помощью ПЦР-РВ, составила от 10^–4 на бактерию до нескольких процентов. Интеграций других IS-элементов в бактериях B. pertussis Tohama I не обнаружено. Максимальное количество КОЕ, не образующих зон гемолиза, достигавшее 95% от общего числа колоний, выявлено при рассеве бактерий высушенных 13.04.1974 (30 лет назад). При этом частота интеграций IS-элементов в опероне bvgAS составила 4 × 10^–2 на бактерию (табл. 3).

КОЕ штамма B. pertussis Tohama 347 bvgAS::Tn5 ожидаемо не образовывали зон гемолиза, размер и форма колоний соответствовали фенотипу Bvg^–. Частота интеграций во всех проанализированных с помощью ПЦР-РВ культурах B. pertussis Tohama 347 составила меньше 10^–6 на бактерию.

Такое же исследование было проведено с культурами, выращенными из отдельных Hly⁺-колоний B. pertussis 475, B. pertussis 4МKS и B. pertussis Tohama I. При рассеве бактерий каждого штамма из отдельных колоний на среде КУА с добавлением крови из 10³ КОЕ не было обнаружено колоний, не образующих зон гемолиза. Размер и форма колоний соответствовали описанному выше фенотипу Bvg⁺. Частота интеграций IS-элементов в опероне bvgAS не превышала 10^–4–10^–5 на бактерию.

Колонии Hly^–-штаммов B. pertussis 4МKS и B. pertussis Tohama I выборочно были подвергнуты дальнейшему анализу. По 46 колоний каждого штамма перенесли на чашки Петри с КУА с добавлением крови и антибиотиками для проверки их устойчивости к антибиотикам и способности к гемолизу. В результате все отдельные колонии B. pertussis 4МKS были устойчивы к стрептомицину, налидиксовой кислоте и хлорамфениколу, а бактерии B. pertussis Tohama I были чувствительны ко всем проверенным антибиотикам. Выявленная устойчивость к антибиотикам полностью соответствует характеристикам родительских штаммов B. pertussis 4МKS и B. pertussis Tohama I. КОЕ обоих штаммов сохраняли выраженный фенотип Hly^– в репликах.

В ПЦР с праймерами S_F-BVG300 в ДНК, выделенной из рассева 3-го пассажа ампульных культур и КОЕ тестируемых штаммов, не зарегистрировано фрагментов большого размера, несмотря на наличие у части бактерий в популяции интеграции IS-элемента. Отсутствие продуктов амплификации со вставкой обусловлено значительно более низкой эффективностью амплификации больших фрагментов в сравнении с маленькими фрагментами без вставки.

Таким образом, в культурах проанализированных штаммов вирулентных и аттенуированных бактерий B. pertussis, выращенных из ампульных культур, с разной частотой регистрируются Hly^–-мутанты, не обладающие гемолитической активностью и содержащие интеграции IS-элементов в опероне bvgAS. Культура, выращенная из отдельных колоний бактерий, гомогенна и содержит инсерционные мутанты с частотой меньше 10^–4 на бактерию. Популяции бактерий, выращенные из отдельных колоний, содержат негемолизирующие колонии бактерий фенотипа Hly^– в количестве, недостаточном для фенотипического анализа.

Молекулярно-генетическая характеристика Hly^–-мутантов B. pertussis 4МKS и Tohama I

Из 40 реплик каждого штамма B. pertussis 4МKS и B. pertussis Tohama I, с Hly^–-фенотипом была выделена ДНК. Полученные образцы проанализировали с помощью ПЦР с праймерами S_F-BVG300, FhaB1-F-FhaB1-R и CyaF-CyaR.

Размер продуктов амплификации с праймерами S_F-BVG300 исследованных Hly^–-мутантов B. pertussis 4МKS в 25% (10 клонов) составил около 1300 пар нуклеотидов (п. н.), а в 75% (30 клонов) — около 300 п. н.

В табл. 4 представлены результаты анализа продуктов ПЦР некоторых Hly^–-клонов B. pertussis 4МKS с праймерами S_F-BVG300, FhaB1-F-FhaB1-R и CyaF-CyaR.

 

Таблица 4. Результаты ПЦР-анализа ДНК клонов B. pertussis 4МKS с фенотипом Hly^– (выборочно)

Номер клона на матрицах штампов	Гены, типы мутаций
	bvgАS::IS	fhaВ::IS	cya::IS
2	IS481 (2)*	НО*	НО
3	IS481 (2)*	НО	НО
49	IS481 (2)*	НО	НО
48	IS481 (2)*	НО	НО
22	IS481 (2)*	НО	НО
9	IS1002 (1)*	НО	НО
10	IS1002 (1)*	НО	НО
32	IS1002 (1) *	НО	НО
34	IS1002 (1) *	НО	НО
43	IS1002 (1) *	НО	НО
31	НО*	IS481 (1)*	НО
33	∆TG*	НО	НО
3-2	НО	IS481 (1) *	НО
32-2	НО*	НО*	НО
15-2	НО*	НО	НО
17-2	НО*	НО	НО
28-2	НО	IS481 (1) *	НО

Примечание. *Структура подтверждена секвенированием. НО — интеграции методом ПЦР не обнаружено.

 

Ни в одном из клонов не выявлено интеграции в гене cya, тогда как в гене fhaВ интеграция зарегистрирована у 26 из 30 Hly^–-мутантов B. pertussis 4МKS, не содержащих интеграции IS-элементов в опероне bvgAS. Для 3 Hly^–-мутантов определена последовательность нуклеотидов продуктов амплификации фрагмента гена fhaВ размером 1300 п. н. Во всех случаях обнаружена интеграция IS481 (1) в специфическом сайте fhaВ.

У клона № 33, не содержащего интеграции в генах bvgАS или fhaВ, выявлена делеция 2 нуклеотидов вблизи от сайта сctagc в гене bvgS (рис. 2). В 3 Hly^–-клонах (№ 32-2, 15-2 и 17-2) не выявлено интеграций IS-элементов и других нарушений последовательности нуклеотидов проанализированных ампликонов.

 

Рис. 2. Фрагмент последовательности оперона bvgАS дикого типа B. pertussis (а) и Hly^–-мутанта B. pertussis № 33 (б).

Заглавными буквами представлены нуклеотидные последовательности оперона bvgАS; ATG — метиониновый кодон гена bvgS; tg — делеция; CCTAGC — специфический сайт интеграции IS-элементов.

 

Из 10 инсерционных Hly^–-ВvgАS мутантов с определённой нуклеотидной последовательностью 5 содержат инсерцию IS481 (2), 5 мутантов — IS1002 (1). На рис. 3 приведён фрагмент последовательности, содержащей IS481 (2) в специфическом сайте оперона bvgAS.

 

Рис. 3. Фрагменты последовательности оперона bvgAS Hly^–-мутанта B. pertussis 4МKS, клон 49 (а) и инсерционного мутанта B. pertussis с интеграцией IS481 в вырожденный сайт cctaас, расположенный перед стартом транскрипции гена bteA (б) [16].

Заглавными буквами обозначена последовательность оперона bvgAS, подчёркнут специфический сайт интеграции CCTAGC; курсивом выделена последовательность гена bteA, подчёркнут специфически вырожденный сайт интеграции cctaас; стартовые кодоны метионина белков ВvgS и ВteA выделены жирным шрифтом; строчными буквами обозначена последовательность 3’-конца IS481(1); жирной заглавной буквой Т — предполагаемый старт транскрипции.

 

Среди проанализированных Hly^–-клонов не выявлено интеграций IS1002 (2) и IS481 (1), тогда как соответствующие интеграции регистрируются в популяции при её анализе с помощью ПЦР-РВ.

Продукты ПЦР 40 проанализированных Hly^–-мутантов B. pertussis Tohama I с использованием пар праймеров S_F-BVG300, FhaB1-F-FhaB1-R и CyaF-CyaR имели близкий к расчётному размер — около 300, 388 и 261 п. н. соответственно. Определение последовательности нуклеотидов 3 ампликонов: bvgAS, cya и fhaB подтвердило отсутствие в них интеграций IS-элементов и не выявило нарушений их структуры по сравнению с нативной.

С учётом наличия интеграций IS-элементов в опероне bvgAS в 4% популяции бактерий B. pertussis Tohama I и их отсутствия в ДНК бактерий с фенотипом Hly^– нами предпринят поиск интеграций IS-элементов в оперон bvgAS у бактерий с фенотипом Hly⁺. ПЦР с праймерами S_F-BVG300 ДНК, выделенной из 12 КОЕ с фенотипом Hly⁺, обнаружил в 5 (41,7%) КОЕ продукты размером около 1300 п. н., предположительно содержащие инсерцию IS-элемента в анализируемом сайте. Методом ПЦР-РВ установлено, что все они содержат интеграцию IS481 (1) в оперон bvgAS. Определение последовательности продуктов ПЦР S_F-BVG300 размером 1300 п. н. у 3 из них подтвердил наличие инсерции IS481 (1) и сохранение нативной последовательности вокруг сайта интеграции.

Таким образом, появление бактерий B. pertussis с фенотипом Hly^– при культивировании на плотной питательной среде обусловлено не только известными ранее мутациями сдвига рамки считывания в bvgS, делециями и вставками в гене bvgА, интеграцией IS481 (2) и IS1002 (1) в межгенное пространство оперона bvgAS или делециями в гене bvgS, которые были обнаружены в данном исследовании, но и вновь выявленными вставками IS-элементов в ген fhaВ. Перемещение IS481 (1) в cctagc сайт оперона bvgAS B. pertussis Tohama I не приводит к формированию выраженного Hly^–-фенотипа бактерий. ПЦР-анализ фрагментов генов вирулентности bvgAS, cya и fhaB, содержащих специфические сайты NctagcN, не выявил видимых изменений структуры анализируемых участков генов у Hly^–-мутантов B. pertussis Tohama I.

Обсуждение

В наших предшествующих работах показано, что популяция вирулентных бактерий B. pertussis, культивируемых на твёрдой среде КУА, не является однородной, в ней присутствовала определённая доля мутантов, характеризующихся вставками IS-элементов в специфическом сайте оперона bvgAS. Такие мутанты были описаны не только нами, но и получены и охарактеризованы в селективных условиях S. Stibitz и соавт. В наших исследованиях инсерционные ВvgAS-мутанты обнаружены у реконвалесцентов и контактных по коклюшу лиц, у экспериментальных животных на поздних стадиях коклюшной инфекции. Используемая в экспериментах разработанная нами ранее тест-система ПЦР-РВ позволяла учитывать события интеграции IS1002 и IS481 только в одной ориентации, названной нами (1). Мы предположили, что IS-элементы способны перемещаться и интегрироваться в специфический сайт оперона bvgAS и в обратной ориентации (2). Поэтому в настоящей работе предпринята разработка метода, позволяющего выявлять события интеграции IS-элементов в оперон bvgAS в ориентации (2) и регистрация соответствующих инсерционных мутантов B. pertussis при культивировании in vitro.

Для проведения ПЦР и регистрации продуктов амплификации, возникающих в результате интеграции IS-элементов в обеих ориентациях, использованы одни и те же праймеры и зонды, комплементарные последовательностям IS-элементов, но в парах с праймером S_F для ориентации (1) и с BVG300 для ориентации (2) (рис. 1). Для оценки количества интеграций в ориентации (2) в рамках настоящей работы использовали значения предельных циклов реакций, а не калибровочные кривые, как в предыдущих экспериментах, что несколько уменьшает точность количественного определения интеграций.

В независимых экспериментах при рассеве бактерий всех штаммов, выращенных из КОЕ, за исключением B. pertussis Tohama 347, частота выявления событий интеграции с помощью ПЦР-РВ существенно не отличалась от определённой нами ранее и составила 10^–4–10^–5 на бактерию.

В настоящем исследовании нами проанализированы культуры B. pertussis 4МKS и B. pertussis 475, высушенные в разное время в нашей лаборатории, а также культуры B. pertussis 475, полученные в разное время из разных источников, в том числе из коллекции ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Во всех ампульных культурах были выявлены интеграции IS-элементов как в ориентации (1), так и ориентации (2). В ходе анализа 16 препаратов в 7 из них интеграция IS1002 в оперон bvgAS отсутствовала либо в одной, либо в обеих исследованных ориентациях. Интеграция IS481 присутствовала в опероне bvgAS в ориентации (1) в 75% случаев и в ориентации (2) в 25% случаев. Только в одной ампульной культуре штамма B. pertussis 475 интеграция IS 481 не была зарегистрирована. В 25% случаев не выявлено интеграции IS1002 (1), а в 3 (16%) образцах не выявлено интеграций как IS1002 (1), так и IS 1002 (2). Таким образом, частота регистрации IS-элементов в опероне bvgAS двух изогенных штаммов снижается в последовательностях IS481 (1), IS481 (2), IS1002 (1) и IS1002 (2). Достоверность и значимость выявленных закономерностей для других штаммов бактерий B. pertussis предстоит выяснить в последующих исследованиях.

Среди проанализированных Hly^–-клонов ампульных культур B. pertussis 4МKS не выявлено интеграций IS1002 (2) и IS481 (1) (табл. 4), в то время как они регистрируются методом ПЦР-РВ в общей популяции B. pertussis 4МKS. Предположительно, такие инсерционные мутанты находятся среди бактерий с фенотипом Hly⁺. Анализ 10 отпечатков КОЕ, формирующих зоны гемолиза, не выявил изменений в размере соответствующего ампликона, что указывает на невысокий процент возможных инсерционных мутантов в популяции Hly⁺-клонов. Результаты ПЦР-РВ анализа бактериальной популяции, включающей изученные Hly^–- и Hly⁺-клоны, подтверждают данное заключение: частота обнаружения интеграций IS1002 (2) и IS481 (1) в 10 раз ниже, чем IS1002 (1) и IS481 (2), регистрируемых с частотой около 10^–2 на бактерию. Однако поиск интегрантов, не имеющих фенотипических признаков, с ожидаемой частотой меньше 10^–3 на бактерию представляется затруднительным. По этой причине Hly⁺-клоны с возможными интеграциями IS1002 (2) и IS481 (1) остались за рамками настоящего исследования.

В популяции бактерий B. pertussis Tohama I в опероне bvgAS выявлена интеграция только IS481 (1) и не обнаружено интеграций IS1002. При рассевах тестируемых культур, выращенных из КОЕ, не выявлено колоний с фенотипом Hly^– на среде КУА с кровью, что согласуется с частотой выявления событий интеграции методом ПЦР-РВ. Факт интеграции преимущественно IS481 (1) в специфический сайт оперона bvgAS бактерий B. pertussis Tohama I, как и разная частота при интеграции IS481 и IS1002 у изогенных вариантов штамма B. pertussis 475, требует дальнейшего изучения и может быть связана с особенностью перемещения IS-элементов у разных штаммов.

Частота интеграций IS481 в культуре бактерий B. pertussis Tohama 347, выращенных из ампулы и КОЕ, примерно в 100 раз ниже (10^–6–10^–7 на бактерию), чем у изогенных вирулентных бактерий B. pertussis Tohama I. Этот факт был отмечен нами в предшествующих исследованиях [20, 21]. Анализ продукта амплификации ДНК B. pertussis Tohama 347 с праймерами S_F-BVG300 показал, что инсерция Tn5 в опероне bvgAS расположена вне анализируемого фрагмента оперона вирулентности и, вероятно, не способна препятствовать перемещению IS-элементов в анализируемый сайт. Это обстоятельство указывает на зависимость частоты транспозиции от целостности оперона bvgAS. Следует отметить, что нам не удалось зарегистрировать зависимость частоты транспозиции IS-элементов в оперон bvgAS от модулирующих условий при культивировании бактерий B. pertussis Tohama I, 4МKS и 475 в присутствии MgSO₄ и пониженной температуры. С одной стороны, данное наблюдение не подтверждает зависимости транспозиции от модулирующих условий, а с другой, учитывая выявленное снижение частоты интеграций у B. pertussis Tohama 347, можно предположить, что белки Bvg A и Bvg S не принимают непосредственного участия в регуляции транспозиции. Полученный эмпирический результат требует дальнейшего изучения.

Обнаруженные нами с высокой частотой инсерционные мутанты B. pertussis в некоторых ампульных культурах свидетельствуют о выраженной зависимости частоты транспозиции от условий культивирования бактерий, в том числе, вероятно, и в организме хозяина. Возможно, этим обстоятельством обусловлена нестабильность получения мутантов сдвига рамки и их ревертантов, отмеченная A. Weiss и соавт. [9].

Таким образом, представленные результаты показывают, что предложенные нами тест-системы ПЦР-РВ позволяют регистрировать события интеграции IS-элементов в обеих ориентациях в оперон bvgAS. Частота их транспозиции зависит от генотипа, в том числе от целостности оперона вирулентности, и условий культивирования бактерий.

Анализ структуры фрагментов генов вирулентности bvgAS, cya и fhaB Hly^–-мутантов показал, что они содержат интеграцию IS481 (2) или IS1002 (1) в специфическом сctagc сайте оперона bvgAS (B. pertussis 4МKS), либо IS481 (1) в аналогичном сайте fhaВ (B. pertussis Tohama I). Обнаружены также 4 Hly^–-мутанта, хромосома которых не имеет инсерций в тестированных фрагментах генов вирулентности. В гене bvgS одного из них обнаружена делеция 2 нуклеотидов, нарушающая экспрессию фосфокиназы Вvg S, участвующей в регуляции большого количества генов возбудителя коклюша, в том числе всех генов вирулентности. В 3 из 4 Hly^–-мутантов использованные методы не выявили нарушений в структуре генов bvgAS или fhaB. Ни в одном из проанализированных клонов не было интеграций в гене cya. Вероятно, что эти 3 мутанта содержат охарактеризованные S. Stibitz инсерции IS-элементов в гене bvgА или другие, например, f.s.-мутации в гене bvgS, не выявленные нами с помощью использованных методов.

Наличие интеграции одного из IS-элементов в межгенное пространство оперона bvgAS, блокирующей транскрипцию гена bvgS, представляется вполне ожидаемой причиной формирования фенотипа Hly^–-мутантов B. pertussis 4МKS. Однако существует несколько примеров интеграции IS481 в специфический сайт, расположенный up streem генов brkA, kat, bvgS, fim, как минимум не сопровождающихся прекращением их экспрессии [16, 18, 20, 22]. В одной из работ не только сформулировано предположение, что транскрипция с промотора, расположенного на конце IS481, регулирует экспрессию продукта гена brkA, но и определено начало соответствующего транскрипта (рис. 2). Выявленный авторами промотор расположен на том же конце IS481 (2) в геноме клона 49 B. pertussis 4МKS, но, по-видимому, не обеспечивает достаточный уровень транскрипции гена bvg S, в результате чего формируется фенотип Hly^–-клона 49 (рис. 2). Можно предположить, что нарушение транскрипции гена bvg S у мутантов, содержащих инсерцию IS1002 (1), происходит по такому же механизму или в результате полного её прекращения. Отсутствие экспериментальных данных о наличии промоторов в структуре IS1002 пока не позволяет сделать окончательный вывод. По-видимому, подобным образом, инсерция IS481 обеспечивает транскрипцию гена bvg S и дифференциальную экспрессию генов вирулентности отобранных S. Stibitz мутантов, проявляющуюся в сохранении, но значительном снижении экспрессии генов ptx и менее выраженном снижении fha [20]. Интересный случай регуляции транскрипции рассмотрен A. D’Halluina и соавт. [22]. Показана регуляция транскрипции/трансляции гена fim2 в результате синтеза антисмысловой РНК с внутреннего промотора IS481, интегрированного выше гена fim2. Предполагается, что описанные изменения регуляции генов вирулентности B. pertussis, в особенности оперона bvgAS, могут быть одним из «пусковых» механизмов формирования персистенции бактерий B. pertussis в организме единственного хозяина — человека. Или могут повышать жизнеспособность бактерий вне организма, облегчая передачу инфекции новому восприимчивому организму.

Во всех Hly^–-мутантах, содержащих инсерцию в гене fhaB, была обнаружена интеграция IS481 (1). Поскольку интеграции расположены в кодирующей последовательности гена fhaB, они нарушают его транскрипцию и трансляцию, независимо от направления интеграции IS-элемента. Если взаимосвязь мутаций в опероне bvgAS с Hly^–-фенотипом представляется очевидной, то влияние нокаутной мутации в гене fhaВ на гемолитическую активность B. pertussis требует дальнейшего изучения. Согласно современным представлениям, белок FhaВ не имеет прямого отношения к реакции гемолиза эритроцитов крови. Эта функция приписывается АЦТ, точнее его С-концевому участку. Однако последние данные говорят о том, что белок FhaВ взаимодействует с АЦТ. Скорее всего, гемолитическая активность АЦТ in vitro реализуется после взаимодействия с филаментозным гемагглютинином на поверхности бактериальной клетки и доставки АЦТ в эукариотическую клетку [3].

Обращает на себя внимание факт отсутствия описанных инсерционных мутантов bvgAS::IS481 или bvgAS::IS1002 среди бактерий, выделенных от больных коклюшем, тогда как клинические изоляты, содержащие инсерции IS-элементов в генах fhaB, prn и участвующие в регуляции katА и brkA, описаны в литературе [16, 18, 20, 22]. В наших экспериментах такие мутантные бактерии bvgAS::IS481 (1) были зарегистрированы в популяциях бактерий B. pertussis, персистирующих в организме реконвалесцентов коклюша и бессимптомных бактерионосителей. Можно предположить, что такое состояние возбудителя коклюша является оптимальным для персистенции в организме человека и выживания во внешней среде, а при попадании в восприимчивый организм происходят точное исключение IS-элемента (или инверсия), восстановление вирулентности бактерий, инфицирование организма и развитие заболевания. Похожую роль бактериям в состоянии пониженной вирулентности отводят M.R. Farman и соавт., изучившие профили транскрипции большой группы генов в бактериях B. pertussis внутри макрофагов [23]. Доказанное нами существование (накопление) инсерционных Вvg^–-мутантов B. pertussis на поздних стадиях инфекции указывает на регуляторную роль интеграций IS-элементов в формировании персистирующих бактерий в организме человека и, возможно, на их участие в передаче бактерий новому хозяину. Можно ожидать, что точное исключение IS-элемента из оперона вирулентности восстанавливает его структуру и способность бактерий вызывать заболевание. Остаются невыясненными механизмы и условия, вызывающие обычно редкие события точного исключения. Неясно также, на каком этапе персистенции или трансмиссии патогена оно происходит. Способность IS-элемента к точному исключению показана нами ранее на модели Escherichia coli [21, 24].

Неожиданными представляются результаты анализа Hly^–-мутантов B. pertussis Tohama I, зарегистрированных нами примерно в 95% проанализированных отдельных колоний, выращенных при рассеве одной из серий лиофилизированных культур из музея НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Среди 40 Hly^–-колоний не обнаружено мутантов B. pertussis, содержащих интеграции в специфической последовательности NctagN в генах bvgAS, cya и fhaB. В настоящее время мутации, ответственные за формирование генотипа выделенных нами Hlу^–-клонов B. pertussis Tohama I, не установлены. Вполне вероятно, что они, как и 3 неустановленные мутации Hly^–-клонов B. pertussis 4МKS, относятся к классу мутаций сдвига рамки считывания в гене bvgS, инсерциям в специфический сайт bvg A или содержат другие не идентифицированные нами нарушения в структуре оперона bvgAS, генов fhaВ или cya.

Отсутствие интеграций в сайте сctagg оперона bvgAS проанализированных Hly^–-колоний на фоне их достоверной регистрации методом ПЦР в популяции перед её рассевом (до 4% интеграций IS481 (1)) позволило предположить, что интеграции в соответствующем сайте могут присутствовать в геноме некоторых бактерий, сохранивших гемолитическую активность (с фенотипом Hly⁺). Действительно, среди бактерий фенотипа Hly⁺ были обнаружены 41,7% инсерционных мутантов, содержащих IS481 (1) в опероне bvgAS при сохранении нативной последовательности оперона вокруг сайта интеграции. Учитывая проведённый выше анализ и ориентации IS481, можно ожидать, что эффективный промотор, обеспечивающий транскрипцию гена bvgS и Hly⁺-фенотип у инсерционных мутантов B. pertussis, расположен на конце элемента IS481, противоположном описанному H. Han и соавт. [18] и в работе S. Stibitz, показавшем дифференциальное снижение экспрессии генов fhaВ и ptx и менее выраженные зоны гемолиза у КОЕ бактерий инсерционного мутанта B. pertussis [12].

Для более детальной характеристики мутанта bvgAS::IS481 (1) Hly⁺-фенотипа нами запланировано сравнительное изучение токсической активности коклюшного и дермонекротического токсинов, титров агглютинации и электронно-микроскопический анализ морфологии и структуры бактерий B. pertussis Tohama I и их мутантного генотипа, биоинформационный анализ последовательности IS481, направленный на идентификацию и сравнение предполагаемых промоторов, расположенных на концах IS-элементов.

Таким образом, при культивировании in vitro бактерий B. pertussis в опероне bvgAS чаще других регистрируются интеграции IS481 (1), которые ранее мы выявили в геномах бактерий B. pertussis, выделенных у реконвалесцентов коклюша и у экспериментальных животных. Прежние данные по анализу событий интеграции IS-элементов в одной ориентации (1) в значительной мере отражают динамику накопления всех инсерционных мутантов bvgAS::IS у бактерий B. pertussis.

Заключение

Полученные данные дают возможность сделать ряд значимых выводов, касающихся характеристик IS-элементов B. pertussis:

• IS-элементы способны перемещаться между специфическими сайтами на хромосоме pertussis, вызывая инактивацию генов или изменение регуляции их транскрипции при культивировании бактерий in vitro;
• частота перемещения IS-элементов и типы индуцируемых ими спонтанных мутаций зависят от генотипа и условий культивирования бактерий pertussis;
• факторы, влияющие на частоту перемещения IS-элементов, формирования спонтанных, инсерционных или иных мутантов, индуцированных IS-элементами, требуют дальнейшего изучения;
• в процессе культивирования и хранения бактерий pertussis могут возникать условия, индуцирующие формирование популяции гетерогенной по структуре генов вирулентности fhaВ, bvgАS и, вероятно, других генов вирулентности бактерий;
• перемещение IS-элементов в специфический сайт межгенного пространства оперона bvgAS приводит к изменению регуляции генов вирулентности и других bvg-зависимых генов, возможно, обеспечивая длительную персистенцию бактерий pertussis в организме хозяина.

Об авторах

Сергей Вячеславович Куликов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: stromdang@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7478-3624

м. н. с. лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

Россия, Москва

Алиса Юрьевна Медкова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Автор, ответственный за переписку.
Email: baburida@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1509-0622

канд. мед. наук, с. н. с. лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

Россия, Москва

Матвей Андреевич Локтев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: m_loktev00@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-5128-7681

лаборант-исследователь лаб. генетики бактерий

Россия, Москва

Людмила Николаевна Синяшина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: vasilissa7777@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1708-5453

д-р мед. наук, в. н. с. лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

Россия, Москва

Геннадий Иванович Каратаев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: karataevgi@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8771-6092

д-р биол. наук, в. н. с., руководитель лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы