Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1890610.36233/0372-9311-734OVPBTAORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleGenetic diversity of mutations affecting the hemolytic activity of Bordetella pertussis bacteria during in vitro cultivationГенетическое разнообразие мутаций, влияющих на гемолитическую активность бактерий Bordetella pertussis при культивировании in vitrohttps://orcid.org/0000-0001-7478-3624KulikovSergey V.КуликовСергей Вячеславович
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

м. н. с. лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

stromdang@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1509-0622MedkovaAlisa Yu.МедковаАлиса Юрьевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

канд. мед. наук, с. н. с. лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

baburida@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0002-5128-7681LoktevMatvej A.ЛоктевМатвей Андреевич
Russian Federation

research assistant, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

лаборант-исследователь лаб. генетики бактерий

m_loktev00@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1708-5453SinyashinaLyudmila N.СиняшинаЛюдмила Николаевна
Russian Federation

Dr. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

д-р мед. наук, в. н. с. лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

vasilissa7777@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8771-6092KarataevGennady I.КаратаевГеннадий Иванович
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), leading researcher, Head, Laboratory of bacterial genetics, Department of medical microbiology

д-р биол. наук, в. н. с., руководитель лаб. генетики бактерий отдела медицинской микробиологии

karataevgi@rambler.ruN.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and MicrobiologyНациональный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеиruen051120252025102559260405082025Received:05082025Published:05112025Copyright ©; 2025, Kulikov S.V., Medkova A.Y., Loktev M.A., Sinyashina L.N., Karataev G.I.Copyright ©; 2025, Куликов С.В., Медкова А.Ю., Локтев М.А., Синяшина Л.Н., Каратаев Г.И.2025Kulikov S.V., Medkova A.Y., Loktev M.A., Sinyashina L.N., Karataev G.I.Куликов С.В., Медкова А.Ю., Локтев М.А., Синяшина Л.Н., Каратаев Г.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18906

Introduction. The two-component BvgAS system regulates the transcription of the pathogen's virulence genes and plays a key role in the pathogenesis of whooping cough, an anthroponotic infectious disease. Currently, the factors affecting the BvgAS system of Bordetella pertussis bacteria in the human organism have not been studied in practice. It is known that disruption of the bvgAS operon structure leads to phase modulations and changes in virulence. IS-elements intergation into the bvgAS operon and other virulence genes of B. pertussis bacteria is important mechanism in regulating their expression, potentially leading to the long-term persistence of this pathogen in the human body.

Aim. Identification and description of spontaneous IS-elements insertions in B. pertussis into bvgAS, cya and fhaB virulence genes responsible for hemolytic activity during in vitro bacterial cultivation.

Materials and methods. B. pertussis strains from the collection of the N. F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology were used: virulent B. pertussis 475 strain and its isogenic attenuated strain B. pertussis 4MKS; virulent B. pertussis strain Tohama I and its avirulent mutant B. pertussis 347. Bacteria were cultivated on casein-charcoal agar with blood addition. The formation of haemolysis zones was assessed visually. PCR, real-time PCR and sequencing were used for the genetic characterization of the obtained insertion mutants.

Results. B. pertussis mutants containing insertions of IS-elements in fhaB and bvgAS genes with impaired hemolytic activity (Hly– phenotype) have been isolated in vitro, as well as B. pertussis mutants that retained hemolytic activity (Hly+ phenotype), containing IS-elements in a previously undescribed orientation in the bvgAS gene. The frequency of insertional mutant formation depended on conditions of cultivation and bacteria genotype.

Conclusion. Arguments are made for the hypotheses about the IS-elements involvement in B. pertussis bacteria transition to a state of reduced virulence, which provides the possibility of long-term persistence of this pathogen in the human body.

Введение. Ключевую роль в патогенезе коклюша, антропонозного инфекционного заболевания, играет двухкомпонентная система BvgAS, регулирующая транскрипцию генов вирулентности возбудителя. Факторы, оказывающие воздействие на работу системы BvgAS бактерий Bordetella pertussis в организме человека, практически не изучены. Известно, что нарушение структуры оперона bvgAS приводит к фазовым переходам и изменению вирулентности. Перемещение IS-элементов в оперон bvgAS и другие гены вирулентности возбудителя коклюша является важным механизмом в регуляции их экспрессии, потенциально приводящим к длительной персистенции бактерий в организме человека.

Цель работы — поиск и характеристика спонтанных инсерционных мутантов бактерий B. pertussis по генам вирулентности bvgAS, cya и fhaB, ответственным за гемолитическую активность при культивировании бактерий in vitro.

Материалы и методы. Использованы штаммы B. pertussis из коллекции НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи: вирулентный штамм B. pertussis 475 и изогенный ему аттенуированный штамм B. pertussis 4МKS, вирулентный штамм B. pertussis Tohama I и его авирулентный мутант B. pertussis 347. Бактерии культивировали на казеиново-угольном агаре с добавлением крови. Формирование зон гемолиза оценивали визуально. Для молекулярно-генетической характеристики полученных инсерционных мутантов использовали методы ПЦР, ПЦР-РВ, секвенирования.

Результаты. In vitro выделены мутанты B. pertussis с нарушенной гемолитической активностью (фенотип Hly–) c инсерциями IS-элементов в генах fhaB и bvgAS, а также мутанты, сохранившие гемолитическую активность (фенотип Hly+), содержащие IS-элементы в ранее не описанной ориентации в гене bvgAS. Частота образования инсерционных мутантов зависела от условий культивирования и генотипа бактерий.

Заключение. Приведены аргументы, свидетельствующие о возможной роли IS-элементов в переходе бактерий B. pertussis в состояние пониженной вирулентности, что обеспечивает длительную персистенцию возбудителя коклюша в организме человека.

Bordetella pertussisIS-elementsregulation of transcriptionvirulencepersistencehemolytic activityHly– phenotypeBordetella pertussisIS-элементырегуляция транскрипциивирулентностьперсистенциягемолитическая активностьHly–-фенотипVandamme P.A., Peeters C., Cnockaert M., et al. Bordetella bronchialis sp. nov., Bordetella flabilis sp. nov. and Bordetella sputigena sp. nov., isolated from human respiratory specimens, and reclassification of Achromobacter sediminum Zhang et al. 2014 as Verticia sediminum gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015;65(10):3674–82. DOI: https://doi.org/10.1099/ijsem.0.000473Guiso N. Bordetella adenylate cyclase-hemolysin toxins. Toxins (Basel). 2017;9(9):277. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins9090277Nash Z.M., Inatsuka C.S., Cotter P.A., et al. Bordetella filamentous hemagglutinin and adenylate cyclase toxin interactions on the bacterial surface are consistent with FhaB-mediated delivery of ACT to phagocytic cells. mBio. 2024;15(5):e0063224. DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00632-24Parkhill J., Sebaihia M., Preston A., et al. Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Nat. Genet. 2003;35(1):32–40. DOI: https://doi.org/10.1038/ng1227Weigand M.R., Peng Y., Loparev V., et al. The history of Bordetella pertussis genome evolution includes structural rearrangement. J. Bacteriol. 2017;199(8):e00806–16. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.00806-16Chen Q., Stibitz S. The BvgASR virulence regulon of Bordetella pertussis. Curr. Opin. Microbiol. 2019;47:74–81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.01.002Boulanger A., Chen Q., Hinton D.M., et al. In vivo phosphorylation dynamics of the Bordetella pertussis virulence-controlling response regulator BvgA. Mol. Microbiol. 2013;88(1):156–72. DOI: https://doi.org/10.1111/mmi.12177Belcher T., Dubois V., Rivera-Millot A., et al. Pathogenicity and virulence of Bordetella pertussis and its adaptation to its strictly human host. Virulence. 2021;12(1):2608–32. DOI: https://doi.org/10.1080/21505594.2021.1980987Weiss A.A., Falkow S. Genetic analysis of phase change in Bordetella pertussis. Infect. Immun. 1984;43(1):263–9. DOI: https://doi.org/10.1128/iai.43.1.263-269.1984Stibitz S., Aaronson W., Monack D., et al. Phase variation in Bordetella pertussis by frameshift mutation in a gene for a novel two-component system. Nature. 1989;338(6212):266–9. DOI: https://doi.org/10.1038/338266a0Stibitz S. IS481 and IS1002 of Bordetella pertussis create a 6-base-pair duplication upon insertion at a consensus target site. J. Bacteriol. 1998;180(18):4963–6. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.180.18.4963-4966.1998Stibitz S. Mutations affecting the alpha subunit of Bordetella pertussis RNA polymerase suppress growth inhibition conferred by short C-terminal deletions of the response regulator BvgA. J. Bacteriol. 1998;180(9):2484–92. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.180.9.2484-2492.1998Нестерова Ю.В., Медкова А.Ю., Бабаченко И.В. и др. Клинико-диагностическое значение генетических маркеров Bordetella pertussis у контактных лиц в семейных очагах. Журнал инфектологии. 2019;11(1):17–24. Nesterova Yu.V., Medkova A.Yu., Babachenko I.V., et al. Clinical-diagnostic value of Bordetella pertussis genetic markers in contact persons in familial foci. Journal Infectology. 2019;11(1):17–24. DOI: https://doi.org/10.22625/2072-6732-2019-11-1-17-24 EDN: https://elibrary.ru/ubtkhkКаратаев Г.И., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю. и др. Инсерционная инактивация оперона вирулентности в популяции персистирующих бактерий Bordetella pertussis. Генетика. 2016;52(4):422–30. Karataev G.I., Sinyashina L.N., Medkova A.Yu., et al. Insertional inactivation of virulence operon in population of persistent Bordetella pertussis bacteria. Genetika. 2016;52(4):422–30. DOI: https://doi.org/10.7868/S0016675816030085 EDN: https://elibrary.ru/vvgoitWeigand M.R., Pawloski L.C., Peng Y., et al. Screening and genomic characterization of filamentous hemagglutinin-deficient Bordetella pertussis. Infect. Immun. 2018;86(4):e00869–17. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.00869-17DeShazer D., Wood G.E., Friedman R.L. Molecular characterization of catalase from Bordetella pertussis: identification of the katA promoter in an upstream insertion sequence. Mol. Microbiol. 1994;14(1):123–30. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1994.tb01272.xMa L., Caulfield A., Dewan K.K., et al. Pertactin-deficient Bordetella pertussis, vaccine-driven evolution, and reemergence of pertussis. Emerg. Infect. Dis. 2021;27(6):1561–6. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2706.203850Han H.J., Kuwae A., Abe A., et al. Differential expression of type III effector BteA protein due to IS481 insertion in Bordetella pertussis. PLoS One. 2011;6(3):e17797. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017797Семин Е.Г., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю. и др. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018;95(4):33–41. Semin E.G., Sinyashina L.N., Medkova A.Y., et al. Construction of recombinant attenuated Bordetella pertussis bacteria of ptxP3 genotype. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2018;95(4):33–41. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-4-33-41 EDN: https://elibrary.ru/npsjcfСиняшина Л.Н., Воронцов В.В, Семин Е.Г. и др. Bvg-негативная регуляция перемещений повторяющихся последовательностей в клетках B. pertussis. Генетика. 2005;41(12):1–9. EDN: https://elibrary.ru/hswjwl Sinyashina L.N., Vorontsov V.V., Semin E.G., et al. Bvg-negative regulation of repeated sequence transposition in Bordetella pertussis cells. Russian Journal of Genetics. 2005;41(12):1–9. EDN: https://elibrary.ru/ljjdgbСивов И.Г., Большакова Т.Н., Каратаев Г.И. Интеграция и внутримолекулярное перемещение транспозона TnBp3 B. pertussis в клетках E. coli K-12, мутантных по белку Hpr фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы. Генетика. 2001;37(7):900–7. Sivov I.G., Bol'shakova T.N., Karataev G.I. Integration and intramolecular transposition of the TnBp3 transposon from B. pertussis in E. coli K-12 cells mutant for the Hpr protein of the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system. Russian Journal of Genetics. 2001;37(7):900–7.D'Halluin A., Petráčková D., Čurnová I., et al. An IS element-driven antisense RNA attenuates the expression of serotype 2 fimbriae and the cytotoxicity of Bordetella pertussis. Emerg. Microbes Infect. 2025;14(1):2451718. DOI: https://doi.org/10.1080/22221751.2025.2451718Farman M.R., Petráčková D., Kumar D., et al. Avirulent phenotype promotes Bordetella pertussis adaptation to the intramacrophage environment. Emerg. Microbes Infect. 2023;12(1):e2146536. DOI: https://doi.org/10.1080/22221751.2022.2146536Сивов И.Г., Каратаев Г.И., Белявский О.А. Интеграция плазмиды в хромосому E. сoli K12, обусловленная транспозоном Bordetella. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000;(2):33–6. Sivov I.G., Karataev G.I., Belyavsky O.A. Integration of a plasmid into the E. coli K12 chromosome mediated by a Bordetella transposon. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2000;(2):33–6.