Адаптация вирусов гриппа H2N2 с различной рецепторной специфичностью к клеткам MDCK: возможности для разработки культуральной пандемической вакцины против гриппа H2N2

Полный текст

Введение

Птичий грипп является зоонозной инфекцией, представляющей высокую опасность для человека ввиду высокой смертности, достигающей 60% при заражении высокопатогенными подтипами H5N1, H7N9, H5N6, H10N8 [1–4]. «Азиатский» грипп подтипа H2N2 появился в Сингапуре в феврале 1957 г. и стремительно вызвал пандемию, которая унесла более 2,7 млн жизней. Известно, что причиной пандемий гриппа H2N2 в 1957 г. и H3N2 в 1968 г. стало переключение рецепторной специфичности вируса с птичьего сиалового рецептора α2,3 на человеческий α2,6, при этом в начале пандемической волны одновременно циркулировали вирусы гриппа с обоими типами рецепторной специфичности [5, 6]. Поскольку птицы являются основным резервуаром и переносят практически все известные подтипы вируса гриппа А, в том числе H2N2, то риски возвращения данных вирусов в циркуляцию среди людей оцениваются как достаточно высокие [7]. Учитывая снижение популяционного иммунитета к вирусам H2N2 из-за их длительного отсутствия в циркуляции, учёные всего мира призывают начать кампании по вакцинации против этих вирусов заранее, не дожидаясь начала пандемии [8].

Как известно, вакцинопрофилактика гриппа является оптимальным методом борьбы против этой инфекции и существует множество гриппозных вакцин для сезонного применения. Однако в условиях пандемии наиболее эффективной считается живая гриппозная вакцина (ЖГВ) [9, 10]. Подавляющее большинство гриппозных вакцин в мире производится в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), но при этом в последние десятилетия активно обсуждается вопрос о переводе производства гриппозных вакцин на перевиваемые клеточные линии, что позволит в короткие сроки нарабатывать большие объёмы вирусной биомассы, а также сузит список противопоказаний, в частности, позволит применять вакцину лицам, страдающим аллергией на куриный белок [11]. Кроме того, если пандемия гриппа будет вызвана высокопатогенным вирусом, то высока вероятность того, что поголовье кур на птицефабриках будет полностью уничтожено, поэтому независимость вакцинного производства от поставки яиц с птицефабрик также крайне важна. Таким образом, производство гриппозных вакцин целесообразно перевести на культуру клеток MDCK (культура клеток почки собаки породы Майдин–Дэрби), поскольку многочисленные исследования показывают, что именно в этой клеточной культуре вакцинные штаммы ЖГВ способны реплицироваться до титров, сопоставимых с РКЭ [12–14].

Основной целью настоящего исследования являлся поиск наиболее перспективного варианта вакцинного штамма культуральной ЖГВ А(H2N2), который следует использовать в начале пандемической волны. Для этого проводилось изучение двух вариантов пандемического вируса A/Singapore/1/57 (H2N2), различающихся рецепторной специфичностью, и вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на их основе. Была проведена адаптация вирусов к культуре клеток MDCK с последующим клонированием методом бляшек и оценкой рецепторной специфичности изолированных вариантов вирусов. Различающиеся по сиквенсу гена гемагглютинина (НА) варианты использовали для иммунизации лабораторных животных с целью выявления потенциального влияния адаптационных мутаций в поверхностных белках вируса на иммуногенность, антигенность и кросс-реактивность вырабатываемых после иммунизации антител.

Материалы и методы

Вирусы

В работе были использованы два варианта пандемического вируса А/Singapore/1/57 (H2N2), полученные из коллекции отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева Института экспериментальной медицины, различавшиеся по чувствительности к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови. Эксперименты с живыми вирусами H2N2 проводили в лаборатории с уровнем биобезопасности BSL-3.

Получение вакцинных штаммов ЖГВ методами обратной генетики

Гены HA и нейраминидазы (NA) клонировали в вектор для обратной генетики pCIPolISapIT с использованием универсальных пар праймеров, специфичных для каждого гена в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией [15]. Набор из 6 плазмидных ДНК с двунаправленным считыванием, кодирующих все сегменты донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), был подготовлен ранее [16]. Жизнеспособные вирусы гриппа получали при помощи электропорации клеток Vero с использованием системы трансфекции «Neon» («Invitrogen») и прилагающегося к нему набора «Neon Kit» 100 мкл.

Реакция гемагглютинации

Реакцию гемагглютинации (РГА) проводили по классической схеме с использованием куриных эритроцитов¹. Для исследования рецепторной специфичности вирусов гриппа использовали модификацию РГА с ферментом экзосиалидазы exo-α-Sialidase (Salmonella typhimurium) («Megazyme»), который отщепляет с поверхности эритроцитов исключительно α2,3-рецепторы. Для постановки РГА использовали лошадиные эритроциты, которые на своей поверхности экспрессируют только α2,3-рецепторы; необработанные куриные эритроциты, которые экспрессируют оба типа рецепторов; куриные эритроциты, обработанные экзосиалидазой в течение 1 ч при 37ºС, т.е. несущие на своей поверхности только α2,6-рецепторы.

Считалось, что вирус обладал α2,3-рецепторной специфичностью, если его титр в РГА с лошадиными и куриными эритроцитами совпадал и при этом титр в РГА с обработанными куриными эритроцитами был равен 0. В обратном случае считалось, что вирус обладал α2,6-рецепторной специфичностью. Если же во всех РГА титр был положительный, считалось, что вирус обладает двойственной рецепторной специфичностью с преимуществом того типа, где был больший титр в РГА.

Накопление вирусов и определение инфекционного титра

Для накопления вирусов гриппа в куриных эмбрионах 10–11-дневные РКЭ заражали вируссодержащим материалом в объёме 0,2 мл, после чего эмбрионы инкубировали в течение 48–72 ч при 33–37ºС. Накопление вирусов в культуре клеток MDCK проводили на суточном монослое с конфлюентностью 90–95%, выращенным в среде DMEM с добавлением 1×антибиотика-антимикотика («Gibco») и 10% фетальной бычьей сыворотки («Биолот») при 37ºС в термостате с содержанием 5% СО₂. Для заражения культуры клеток MDCK готовый монослой дважды отмывали тёплым раствором фосфатно-солевого буфера (PBS), после чего добавляли вирусную суспензию в объёме 1, 2, 3 мл во флаконы Т-25, Т-75 и Т-175 соответственно. После контакта в течение 1 ч при 33ºС для вакцинных штаммов и 37ºС для диких вирусов вируса гриппа в термостате с содержанием 5% СО₂ инокулят удаляли и добавляли среду DMEM с 1×антибиотиком-антимикотиком и 1 мкг/мл трипсина TPCK («Sigma-Aldrich Co.»). Через 72 ч инкубации при 33ºС или 37ºС визуально оценивали цитопатическое действие вируса и определяли его титр в РГА.

Инфекционные титры вирусов в обеих системах культивирования определяли методом предельных разведений. РКЭ заражали последовательными разведениями вирусов на PBS в объёме 200 мкл и инкубировали при 33ºС и 37ºС в течение 48 ч, после чего определяли наличие вируса в РГА с куриными эритроцитами. Определение титра в клетках MDCK проводили на 96-луночных планшетах с суточным монослоем, при этом серийные 10-кратные разведения готовили на среде DMEM с антибиотиком-антимикотиком и 1 мкг/мл трипсина ТРСК. После адсорбции инокулят удаляли, клетки промывали и инкубировали в поддерживающей среде в течение 3 сут. Наличие вирусов в лунках определяли методом РГА с куриными эритроцитами. Титры вирусов в РКЭ и клетках MDCK рассчитывали по методу Рида и Менча [17] и выражали в 50% эмбриональной (lg ЭИД₅₀/мл) и тканевой цитопатогенной (lg ТЦИД₅₀/мл) инфекционных дозах.

Адаптация вирусов к культуре клеток MDCK

Адаптацию вирусов гриппа к культуре клеток MDCK проводили при последовательном 5-кратном пассировании штаммов, за которым следовало клонирование вируса методом бляшек. Для этого на 6-луночные планшеты, засеянные накануне клетками MDCK, наносили 10-кратные разведения вирусов в 2 повторах. После часового контакта с регулярным покачиванием инокулят удаляли и в лунки вносили по 3 мл агарозового покрытия, полученного смешиванием равных объёмов двукратной среды DMEM (в присутствии антибиотика-антимикотика и 2 мкг/мл трипсина TPCK) и 1,6% легкоплавкой агарозы («Lonza»). На 3–5-й день инкубации визуально оценивали вирусные бляшки, выделяли 20–30 хорошо отделяемых друг от друга бляшек на предельных разведениях, из каждой выделенной бляшки изолировали отдельный клон вируса, который затем накапливали на культуре клеток MDCK, и полностью секвенировали гены поверхностных белков методом Сэнгера с помощью набора «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1» («Thermo»).

Эксперименты с лабораторными животными

В экспериментах с животными использовали мышей линии СВА и сирийских хомячков (Столбовая). Исследование было одобрено Этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 1/20 от 27.02.2020).

Для оценки иммуногенности диких вирусов гриппа с различной рецепторной специфичностью были использованы самки мышей линии СВА, которых заражали интраназально в дозе 10⁵ ЭИД₅₀/животное. Через 21 день животных эвтаназировали, после чего собирали сыворотки крови и смывы с верхних дыхательных путей (ВДП) для определения уровня гуморального иммунного ответа к различным вариантам вируса. Для оценки иммуногенности вакцинных штаммов ЖГВ H2N2 сирийских хомячков иммунизировали интраназально в дозе 10⁵ lg ЭИД₅₀/животное, дважды с интервалом 21 день. На 21-й день после 2-й иммунизации животных эвтаназировали, собирали сыворотку крови, смывы с ВДП и бронхоальвеолярный лаваж.

Иммунологические методы

Исследование сывороток крови животных в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) проводили по стандартному протоколу² с куриными эритроцитами и обработкой сывороток рецептор-разрушающим ферментом («RDE», «Denka»). За титр сыворотки в РТГА принимали последнее разведение, при котором наблюдалось полное торможение гемагглютинации эритроцитов.

Иммуноферментный анализ

Постановку иммуноферментного анализа (ИФА) с образцами от животных осуществляли с использованием в качестве антигена очищенных на градиенте плотности сахарозы вирусов гриппа. Антиген вносили в 96-луночные планшеты с высокой сорбцией («Corning») в количестве 16 АЕ в 50 мкл и инкубировали в течение ночи при 4ºС. Планшеты промывали 3 раза отмывочным буфером (PBS + 0,05% Twin-20 («Биолот»)), после чего проводили блокировку несвязанных сайтов с помощью 1% бычьего сывороточного альбумина.

Двукратные разведения сывороток или смывов с дыхательных путей готовили в отдельных круглодонных планшетах, которые затем переносили в лунки отмытого от блокировочного раствора планшета. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты снова промывали 3 раза отмывочным буфером, подсушивали и вносили вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена: анти-IgG мыши (1 : 10 000), анти-IgA мыши (1 : 2000), анти-IgG хомяка (1 : 5000) и анти-IgA хомяка (1 : 300). Инкубировали 1 ч при 37ºС, после чего 5 раз промывали планшет отмывочным буфером, подсушивали и добавляли 50 мкл/лунку субстрата ТМВ («Thermo»), который инкубировали в темноте до 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1М H₂SO₄. Первичные результаты ИФА учитывали на спектрофотометре («Bio-Rad») при длине волны 450 нм. За титр антител принимали последнее разведение, при котором оптическая плотность (ОП) превышала двукратный средний уровень контрольных лунок. Рассчитывали площадь под кривой ОП с помощью программного пакета «GraphPad Prizm 7».

Статистическая обработка данных

Для сравнения данных использовали непараметрический U-test Манна–Уитни; t-критерий Стьюдента и ANOVA с помощью программного обеспечения «GraphPad Prizm 7». Различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты

Два варианта пандемического штамма А/Singapore/1/57 (H2N2) были восстановлены из ампул с материалом, лиофилизированным в 1975 г., при этом точная пассажная история вирусов неизвестна. Накопленные в РКЭ вирусы различались по уровню чувствительности к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови морской свинки. Полногеномное секвенирование показало, что у этих вирусов в субъединице НА1 присутствуют аминокислотные отличия в позициях 156 (E/K), 226 (Q/L) и 228 (G/S) (таблица). По данным литературы, замены в позициях 226 и 228 отвечают за рецепторную специфичность вируса гриппа [5, 6]. Действительно, оценка сродства этих вирусов к рецепторам на поверхности эритроцитов в РГА с различными типами эритроцитов показала, что вирус с остатками E156, Q226 и G228 обладает α2,3-рецепторной специфичностью (обозначен как Sing-α2,3), а вариант с остатками K156, L226 и S228 имеет сродство к α2,6-рецепторам (Sing-α2,6) (рис. 1, а). Аминокислотная замена К19Т была обнаружена в молекуле NА, но поскольку она находится в трансмембранном домене, то влияния на рецепторную специфичность не имеет (таблица). Адаптация исследуемых вирусов к культуре клеток MDCK и последующее клонирование бляшками позволило выделить 3 дополнительных варианта вирусов с отличающимися последовательностями НА: Sing-α2,6-EP с мутациями G158E и L321P в субъединице НА1, Sing-α2,3-S с мутацией P221S в субъединице НА1 и Sing-α2,3-V с мутацией A96V в субъединице НА2 (таблица).

 

Аминокислотные различия в поверхностных белках исследуемых вариантов вируса А/Singapore/1/57 (H2N2)

Amino acid substitutions in surface proteins of investigated variants of A/Singapore/1/57 (H2N2) virus

Вирус Virus	HA							NA
	HA1						HA2
	156	158	221	226	228	321	96	19
Исходные штаммы, накопленные в РКЭ | Original strains accumulated in the Egg
Sing-α2,6	Lys	Gly	Pro	Leu	Ser	Leu	Ala	Thr
Sing-α2,3	Glu	Gly	Pro	Gln	Gly	Leu	Ala	Lys
MDCK-адаптированные штаммы | MDCK-adapted strains
Sing-α2,6-EP	Lys	Glu	Pro	Leu	Ser	Pro	Ala	Thr
Sing-α2,3-S	Glu	Gly	Ser	Gln	Gly	Leu	Ala	Lys
Sing-α2,3-V	Glu	Gly	Pro	Gln	Gly	Leu	Val	Lys

 

Рис. 1. Характеристика исследуемых вирусов in vitro.

а — титры вирусов в РГА с необработанными куриными эритроцитами (1), лошадиными эритроцитами (2) и куриными эритроцитами, обработанными экзосиалидазой (3); б — инфекционная активность исследуемых вирусов в системе РКЭ и культуре клеток MDCK.

Fig. 1. Characterization of the studied viruses in vitro.

a — titers of viruses in HA with untreated chicken erythrocytes (1), horse erythrocytes (2) and chicken erythrocytes treated with exosialidase (3); b — infectious activity of the studied viruses in the Egg and MDCK cells.

 

Изучение MDCK-адаптированных вариантов в РГА показало, что штамм Sing-α2,6-EP имеет сродство к α2,6-рецепторам, а варианты Sing-α2,3-S и Sing-α2,3-V — к α2,3-рецепторам (рис. 1, а). Таким образом, адаптация «диких» вирусов гриппа H2N2 к культуре клеток млекопитающих не оказывает существенного влияния на их рецепторную специфичность.

Кроме этого, была исследована инфекционная активность всех вирусов в РКЭ и культуре клеток MDCK. Установлено, что вирус Sing-α2,3 в среднем на 2 порядка лучше размножался в системе РКЭ, чем вирус Sing-α2,6, при этом их титры в культуре клеток MDCK были сопоставимы (рис. 1, б). Важно отметить, что инфекционная активность MDCK-адаптированных вариантов в культуре клеток была значительно выше, чем у соответствующих исходных вирусов. Таким образом, отмечен вклад мутаций G158E и L321P, P221S в субъединице НА1 и A96V в субъединице НА2 в увеличение инфекционного титра вируса в культуре клеток MDCK (рис. 1, б).

Иммунизация мышей линии СВА исходными штаммами Sing-α2,6 и Sing-α2,3, а также MDCK-адаптированными вариантами приводила к образованию более высоких уровней гомологичных сывороточных антител у вирусов Sing-α2,6 и Sing-α2,6-ЕР по сравнению с вирусами, имеющими сродство к α2,3-рецепторам (рис. 2, а, б). При этом адаптированные к клеткам варианты Sing-α2,3-S и Sing-α2,3-V индуцировали значительно меньшие уровни гомологичных сывороточных IgG-антител по сравнению с исходным вариантом Sing-α2,3 (рис. 2, б). Исследование местного гуморального иммунного ответа показало существенные приросты секреторных IgA-антител у всех 5 исследуемых вирусов: Sing-α2,6, Sing-α2,6-EP, Sing-α2,3, Sing-α2,3-S и Sing-α2,3-V (рис. 2, в). Сравнение уровней IgA-антител в группах исходных вирусов Sing-α2,6 и Sing-α2,3 различий не выявило (р = 0,3355), что отличается от данных по системному гуморальному ответу. Тем не менее сравнительный анализ уровней секреторных IgA-антител между группами вирусов, заражённых MDCK-адаптированными вариантами Sing-α2,6-EP, Sing-α2,3-S и Sing-α2,3-V, как и в системном ответе, выявил превосходство вируса Sing-α2,6-EP. Суммируя данные об индукции системного и локального иммунного ответа исследуемыми вирусами, можно заключить, что все указанные вирусы индуцируют гуморальный ответ, однако наименее иммуногенны оказались MDCK-адаптированные варианты с рецепторной специфичностью α2,3 (Sing-α2,3-S и Sing-α2,3-V) на уровне как системного, так и локального гуморального иммунитета. Наоборот, вирусы Sing-α2,6, Sing-α2,6-EP с рецепторной специфичностью α2,6 не отличались по иммуногенности ни в одном из тестов.

 

Рис. 2. Оценка гуморального иммунного ответа на однократное введение исследуемых вирусов мышам линии СВА.

а — уровень гомологичных сывороточных антител, выявляемых в РТГА; б — уровень гомологичных сывороточных IgA-антител в ИФА; в — уровень гомологичных секреторных IgG-антител в ИФА.

Fig. 2. Assessment of humoral immune response to a single administration of the tested viruses to CBA mice.

a — level of homologous serum antibodies detected in HAI; b — level of homologous serum IgA antibodies in ELISA; c — level of homologous secretory IgG antibodies in ELISA.

 

Далее была проведена оценка кросс-реактивности сывороточных антител, выработанных при введении 5 исследованных вариантов вируса А/Singapore/1/57 (H2N2), в отношении каждого варианта в РТГА и ИФА. Интересно, что при использовании в качестве антигенов в РТГА вирусов с α2-6-рецепторной специфичностью выявлялись существенно более высокие показатели титров антител во всех иммунизированных группах, по сравнению с антигенами, обладающими α2-3-специфичностью (рис. 3, а). При этом антитела в сыворотках группы Sing-α2,6 не уловили ни один из 3 вариантов вирусов с α2-3-рецепторной специфичностью. Несмотря на то что у мышей, иммунизированных MDCK-адаптированным вариантом Sing-α2,6-EP, выявлялись титры антител выше уровня детекции, статистически значимых отличий с группой контроля не обнаружено. Исследование кросс-реактивности сывороточных IgG-антител методом ИФА показало схожие результаты: вирусы с α2-6-рецепторной специфичностью в качестве антигенов выявляли наиболее высокие значения титров антител во всех группах, тогда как связывание антител с вирусами с α2,3-рецепторной специфичностью было значительно слабее у животных всех групп (рис. 3, б).

 

Рис. 3. «Тепловая карта» иммуногенности и кросс-реактивности исследуемых вариантов вируса А/Singapore/1/57 (H2N2) в эксперименте на мышах (n = 7).

а — средние значения уровней антигемагглютинирующих антител у всех иммунизированных групп в отношении различных вирусных антигенов; б — средние значения уровней сывороточных IgG-антител у всех иммунизированных групп в отношении различных вирусных антигенов.

Fig. 3. Heat map of the immunogenicity and cross-reactivity of investigated variants of A/Singapore/1/57 (H2N2) virus in the experiment on mice (n = 7).

a — mean values of the levels of anti-hemagglutinating antibodies in all immunized groups against different viral antigens; b — mean values of the levels of serum IgG antibodies in all immunized groups against different viral antigens.

 

Важно отметить, что вирусы с α2-6-рецепторной специфичностью в качестве антигена одинаково хорошо связывали антитела в сыворотках мышей из всех исследуемых групп, за исключением группы животных, иммунизированных вирусом Sing-α2,3-V, в которой титры антител к вирусам Sing-α2,6 и Sing-α2,6-EP достоверно отличались от титров антител в других группах (рис. 3, а). В группах животных, иммунизированных MDCK-адаптированными вариантами с α2-3-рецепторной специфичностью, наблюдалась обратная ситуация: титры IgG-антител к вирусам Sing-α2,3-S и Sing-α2,3-V во всех иммунизированных группах были снижены; при этом замену P221S в субъединице НА1 можно охарактеризовать как escape-мутацию, поскольку вирус Sing-α2,3-S наиболее эффективно уходит от распознавания антителами у всех исследованных вариантов иммуногенов (рис. 3, б).

В целом полученные результаты указывают на то, что для производства клеточной пандемической вакцины H2N2 наиболее подходящими вирусами являются варианты с α2-3-рецепторной специфичностью, адаптированные к культуре клеток MDCK или выделенные на ней.

Для подтверждения этой гипотезы мы сконструировали методами обратной генетики 2 штамма живой гриппозной вакцины H2N2 на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57: А/17/Singapore/57/1 с генами HA и NA от вируса Sing-α2,3 (обозначен как 17/Sing-α2,3) и А/17/Singapore/57/2 с генами HA и NA от вируса Sing-α2,6 (17/Sing-α2,6). РГА с различными эритроцитами подтвердило рецепторную специфичность полученных вакцинных вирусов, которая совпадала с соответствующим диким вирусом (рис. 4, а), что ещё раз указывает на ключевую роль НА в связывании с гликановыми рецепторами клетки-хозяина. Важно отметить, что адаптация вакцинных штаммов к клеткам MDCK не привела к появлению новых мутаций в молекуле НА: более 50 накопленных из бляшек вирусов соответствовали исходному штамму ЖГВ. Оценка инфекционной активности сконструированных вирусов показала, что вакцинные штаммы 17/Sing-α2,3 и 17/Sing-α2,6 одинаково хорошо размножались в культуре клеток MDCK, тогда как в РКЭ вирус 17/Sing-α2,3 имел инфекционный титр на порядок выше, чем у вируса 17/Sing-α2,6 (рис. 4, б).

 

Рис. 4. Характеристика исследуемых вакцинных штаммов ЖГВ H2N2 in vitro.

а — титры вирусов в РГА с необработанными куриными эритроцитами (1), лошадиными эритроцитами (2), куриными эритроцитами, обработанными экзосиалидазой (3); б — инфекционная активность исследуемых вирусов в системе РКЭ и культуре клеток MDCK.

Fig. 4. Characterization of the investigated vaccine strains of H2N2 LIV in vitro.

a — virus titers in HA assays with untreated chicken erythrocytes (1), horse erythrocytes (2), chicken erythrocytes treated with exosialidase (3); b — infectious activity of the studied viruses in the Egg system and MDCK cell culture.

 

Двукратная иммунизация сирийских хомячков генно-инженерными вакцинными штаммами 17/Sing-α2,3 и 17/Sing-α2,6 приводила к формированию у животных схожих уровней сывороточных IgG-антител, связывающихся с антигеном Sing-α2,3, при этом вакцинный вирус 17/Sing-α2,3 индуцировал достоверно больше антител к антигену Sing-α2,6, чем к собственному антигену Sing-α2,3 (рис. 5). Полученные результаты полностью согласуются с результатами изучения антигенности пандемических вариантов А/Singapore/1/57 в эксперименте на мышах (рис. 3).

 

Рис. 5. Оценка гуморального иммунного ответа на двукратное введение исследуемых вакцинных штаммов ЖГВ сирийским хомячкам.

Слева представлены значения ОП₄₅₀ при различных разведениях сывороток или смывов с ВДП и бронхоальвеолярного лаважа к вирусу Sing-α2,3 в ИФА. Посередине представлены значения ОП₄₅₀ при различных разведениях сывороток или смывов к вирусу Sing-α2,6 в ИФА. Справа — значения площади под кривой ОП при длине волны 450 нм в ИФА с соответствующим антигеном.

Fig. 5. Evaluation of the humoral immune response to twice-daily administration of the tested vaccine strains of LIV to Syrian hamsters.

On the left are OD₄₅₀ values at different dilutions of sera or washes from URT and bronchoalveolar lavage to Sing-α2,3 virus in ELISA. In the middle are OD₄₅₀ values at different dilutions of sera or washes to Sing-α2,6 virus in ELISA. On the right are the area under the optical density curve at 450 nm in ELISA with the corresponding antigen.

 

Проведено исследование кросс-реактивности локальных IgA-антител в смывах с ВДП и нижних дыхательных путей в ИФА с теми же вирусными антигенами. Использование вируса Sing-α2,6 в качестве антигена позволило выявить существенно более высокие уровни секреторных вирусспецифических антител по сравнению с использованием в качестве антигена вируса Sing-α2,3 (рис. 5).

Таким образом, из представленных результатов следует, что вирусы гриппа подтипа H2N2 с α2-3-рецепторной специфичностью индуцируют антитела, обладающие более широкой кросс-реактивностью в отношении вирусов с различной рецепторной специфичностью, по сравнению с антителами, образованными при введении вирусов, имеющих сродство к α2-6-рецепторам. Данный феномен необходимо учитывать при выборе штамма для подготовки вакцины в случае наступления пандемии гриппа H2N2.

Обсуждение

Вирусы гриппа A(H2N2) циркулировали в человеческой популяции с 1957 по 1968 г., после чего они были вытеснены вирусами A(H3N2), вызвавшими пандемию «гонконгского» гриппа [18]. Поскольку вирусы H2N2 не инфицируют людей уже более 50 лет, можно говорить о чрезвычайно низком уровне популяционного иммунитета к данным вирусам, и люди, рождённые после 1968 г., являются наиболее уязвимой группой в случае возвращения вирусов H2N2 в циркуляцию [19]. Учитывая сохранность вирусов гриппа с гемагглютинином Н2 в природном резервуаре [20–22], вероятность наступления новой пандемии гриппа H2N2 оценивается как высокая [7]. В этой связи исследования, направленные на разработку и детальное изучение потенциально пандемических вакцин против вирусов данного подтипа, чрезвычайно важны и актуальны.

Ранее нами была разработана и изучена в доклинических и клинических исследованиях ЖГВ против вируса H2N2, циркулировавшего в конце пандемической волны, — А/Калифорния/1/66 (H2N2) [23, 24], и данная вакцина может быть использована для иммунизации наиболее уязвимых групп населения в случае возвращения в циркуляцию антигенно схожих вирусов H2N2. Однако результаты мониторинга за вирусами гриппа птиц показывают, что большинство изолятов подтипа H2N2 остаются антигенно сходными с пандемическим вирусом A/Singapore/1/57 и сохраняют предпочтение к сиаловым α2,3-рецепторам птичьего типа [7]. Детальные исследования влияния рецепторной специфичности вирусов на их трансмиссивность в экспериментах на хорьках показали, что при переключении рецептора с α2,3- на α2,6-тип существенно повышается способность вируса передаваться воздушно-капельным путём, что может сыграть решающую роль в пандемическом распространении вирусов H2N2 [25]. Тем не менее в литературе отсутствуют чёткие данные о том, какие именно вирусы лучше использовать для подготовки вакцин в начале пандемии, вызванной вирусами гриппа птиц и обладающих сродством к обоим типам клеточных рецепторов.

В настоящей работе мы провели модельный эксперимент с пандемическими вариантами вируса A/Singapore/1/57, социркулировавшими в 1957 г. и отличающимися рецепторной специфичностью молекулы НА, которая определялась 3 аминокислотными отличиями в субъединице НА1: E156, Q226, G228 — у варианта Sing-α2,3 и K156, L226, S228 — у варианта Sing-α2,6. Поскольку пандемические вакцины целесообразно производить на перевиваемых клеточных линиях для повышения качества продукта и возможности ускоренного масштабирования производства [11, 26], мы проводили серийное пассирование как исходных пандемических вирусов Sing-α2,3 и Sing-α2,6, так и реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на их основе, в культуре клеток MDCK с последующей идентификацией новых замен в молекуле НА. Интересно, что адаптационные мутации возникали при пассажах только пандемических вирусов в клетках, но не вакцинных штаммов ЖГВ. Это может быть связано с тем, что пандемические варианты представляли собой гетерогенную популяцию вирусов с неизвестной пассажной историей, тогда как вакцинные вирусы прошли только два пассажа в РКЭ после сборки из плазмид и представляли собой более гомогенную популяцию. Важно отметить, что обнаруженные нами мутации не повлияли на рецепторную специфичность вирусов, но оказывали влияние на их антигенность. В частности, мутация P221S в субъединице НА1 носила характер escape-мутации, поскольку позволяла избегать распознавания антителами в сыворотках животных, иммунизированных всеми исследованными вариантами A/Singapore/1/57. Интересно, что аналогичная мутация была описана для вирусов гриппа птиц подтипа H9N2, при этом она снижала сродство вируса к аналогу птичьего α2,3-рецептора, но в комбинации с мутацией L226Q сродство к данному рецептору восстанавливалось [27], что полностью совпадает с нашими результатами. Кроме того, мутация P221S обнаруживалась у вируса А/Wyoming/3/2003 (H3N2) при его серийном пассировании в клетках MDCK [28], что также подтверждает адаптационный характер данной замены.

Заключение

Наиболее важным результатом исследования является демонстрация более широкой кросс-реактивности антител, вырабатываемых при интраназальной иммунизации животных вирусами H2N2 с α2,3-рецепторной специфичностью. Причём это было показано как для пандемических вирусов A/Singapore/1/57, так и для вакцинных реассортантных штаммов ЖГВ, полученных методами обратной генетики. Тут важно отметить, что вакцинный штамм ЖГВ 17/Sing-α2,3 подходит для производства на культуре клеток, поскольку достигает высокого инфекционного титра в культуре клеток MDCK, а гомогенная природа штамма за счёт его подготовки генно-инженерными методами обеспечит генетическую стабильность вакцины при серийных пассажах на клетках MDCK, что говорит в пользу массовой наработки вакцины в первую волну пандемии. Кроме того, такой выбор штамма для производства пандемической клеточной ЖГВ позволит максимально увеличить репродукцию вакцинного штамма в культуре клеток MDCK, а также обеспечит высокую эффективность вакцины благодаря полноценному антигенному охвату циркулирующих вирусов гриппа в случае пандемии.

Несмотря на то что выдвинутая нами гипотеза нашла экспериментальное подтверждение на различных животных моделях, для потенциального широкого применения штамма ЖГВ 17/Sing-α2,3 среди людей требуется изучение его иммуногенности и кросс-реактивности в клинических испытаниях. Одним из препятствий к использованию штамма ЖГВ 17/Sing-α2,3 в клинической практике может служить потенциально сниженная репликативная активность вируса в ВДП людей, поскольку у людей α2,3-рецепторы слабо представлены в ВДП и преимущественно экспрессируются в нижних отделах респираторного тракта [29], где вакцинный вирус не размножается в силу своего температурно-чувствительного фенотипа, и это может привести к низкой иммуногенности ЖГВ. Однако опыт иммунизации людей ЖГВ против птичьего гриппа Н5N1, возбудитель которого также имеет α2,3-рецепторную специфичность, показал, что даже в отсутствие репликации в ВДП и при низких уровнях сывороточных антител к вирусу после интраназальной иммунизации ЖГВ формирует долгоживущий иммунный ответ, который может быть демаскирован путём введения инактивированной гриппозной вакцины несколько месяцев и даже лет спустя [30, 31]. Соответственно, стратегия гетерологичной прайм-буст-иммунизации в начале пандемии гриппа H2N2 также может рассматриваться как наиболее перспективная для формирования мощного долгоживущего гуморального иммунитета с широким спектром защиты.

 

¹ WHO. Manual for the laboratory diagnosis of virological surveillance of influenza. Geneva;2011. URL: https://www.who.int/publications/i/item/manual-for-the-laboratory-diagnosis-and-virological-surveillance-of-influenza

² WHO. Manual for the laboratory diagnosis of virological surveillance of influenza. Geneva;2011. URL: https://www.who.int/publications/i/item/manual-for-the-laboratory-diagnosis-and-virological-surveillance-of-influenza

Об авторах

Виктория Аркадьевна Матюшенко

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: matyshenko@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0002-4698-6085

н. с. лаб. иммунологии и вакцинопрофилактики вирусных инфекций отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Арина Дмитриевна Костромитина

Институт экспериментальной медицины

Email: arina8goshina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5432-0171

м. н. с. лаб. клеточной иммунологии отдела иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

Лариса Георгиевна Руденко

Институт экспериментальной медицины

Email: vaccine@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0107-9959

д-р мед. наук, профессор, рук. отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Ирина Николаевна Исакова-Сивак

Институт экспериментальной медицины

Email: isakova.sivak@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0002-2801-1508

д-р биол. наук, член-корр. РАН, зав. лаб. иммунологии и вакцинопрофилактики вирусных инфекций отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы