Анализ аэробиологических исследований с ортопоксвирусами, проводимых Министерством обороны США

Полный текст

Введение

Прекращение вакцинации после завершения «Программы глобальной ликвидации натуральной оспы» привело к опасной ситуации, т. к. значительная часть населения земного шара стала восприимчивой как к натуральной оспе, так и к другим патогенным для человека ортопоксвирусам (ОПВ) в результате утраты популяционного иммунитета [1, 2]. Последнее может привести к чрезвычайной эпидемической ситуации мирового масштаба [2, 3].

Наглядным примером этого служит развитие вспышки оспы обезьян в 2022–2023 гг. (с 28.11.2023 заболевание переименовано Таксономическим комитетом и носит название «мпокс») [4], увеличение за последние 10–15 лет частоты возникновения в мире заболеваний, вызванных вирусами оспы коров, оспы буйволов, оспы верблюдов [5].

В природе практически на всех континентах циркулируют представители различных зооантропонозных ОПВ, которые периодически вызывают заболевания среди животных и людей. Так, в Бразилии и других частях Южной Америки зарегистрированы отдельные случаи поксвирусных инфекций [6, 7]. В выделенных от людей и скота изолятах была установлена высокая степень их близости к вирусу вакцины [8, 9]. При исследовании возможной роли приматов в качестве носителей вакциноподобных вирусов был обнаружен высокий процент серопозитивных результатов [10].

Анализ данных литературы об организации генома ОПВ позволяет предположить, что возбудитель натуральной оспы мог в прошлом возникать в результате эволюционных изменений зоонозного вируса-прародителя. В связи с этим существует угроза возникновения нового особо опасного антропозооноза [11–13].

Целью обзора является анализ опубликованных в открытых научных источниках данных об аэробиологических исследованиях с ОПВ, проводимых Министерством обороны США в 1994–2013 гг. В этот период Всемирной организацией здравоохранения были введены ограничения на научные исследования и хранение образцов вирусов оспы для всех учреждений мира, за исключением двух международных репозитариев: Центра по контролю и профилактике заболеваний (США) и Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия)¹.

Публикации результатов аэробиологических исследований с ортопоксвирусами, проводимых Минобороны США после 2013 г., в открытых научных источниках авторами не найдены.

Для изучения многочисленных аспектов инфекции специалисты научно-исследовательских учреждений Министерства обороны США активно используют различных лабораторных животных и патогенных для них ОПВ. Это белые мыши, низшие приматы (главным образом, яванские макаки, макаки резус) и кролики. Для инфицирования мышей использовали вирусы эктромелии, оспы коров и оспы вакцины, кроликов — вирусы оспы кроликов и оспы вакцины, обезьян и вирус натуральной оспы [14–16]. По мнению американских исследователей, оптимальная модель должна сочетать в себе возможность использования для инфицирования животных низкой заражающей дозы и передачу вируса от больного животного здоровому. Особенности распространения натуральной оспы в наибольшей степени моделируются с помощью экспериментальных работ с оспой кроликов и обезьян.

Значение вируса оспы кроликов как модельного агента для изучения ОПВ-инфекций, было продемонстрировано еще в начале 1960-х гг., когда было показано, что гипериммунные сыворотки обеспечивают защиту аэрогенно инфицированных кроликов при немедленном введении после инфицирования в дозе 175 БОЕ на особь или даже спустя 3 сут после инфицирования. В данном опыте была использована сухая биологическая рецептура со средним размером частиц около 1 мкм [17].

Поскольку частицы аэрозоля размером более 10 мкм задерживаются в верхних отделах дыхательных путей, практически во всех экспериментах по аэрогенному инфицированию, проведённых сотрудниками Института инфекционных заболеваний армии США (USAMRIID), медианный диаметр генерируемых частиц, проникающих в нижние отделы дыхательных путей, составляет 1 мкм [18]. Ряд показателей, характеризующих течение оспы кроликов у аэрогенно инфицированных животных, позволяет моделировать заболевание натуральной оспой человека (табл. 1).

 

Таблица 1. Сходство и различия между натуральной оспой и оспой кроликов (при аэрозольном способе заражения) [19]

Table 1. Similarities and differences between smallpox and rabbit pox (by aerosol route of infection) [19]

Показатель Parameter	Нозологическая форма | Nosological form
	натуральная оспа (обычный тип) Smallpox (common type)	оспа кроликов (заражающая доза < 200 БОЕ) rabbitpox (infectious dose < 200 PFU)	оспа кроликов (заражающая доза > 200 БОЕ) rabbitpox (infectious dose > 200 PFU)
Способ передачи Transmission method	Аэрозольный | Aerosol
Инкубационный период, сут Incubation period, days	7–17	4–6	2–3
Продромальная фаза, сут Prodromal phase, days	2–4		0–2
Клинические признаки заболевания Clinical signs of the disease	Лихорадка, фарингит, повреждения на коже Fever, pharyngitis, skin lesions	Лихорадка, фарингит, повреждения на коже, эрозии в носоглотке Fever, pharyngitis, skin lesions, erosions in the nasopharynx	Лихорадка, фарингит, повреждения на коже, эрозии в носоглотке Fever, pharyngitis, skin lesions, erosions in the nasopharynx
Характеристика повреждений кожи Characterization of skin lesions	Макулы — папулы — везикулы — пустулы — корки — оспины Macules — papules — vesicles — pustules — crusts — pospinas	Макулы — папулы — везикулы — пустулы Macules — papules — vesicles — pustules	Макулы — папулы — везикулы Macules — papules — vesicles
Осложнения Complications	Пневмония, слепота, энцефалит Pneumonia, blindness, encephalitis	Пневмония, множественные некрозы Pneumonia, multiple necroses
Летальность заболевания, % Lethality of the disease, %	≈ 30	≈ 100	100
Время гибели, сутки с начала заболевания Time of death, day from the beginning of the disease	22–28	8–14	5–7

 

Так, при низких заражающих дозах (< 200 БОЕ) инкубационный период составлял 4–6 сут. Первым клиническим признаком заболевания являлась лихорадка, затем отмечались анорексия, слабость, быстрая потеря массы тела, депрессия, вялость, падение температуры тела до субнормальных значений и гибель на 8–14-е сутки после инфицирования.

При высоких заражающих дозах (более 200 БОЕ) вирус оспы кроликов вызывал быстропрогрессирующую летальную инфекцию, напоминающую геморрагическую форму натуральной оспы. Инкубационный период заболевания в этом случае составлял 2–3 сут. Заболевание заканчивалось гибелью на 6-е сутки.

По данным специалистов Центра аэробиологических исследований USAMRIID, величина ЛД₅₀ при аэрогенном инфицировании кроликов вирусом оспы кроликов составляет 15 БОЕ [19]. Этот результат совпадает с данными, полученными H.S. Bedson и соавт. в 1963 г. при использовании сухого препарата вируса оспы кроликов [20].

При аэрогенном инфицировании кроликов мелкодисперсным аэрозолем и изучении процесса распространения заболевания от одного животного к другому моделируются указанные показатели при натуральной оспе. Следовательно, вирус оспы кроликов может быть использован для тестирования защитных препаратов против натуральной оспы [19]. Вирус оспы кроликов может быть использован для моделирования таких характеристик вируса натуральной оспы, как способность вызывать аэрогенное инфицирование в условиях низкой заражающей дозы и способность передачи инфекции от больных здоровым [19]. M. Nicas и соавт. проведена оценка математической модели, определяющей инфекционную дозу вируса натуральной оспы для условий аэрогенного инфицирования [21]. Авторы сделали вывод о том, что для инфицирования человека достаточно одного полноценного вириона.

C.J. Roy и соавт. провели сравнительное изучение эффективности неспецифических средств защиты в отношении натуральной оспы [22]. При использовании в качестве модельного агента вируса оспы кроликов испытаны противовирусные препараты тиосемикарбазон, цидофовир и ST-246. Для сравнения проведены опыты с введением животным специфического защитного средства — очищенной гипериммунной сыворотки кролика. Данные об эффективности указанных противовирусных препаратов при аэрогенном инфицировании животных вирусом оспы кроликов (табл. 2) свидетельствуют о том, что полная защита животных выявлена при использовании цидофовира в дозе 10 мг/кг массы животного в течение 3 сут при первом введении либо немедленно, либо спустя 24 ч после инфицирования, и ST-246 при введении в дозе 40 мг/кг массы животного в течение 14 сут (при первом введении немедленно после инфицирования). Тиосемикарбазон обеспечивал лишь частичную защиту.

 

Таблица 2. Результаты оценки эффективности специфических и неспецифических средств защиты в отношении ОПВ (при использовании в качестве модельного агента вируса оспы кроликов, штамм Утрехт, при аэрогенном инфицировании) [22]

Table 2. Results of evaluation of the effectiveness of specific and nonspecific means of protection against OPV (using rabbit pox virus, Utrecht strain, as a model agent in case of aerogenic infection) [22]

Инфицирующая доза БОЕ, Ме, Д PFU infectious dose, Me, D	Препарат Preparation	Схема введения, обеспечивающая: | Administration process that provides:
		полную защиту | total protection	частичную защиту | partial protection
175 (146–175)	Очищенная гипериммунная сыворотка Purified hyperimmune serum	10 мл разведения 1 : 100 при введении спустя 1 сут после инфицирования или 10 мл цельного препарата при введении на 3-и сутки после инфицирования 10 ml of 1 : 100 dilution when administered 1 day after infection or 10 ml of whole drug when administered on the 3rd day after infection	10 мл разведения 1 : 10 при введении на 3-и сутки после инфицирования 10 ml of 1 : 10 dilution when administered on the 3rd day after infection
> 1000	Тиосемикарбазон Thiosemicarbazone	Нет | None	100–200 мг/кг массы животного ежедневно в течение 4 сут 100–200 mg/kg of animal weight daily for 4 days
2860 (1140–5000)	ST-246	40 мг/кг массы животного в течение 14 сут при 1-м введении немедленно после инфицирования 40 mg/kg of animal weight for 14 days at the first injection immediately after infection	40 мг/кг массы животного в течение 14 сут при 1-м введении, спустя 24, 48 или 72 ч после инфицирования 40 mg/kg animal weight for 14 days at first injection, 24, 48 or 72 h after infection
296 (96–468)	Цидофовир Cidofovir	10 мг/кг массы животного в течение 3 сут при первом введении либо немедленно, либо спустя 24 ч после инфицирования 10 mg/kg animal weight for 3 days at first injection, either immediately or 24 h after infection	1 мг/кг массы животного в течение 3 сут при первом введении либо немедленно, либо спустя 24 ч после инфицирования 1 mg/kg animal weight for 3 days at the first injection either immediately or 24 h after infection

Примечание. Ме — медиана инфицирующей дозы; Д — диапазон варьирования инфицирующей дозы при проведении эксперимента.

Note. Me — median infectious dose; D — range of variation of infectious dose during the experiment.

 

A. Nalca и соавт. [19] и N.L. Garsa и соавт. [23] провели проверку эффективности противооспенной вакцины третьего поколения (NVA-BN) при аэрогенном инфицировании кроликов вирусом оспы кроликов. При однократной иммунизации низкой дозой вакцины у части кроликов наблюдали отдельные признаки заболевания, но все животные выжили (табл. 3). При двукратной иммунизации с интервалом 14 сут или при однократной иммунизации высокой дозой вакцины признаки заболевания у животных отсутствовали.

 

Таблица 3. Результаты оценки эффективности оспенной вакцины третьего поколения (MVA-BN) при аэрогенном инфицировании кроликов вирусом оспы кроликов [19]

Table 3. Results of the evaluation of the efficacy of the third-generation smallpox vaccine (MVA-BN) in aerogenic infection of rabbits with rabbit pox virus [19]

Группа животных Animal group	Доля животных с признаками заболевания, % Percentage of animals with signs of disease, %	Доля выживших животных, % Percentage of surviving animals, %
Однократно иммунизированные низкой дозой вакцины с последующим инфицированием Once immunized with a low dose of vaccine followed by infection	30	100
Двукратно иммунизированные низкой дозой вакцины с последующим инфицированием Twice immunized with a low dose of vaccine followed by infection	0	100
Однократно иммунизированные высокой дозой вакцины Once immunized with a high dose of vaccine	0	100
Контрольная группа (инфицированные животные без иммунизации) Control group (infected animals without immunization)	100	0
Контрольная группа (однократно иммунизированные высокой дозой вакцины без инфицирования) Control group (once immunized with a high dose of vaccine without infection)	0	100

Примечание. При разрешении иммунитета использовали инфицирующую дозу вируса оспы кроликов 200 БОЕ/особь. Низкая доза вакцины — 1 × 10³ БОЕ/особь, высокая доза вакцины — 1 × 10⁵ БОЕ/особь.

Note. An infectious dose of rabbit pox virus 200 CFU/animal was used in challenge experiments. The low vaccine dose was 1 × 10³ PFU/specimen, and the high vaccine dose was 1 × 10⁵ PFU/specimen.

 

На основании проведённых исследований специалисты отделов патологии, токсинологии и аэробиологии USAMRIID рассматривают вирус оспы кроликов как перспективный агентный имитатор в отношении вируса натуральной оспы [24, 25].

В 1999 г. вирус оспы обезьян включён Специальной группой государств — участников Конвенции о запрещении разработки, производства и накопления запасов бактериологического (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении в Перечень биологических агентов — патогенов человека, который был признан значимым в ракурсе разработки перечня биологически поражающих агентов для конкретных мер по укреплению «Конвенции…» [26]. Следует отметить, что согласно общественному мнению, сформированному до середины 1998 г., оспа обезьян рассматривалась как зоонозная инфекция, не имеющая существенного значения для патологии человека.

При анализе изложенных исследований (в том числе аэробиологических), проводимых с вирусом оспы обезьян в ведущем специализированном зарубежном военно-медицинском центре — Институте инфекционных заболеваний армии США, можно выделить два значимых направления: моделирование основных характеристик заболевания, вызываемого вирусом натуральной оспы у человека, и оценка эффективности имеющихся и вновь разрабатываемых вакцин против натуральной оспы.

По мнению N. Hahon, сотрудника химического корпуса армии США, вирус оспы обезьян позволяет моделировать некоторые основные характеристики заболевания, вызываемого вирусом натуральной оспы у человека. Так, по данным литературы, к аэрогенному инфицированию вирусом натуральной оспы чувствительны 4 вида низших приматов (Macaca cynomolgus, M. irus, M. rhesus и Saimiri) [14].

Проведено изучение экспериментальной инфекции у яванских макак при аэрогенном инфицировании вирусом оспы обезьян [27]. В работе использован вирус оспы обезьян, штамм Заир-79, выделенный в 1979 г. в ходе заболевания человека, завершившегося летальным исходом. Посевной материал для формирования аэрозоля представлял собой надосадочную жидкость инфицированных клеток Vero. Средний массовый диаметр частиц аэрозоля составлял 1,2 мкм, расчётная заражающая доза составляла от 1,0 × 10⁴ до 1,4 × 10⁵ БОЕ. В эксперименте были использованы яванские макаки обоего пола массой 1,6–4,7 кг. Инфицирующая доза была определена для каждой обезьяны во время всего срока экспозиции (10 мин). Отбор проб аэрозоля проводили в среду DМЕМ с пеногасителем. Определение концентрации вируса в пробах аэрозоля проводили путём последующего титрования полученных проб по методу негативных колоний на монослое клеток Vero.

Все инфицированные обезьяны погибли с 10-х по 17-е сутки после заражения (средний срок жизни до гибели животных составил 11,2 сут). Летальный исход связан с развитием бронхопневмонии. Корреляция между сроком гибели и инфицирующей дозой отсутствовала.

В последующем было проведено дополнительное изучение экспериментальной инфекции при аэрогенном инфицировании яванских макак вирусом оспы обезьян [28]. Инфицирование осуществляли с помощью автоматизированной системы экспозиции биологических аэрозолей, позволяющей обеспечивать точное введение инфицирующей дозы каждому животному в зависимости от его индивидуальных дыхательных характеристик. В опытах по аэрогенному инфицированию использовали штамм Заир V79. Как следует из данных, представленных в табл. 4, исход заболевания, видимо, определяется индивидуальными особенностями инфицированных животных, во всяком случае корреляция между вводимой дозой и долей погибших животных не прослеживалась. В то же время, по мнению зарубежных военных специалистов, клинические особенности заболевания яванских макак напоминают течение натуральной оспы у человека [29].

 

Таблица 4. Результаты изучения показателей экспериментальной инфекции при аэрогенном инфицировании яванских макак вирусом оспы обезьян [28]

Table 4. Results of the study of experimental infection indices during aerogenic infection of Javan macaques with monkeypox virus [28]

Показатель Indicator	Инфицирующая доза, БОЕ | Infectious dose, PFU
	4,3 × 104	1,4 × 105	4,4 × 105	1,1 × 104
Лихорадка | Fever
начало, сутки после инфицирования onset, day after infection	4,7	3,8	2,8	4,3
продолжительность, ч | duration, h	215,3	244,7	266,7	278,1
Температура, оС | Temperature, оС
максимальное повышение от нормы maximum increase from normal	2,5	3,3	3,4	3,5
среднее повышение от нормы average increase from normal	1,9	1,9	2,1	2,3
Продолжительность жизни до гибели, сут Life expectancy before death, days	10,0	9,0	9,6	8,5
Доля погибших животных | Percentage of dead animals	2/3	4/6	5/6	2/3

 

В дальнейшем была проведена оценка возможности использования полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ) для количественного определения вируса оспы обезьян в биопробах, полученных от аэрогенно инфицированных яванских макак [30]. Установлено, что чувствительность метода составляла 200 БОЕ/см³. Заражающая доза составила от 2,5 × 10⁴ до 9,3 × 10⁵ БОЕ. Средний медианный размер частиц аэрозоля составлял 1,07 мкм и варьировал для каждого отдельного эксперимента в пределах 1,06–1,09 мкм. ЛД₅₀ для обезьян при данном способе инфицирования составила приблизительно 7,8 × 10⁴ БОЕ, время жизни до гибели — 7–10 сут после инфицирования. Проведено определение вирусемии и концентрации вируса в носоглоточных смывах у инфицированных животных с помощью экстраполяции результатов количественной ПЦР-ОТ.

Как следует из данных, представленных в табл. 5 и табл. 6, вирус оспы обезьян выявляется в крови и носоглоточных смывах на 4–18-е сутки после аэрогенного инфицирования. Начало выявления возбудителя коррелирует с заражающей дозой.

 

Таблица 5. Расчётная концентрация вируса в крови обезьян, аэрогенно инфицированных вирусом оспы обезьян, БОЕ/см³ [31]

Table 5. Estimated virus concentration in the blood of monkeys aerogenically infected with monkeypox virus, PFU/cm³ [31]

Инфицирующая доза, БОЕ/см3 Infectious dose, PFU/cm3	Срок после инфицирования, сут | Time after infection, days
	0	2	4	6	8	10	14	18	21
4,2 × 104	< 200	< 200	5,1 × 103	7,0 × 104	1,5 × 105	4,0 × 105	3,1 × 105	1,2 × 103	< 200
2,5 × 104	< 200	< 200	< 200	7,4 × 104	3,0 × 105	2,6 × 105	4,1 × 104	< 200	< 200
1,2 × 105	< 200	< 200	7,8 × 103	1,8 × 105	2,7 × 105	**	–	–	–
2,8 × 105	< 200	< 200	< 200	9,1 × 104	3,6 × 105	**	–	–	–
3,9 × 105	< 200	< 200	9,3 × 103	4,8 × 105	*	–	–	–	–
9,3 × 105	< 200	< 200	2,5 × 104	6,9 × 105	4,5 × 106	4,8 × 106	***	–	–

Примечание. Здесь и в табл. 6: < 200 — концентрация возбудителя в крови ниже величины чувствительности метода ПЦР-ОТ (200 БОЕ/см³). *Животное погибло на 7-е сутки; **животное погибло на 9-е сутки; ***животное погибло на 12-е сутки после аэрогенного инфицирования.

Note. Here and in Table 6: < 200 — concentration of the pathogen in blood is lower than the limit of detection of RT-PCR assay (200 PFU/cm³). *The animal died on the 7^th day; **the animal died on the 9^th day; ***the animal died on the 12^th day after aerogenic infection.

 

Таблица 6. Расчётная концентрация вируса в носоглоточных смывах обезьян, аэрогенно инфицированных вирусом оспы обезьян, БОЕ/см³ [31]

Table 6. Estimated virus concentration in nasopharyngeal washings of monkeys aerogenically infected with monkeypox virus, PFU/cm³ [31]

Инфицирующая доза, БОЕ/м3 Infectious dose, PFU/cm3	Срок после инфицирования, сут | Time after infection, days
	0	2	4	6	8	10	14	18	21
4,2 × 104	< 200	< 200	< 200	2,5 × 103	1,1 × 105	2,5 × 105	3,1 × 105	6,3 × 103	< 200
2,5 × 104	< 200	< 200	< 200	< 200	1,4 × 105	4,1 × 105	4,1 × 104	3,5 × 103	< 200
1,2 × 105	< 200	< 200	< 200	< 200	3,0 × 104	**	–	–	–
2,8 × 105	< 200	< 200	< 200	8,4 × 102	2,1 × 105	**	–	–	–
3,9 × 105	< 200	< 200	3,2 × 102	9,0 × 105	*	–	–	–	–
9,3 × 105	< 200	< 200	5,3 × 103	5,8 × 104	1,9 × 106	4,6 × 106	***	–	–

 

С учётом того, что течение оспы обезьян у яванских макак может моделировать заболевание натуральной оспы человека, можно сделать вывод о том, что вероятность передачи вируса от больного здоровому достигает максимума на 8–10-е сутки (концентрация вируса в носоглоточных смывах имеет наивысшие значения и примерно соответствует концентрации вируса в крови).

Cпециалисты Министерства обороны США совместно с Центром по контролю и профилактике заболеваний США оценивали защитную эффективность вакцин второго поколения (Acam 2000) и третьего поколения (Imvamune). В опытах по аэрогенному инфицированию яванских макак был использован вирус оспы обезьян, штамм Заир 79, инфицирующая доза составляла (2,1–3,1) × 10⁵ БОЕ на животное. Результаты, представленные в табл. 7, свидетельствуют о том, что, несмотря на достоверно не различающийся уровень вируснейтрализующих антител для животных групп 2 и 4, признаки заболевания в группе 4 были выражены в несколько большей степени. Сделан вывод о том, что использование аэрогенного инфицирования яванских макак обеспечивает оценку эффективности различных вакцин, предназначенных для иммунизации людей в тех условиях, когда проведение клинических испытаний не представляется возможным [32]. При этом было установлено, что динамика антителообразования у вакцинированных яванских макак сходна с таковой у вакцинированных людей [33, 34].

 

Таблица 7. Результаты оценки защитной эффективности оспенных вакцин 2-го и 3-го поколения (в отношении вируса оспы обезьян при аэрогенном инфицировании яванских макак) [32]

Table 7. Results of evaluating the protective efficacy of 2^nd and 3^rd generation smallpox vaccines (against monkeypox virus during aerogenic infection of Javan macaques) [32]

Группа Group	Схема иммунизации Immunization process	Характеристика течения заболевания Characterization of the course of the disease
		клинические признаки clinical signs	время появления папул, сут time of papule appearance, days	среднее количество папул average number of papules	продолжительность исчезновения папул, сут duration of papule disappearance, days	доля выживших животных, % survival rate, %
1	Введение буферированного физиологического раствора за 28 сут перед инфицированием (контроль) Administration of buffered saline 28 days before infection (control)	+++	6	51	Не исчезали Didn't disappear	0*
2	Введение Acam2000 однократно в дозе (2,5–12,5) × 105 БОЕ за 28 сут перед инфицированием с помощью скарификации кожи Injection of Acam2000 once at a dose of (2.5–12.5) × 105 PFU 28 days before infection by skin scarification	+	9	3	5	100
3	Подкожное введение Imvamune однократно в дозе 2,0 × 108 ТЦПД50 за 28 сут перед инфицированием Subcutaneous injection of Imvamune once at a dose of 2.0 × 108 TCPD50 28 days before infection	++	9	10	5	67**
4	Подкожное введение Imvamune двукратно в дозе 2,0 × 108 ТЦПД50 за 28 сут перед инфицированием Subcutaneous injection of Imvamune twice at a dose of 2.0 × 108 TCPD50 28 days before infection	+	6	7	5	100

Примечание. ТЦПД₅₀ — 50% тканевая цитопатическая доза. + — лёгкие; ++ — умеренные; +++ — выраженные признаки заболевания. *Животные погибли на 7–11-е сутки; **животные погибли на 7-е и 9-е сутки после аэрогенного инфицирования.

Note. TCPD₅₀ — 50% tissue cytopathic dose. + — mild; ++ — moderate; +++ — expressed signs of disease. *Animals died on the 7^th–11^th day; **Animals died on the 7^th and 9^th day after aerogenic infection.

 

Несмотря на то что вирус оспы коров не относят к потенциальным биологически поражающим агентам, в ведущих зарубежных военно-медицинских центрах, в том числе в Институте инфекционных заболеваний армии США, проводятся исследования с указанным возбудителем. Анализ опубликованных в открытой печати данных указывает на то, что в исследованиях по оценке эффективности имеющихся и вновь разрабатываемых средств неспецифической профилактики в отношении натуральной оспы также используют вирус оспы коров.

Результаты оценки чувствительности белых мышей линии BALB/c к аэрогенному инфицированию вирусом оспы коров (табл. 8) свидетельствуют о том, что аэрогенное инфицирование белых мышей линии BALB/c массой 12 г вирусом оспы коров, штамм Brighton, в дозе 5 × 10⁶ БОЕ вызывает 100% гибель животных.

 

Таблица 8. Результаты оценки чувствительности белых мышей линии BALB/c к аэрогенному инфицированию вирусом оспы коров [35]

Table 8. Results of evaluation of susceptibility of BALB/c white mice to aerogenic infection with cowpox virus [35]

Средняя масса животных, г Average weight of animals, g	Инфицирующая доза, БОЕ Infectious dose, PFU	Признаки заболевания Disease symptoms	Среднее время жизни до гибели, сут Average survival time to death, days	Доля погибших животных, % Percentage of dead animals, %
12	5 × 106	Снижение массы тела, взъерошенная шерсть, значительное снижение функциональной активности Reduced body weight, ruffled coat, significant decrease in functional activity	12	100
	5 × 104	Снижение массы тела, незначительное снижение функциональной активности Decrease in body weight, slight decrease in functional activity	–	0
	5 × 102	Отсутствовали | None	–	0
17	5 × 106	Снижение массы тела и функциональной активности Decrease in body weight and functional activity	12	65

 

Данные о чувствительности инбредных белых мышей к интраназальному и аэрозольному инфицированию различными ОПВ (табл. 9) свидетельствуют о том, что все испытанные вирусы вызывали поражение дыхательных путей. При аэрозольном инфицировании вирусом оспы коров регистрировались также симптомы менингита и экзантемы.

 

Таблица 9. Результаты изучения чувствительности белых мышей к аэрозольному инфицированию вирусами эктромелии, вакцины и оспы коров [16]

Table 9. Results of a study of the susceptibility of white mice to aerosolized infection with ectromelia, vaccinia and cowpox viruses [16]

Вирус Virus	Штамм Strain	Линия белых мышей White mouse line	Способ инфицирования Infection method	Инфицирующая доза, БОЕ Infectious dose, PFU	Симптомы заболевания Disease symptoms
Эктромелии Ectromelia	Hampstead	Аутобредные животные Autobred animals	Интраназально Intranasal	1 × 106	Воспаление бронхов, альвеол, плевры Inflammation of the bronchi, alveoli, pleura
			Аэрозольно Aerosol	1 × 106	Воспаление бронхов, альвеол, плевры Inflammation of the bronchi, alveoli, pleura
Вакцины Vaccines	WR	BALB/c	Интраназально Intranasal	1 × 106	Бронхопневмония с проявлениями некроза Bronchopneumonia with manifestations of necrosis
Оспы коров Cowpox	Brighton	BALB/c	Аэрозольно Aerosol	5 × 106	Бронхопневмония, ринит, синусит, менингит, экзантема Bronchopneumonia, rhinitis, sinusitis, meningitis, exanthema

 

Исследование морфологических изменений в тканях белых мышей линии BALB/c при интраназальном или аэрозольном инфицировании вирусом оспы коров, штамм Brighton (табл. 10) свидетельствует о том, что этот возбудитель является перспективным модельным агентом для проведения скрининговых испытаний средств неспецифической профилактики в отношении натуральной оспы. Это обусловлено тем, что вызываемое им заболевание при аэрозольном способе заражения белых мышей характеризуется разнообразной симптоматикой, а также тем, что данный возбудитель патогенен для человека, что упрощает возможность экстраполяции полученных данных относительно противовирусной эффективности исследуемых лечебных и профилактических препаратов.

 

Таблица 10. Результаты изучения морфологических изменений в тканях белых мышей линии BALB/c при интраназальном или аэрогенном инфицировании вирусом оспы коров, штамм Brighton [24]

Table 10. Results of morphologic changes in tissues of white BALB/c mice during intranasal or aerogenic infection with cowpox virus, Brighton strain [24]

Ткани и органы Tissues and organs	Морфологические изменения Morphologic changes	Способ инфицирования Infection method	Наличие антигена вируса оспы коров в органах Presence of cowpox virus antigen in organs
Лёгкие, бронхи, бронхиолы, альвеолы Lungs, bronchi, bronchioles, alveoli	Воспаление, экзема, некроз, геморрагии, тельца включения Inflammation, eczema, necrosis, hemorrhages, inclusion bodies	Аэрозольно | Aerosol	+
		Интраназально | Intranasal	+
Бронхиолярные сосуды Bronchiolar vessels	Воспаление, некроз, дегенерация, тельца включения Inflammation, necrosis, degeneration, inclusion bodies	Аэрозольно | Aerosol	+
Плевра | Pleura	Воспаление | Inflammantion	Аэрозольно | Aerosol	–
Трахея | Trachea	Воспаление, экзема, некроз, тельца Inflammation, eczema, necrosis, corpuscles	Аэрозольно | Aerosol	+
Назальный тракт Nasal tract	Воспаление, экзема, некроз, геморрагии, тельца включения Inflammation, eczema, necrosis, hemorrhages, inclusion bodies	Аэрозольно | Aerosol	+
		Интраназально | Intranasal	+
Гланды | Glands	Воспаление, экзема, некроз, геморрагии, тельца включения Inflammation, eczema, necrosis, hemorrhages, inclusion bodies	Аэрозольно | Aerosol	+
		Интраназально | Intranasal	+
Соединительные ткани Connective tissues	Воспаление, геморрагии Inflammation, hemorrhages	Аэрозольно | Aerosol	+
		Интраназально | Intranasal	+
Протоки молочных желёз Mammary gland ducts	Воспаление, некроз, тельца включения Inflammation, necrosis, inclusion bodies	Аэрозольно | Aerosol	–
			+
Назофарингеальные протоки Nasopharyngeal ducts	Воспаление, экзема, некроз, геморрагии, тельца включения Inflammation, eczema, necrosis, hemorrhages, inclusion bodies	Интраназально | Intranasal	+
Евстафиева труба Eustathian pipe	Воспаление, тельца включения Inflammation, inclusion bodies	Интраназально | Intranasal	+
Среднее ухо | Middle ear	Воспаление, некроз, геморрагии, тельца включения Inflammation, necrosis, hemorrhages, inclusion bodies	Аэрозольно | Aerosol	+
		Интраназально | Intranasal	–
Мышцы | Muscles	Воспаление, некроз, тельца включения, регенерация тканей Inflammation, necrosis, inclusion bodies, tissue regeneration	Аэрозольно | Aerosol	+
Костный мозг | Bone marrow	Миелогенная гиперплазия Myelogenous hyperplasia	Аэрозольно | Aerosol	–
		Аэрозольно | Aerosol	+
Хвост, кожный покров Tail, skin	Воспаление, некроз, тельца включения, эпидермальная пролиферация Inflammation, necrosis, inclusion bodies, epidermal proliferation	Аэрозольно | Aerosol	–
		Интраназально | Intranasal	+

Примечание. + — выявление меченого вирусного антигена иммуногистологическим методом; – — отсутствие выявления меченого вирусного антигена.

Note. + — detection of labeled viral antigen by immunohistological method; – — No detection of labeled viral antigen.

 

Так, проведено изучение противовирусного действия цидофовира (1-[(S)-3 гидрокси-2]-(фосфонометокси)-пропил цитозин) на модели белых мышей линии BALB/c, аэрогенно инфицированных вирусом оспы коров, штамм Brighton [35]. Данный штамм вызывает бронхопневмонию у мышей BALB/c при аэрогенном инфицировании мелкодисперсным аэрозолем (размер частиц 1 мкм) с последующей гибелью. Подкожное введение цидофовира в дозе 100 мг/кг (однократно) обеспечивало 90–100% защиту аэрогенно инфицированных животных при введении не позднее 4 сут после инфицирования. При введении цидофовира в день инфицирования титр вируса в лёгких уменьшался в 10–100 раз, снижалась выраженность вирусной пневмонии и предотвращались лёгочные кровотечения.

Введение цидофовира не вызывало увеличения концентрации мочевины, креатина, аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотках крови инфицированных и интактных животных. Установлено, что заболевание не развивалось при ежедневном подкожном введении цидофовира в дозах 20,5 и даже 1 мг/кг. При этом важное значение имеет время первого введения препарата. Доза 5 мг/кг защищала практически 100% мышей при введении препарата в день инфицирования. Однако если начало введения препарата было отложено хотя бы на 1 сут, то для защиты животных требовалось ежедневное введение более высоких доз. Значительно более эффективным оказалось аэрозольное применение цидофовира [36, 37]. Результаты определения массы тела, концентрации вируса в лёгких, патологических изменений в лёгких и выживания инфицированных животных установили, что доза цидофовира в диапазоне 0,5–5,0 мг/кг всегда была более эффективной, чем доза 25 мг/кг, и иногда даже более эффективной, чем доза 100 мг/кг, при подкожном введении. Следовательно, противовирусная эффективность цидофовира во многом обусловлена задержкой препарата в респираторном тракте животных. В последующем была определена зависимость противовирусной эффективности цидофовира от схемы его введения в организм белых мышей, аэрогенно инфицированных вирусом оспы коров [37] (табл. 11). На основании полученных результатов авторы исследования сделали вывод о том, что цидофовир при аэрозольном применении может быть эффективным при профилактике или экстренной профилактике натуральной оспы или оспы обезьян.

 

Таблица 11. Результаты изучения противовирусной эффективности цидофовира при аэрозольном или подкожном введении белым мышам линии BALB/c аэрогенно инфицированных вирусом оспы коров, штамм Brighton, в дозе 5 × 10⁶ БОЕ [37]

Table 11. Results of antiviral efficacy of cidofovir when administered by aerosol or subcutaneous injection to BALB/c white mice aerogenically infected with cowpox virus, Brighton strain, at a dose of 5 × 10⁶ PFU [37]

Способ введения препарата Method of drug administration	Доза, мг/кг Dose, mg/kg	Срок введения препарата, сут Period of drug administration, day	Отношение выживших и инфицированных животных Ratio of surviving to infected animals	Доля выживших животных, % Percentage of surviving animals, %	р
Аэрозольно Aerosol	0,5–5,0	–2	8/10	80	< 0,05
		–1	9/10	90	< 0,05
		0	10/10	100	< 0,05
		+1	10/10	100	< 0,05
		+2	9/10	90	< 0,05
	0,06–0,50	–2	0/10	0	Н. д. | N. d.
		–1	7/10	70	< 0,05
		0	10/10	100	< 0,05
		+1	9/10	90	< 0,05
		+2	7/10	70	< 0,05
Подкожно Subcutaneously	100	–2	7/10	70	< 0,05
		–1	7/10	70	< 0,05
		0	10/10	100	< 0,05
		+1	10/10	100	< 0,05
		+2	10/10	100	< 0,05
Плацебо | Placebo		0	0/10	0	–

Примечание. –2 — введение цидофовира за 2 сут до инфицирования; 0 — введение цидофовира в день инфицирования; +2 — введение цидофовира через 2 сут после инфицирования. р — уровень надёжности различий по отношению к варианту опыта с введением плацебо. Н. д. — различия не достоверны.

Note. –2 — administration of cidofovir 2 days before infection; 0 — administration of cidofovir on the day of infection; +2 — administration of cidofovir 2 days after infection. p — reliability level of differences in relation to the experiment variant with placebo administration. N. d. — differences are not reliable.

 

Анализ представленных данных свидетельствует о том, что специалисты Министерства обороны США используют вирус оспы коров в качестве модельного агента для проведения скрининговых испытаний и способов применения неспецифических медицинских средств защиты в отношении натуральной оспы. При обобщении результатов представленных работ можно сделать заключение о двойной направленности проводимых исследований. Так, можно констатировать, что сотрудниками USAMRIID проведено обоснование выбора вирусов оспы кроликов и оспы обезьян в качестве агентных имитаторов вируса натуральной оспы.

При этом данные, полученные в начале 2000-х гг., сопоставляются американскими военными специалистами с результатами, полученными в начале 1960-х гг. с использованием сухого агентного имитатора на основе вируса оспы кроликов [20]. По их мнению, вирус оспы кроликов может моделировать такие характеристики вируса натуральной оспы, как уровень репродукции в различных системах, в том числе в культурах клеток при суспензионном культивировании, устойчивость при переводе в аэрозоль. Величина ЛД₅₀ для кроликов при аэрогенном инфицировании достаточно низка (в отличие от других лабораторных животных при аэрогенном инфицировании другими ОПВ) [19].

При проведении аэробиологических исследований особое внимание уделялось фракционно-дисперсному составу агентного имитатора. Для декларируемых авторами целей проводимых исследований такая конкретизация является явно излишней. В качестве инфицирующего препарата для данных исследований в большинстве работ сотрудников USAMRIID использована непосредственно культура штаммов вирусов оспы обезьян и оспы кроликов. По ряду косвенных признаков (состав жидкостей для пробоотбора, наличие в них различных концентраций пеногасителя, различная концентрация фетальной телячьей сыворотки) можно сделать вывод о том, что реально при проведении ряда аэробиологических испытаний в качестве инфицирующего препарата были использованы вируссодержащие материалы, полученные при выращивании возбудителя в суспензионной культуре клеток.

Выводы

Результаты аэробиологических исследований с ОПВ свидетельствуют о заинтересованности военного ведомства США в проведении экспериментальных работ двойного назначения, включают мониторинг за свойствами ОПВ и возможное изменение их патогенности для человека, выбор оптимальных лабораторных моделей для изучения свойств ОПВ и возможности моделирования свойств вируса натуральной оспы при использовании других ОПВ (вирусы оспы коров, оспы кроликов, оспы обезьян), моделирование основных характеристик заболевания, вызываемого вирусом натуральной оспы, у человека и оценка эффективности имеющихся и вновь разрабатываемых вакцин против натуральной оспы, сравнительное изучение эффективности противовирусных лекарственных средств для профилактики или экстренной профилактики натуральной оспы и оспы обезьян.

¹ World Health Organization. Report of the meeting of the Ad hoc Committee on orthopoxvirus infections (Geneva, 09.09.1994). URL: https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/59062/WHO_CDS_BVI_94.3.pdf?sequence=1

Об авторах

Геннадий Григорьевич Онищенко

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет); Российская академия наук

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0003-0135-7258

д.м.н., профессор, академик РАН, зав. каф. экологии человека и гигиены окружающей среды 

Россия, Москва; Москва

Игорь Анатольевич Кириллов

Управление начальника войск радиационной, химической и биологической защиты Вооруженных Сил Российской Федерации

Email: 48cnii@mil.ru

канд. воен. наук, начальник войск радиационной, химической и биологической защиты 

Россия, Москва

Сергей Владимирович Борисевич

Российская академия наук; 48 Центральный научно-исследовательский институт

Автор, ответственный за переписку.
Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6742-3919

д.б.н., профессор, академик РАН, начальник

Россия, Москва; Сергиев Посад-6

Татьяна Евгеньевна Сизикова

48 Центральный научно-исследовательский институт

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-1817-0126

к.б.н., с.н.с. научно-исследовательского отдела 

Россия, Сергиев Посад-6

Виктор Тимофеевич Кротков

48 Центральный научно-исследовательский институт

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-7674-2321

к.м.н., с.н.с. научно-исследовательского отдела

Россия, Сергиев Посад-6

Список литературы

Дополнительные файлы