Отправить статью по E-mail Схема мультилокусного секвенирования-типирования для характеристики Borrelia miyamotoi — возбудителей безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза
- Авторы: Миронов К.О.1, Титков А.В.1, Кулешов К.В.1, Платонов А.Е.1
-
Учреждения:
- Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
- Выпуск: Том 101, № 1 (2024)
- Страницы: 80-88
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18555
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-419
- EDN: https://elibrary.ru/wjphcn
- ID: 18555
Цитировать
Аннотация
Введение. Borrelia miyamotoi — возбудитель безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ-БМ) — широко распространённого в России заболевания. В настоящее время не существует общепринятых методик для внутривидовой характеристики B. miyamotoi. Схема мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) боррелий изначально была разработана для B. burgdorferi и не обладает необходимой дискриминирующей способностью для мониторинга возбудителей ИКБ-БМ.
Цель работы — разработка и апробация схемы МЛСТ B. miyamotoi.
Материалы и методы. Выбор фрагментов для МЛСТ основан на полногеномных последовательностях 10 референсных штаммов (GenBank). Схему МЛСТ разработали в соответствии с принципами, опубликованными авторами метода. Для апробации схемы МЛСТ использовали 81 биологический образец, содержащий ДНК B. miyamotoi.
Результаты. После анализа геномных данных выбрали 8 фрагментов генов, для которых провели дизайн праймеров для ПЦР и секвенирования. Фрагменты генов представлены несколькими аллелями (от 4 до 7), которые образуют 15 сиквенс-типов, на основании анализа которых охарактеризовали генетическое разнообразие возбудителей, выделенных от больных ИКБ-БМ и от переносчиков.
Обсуждение. На основании количества несовпадений в аллельных профилях сиквенс-типы могут быть классифицированы на 4 группы. Первым двум соответствуют клональные комплексы, две другие образованы однократно выявленными сиквенс-типами. Первый клональный комплекс (I) объединяет 11 сиквенс-типов (80 или 88% охарактеризованных B. miyamotoi), второй (II) — 2 сиквенс-типа (9 или 9,8%). Выраженные генетические отличия B. miyamotoi связаны с источниками штаммов и биологических образцов. Предложенная на основании МЛСТ классификация подтверждает продемонстрированную ранее генетическую гетерогенность популяций B. miyamotoi, обусловленную экологически не связанными переносчиками возбудителей ИКБ-БМ.
Заключение. Предложенная схема МЛСТ является удобным инструментом для мониторинга возбудителей ИКБ-БМ, выделенных из разных источников, и для характеристики эволюционных изменений в определённых клональных комплексах.
Полный текст
Введение
Borrelia miyamotoi — возбудитель безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ-БМ), принадлежащий к группе возбудителей возвратных лихорадок, но передающийся клещами рода Ixodes. История открытия, таксономия, биологические свойства возбудителей, аспекты патогенеза, клиники и эпидемиологии ИКБ-БМ опубликованы в монографии А.Е. Платонова в 2017 г. [1]. Актуальным направлением исследований B. miyamotoi является разработка способов внутривидовой классификации возбудителей. Это обусловлено как необходимостью изучения клинических особенностей ИКБ-БМ, вызванных различными генетическими вариантами возбудителя, в том числе связанными с феноменом «иммунного избегания» [1], так и необходимостью решения классических эпидемиологических задач, направленных на мониторинг возбудителей. В связи с сильно ограниченным использованием массового параллельного секвенирования, которое связано в первую очередь со сложностью культивирования B. miyamotoi, а также с низкой концентрацией возбудителей в образцах биологического материала, возникает необходимость в разработке доступных, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и фрагментном секвенировании методик антигенной и генетической характеристики возбудителей ИКБ-БМ.
Для характеристики антигенного разнообразия B. miyamotoi нами предложена методика определения основных поверхностных белков [2, 3], которая позволяет проводить одновременную детекцию нескольких антигенных вариантов и определять наиболее клинически и эпидемиологически значимые варианты возбудителей ИКБ-БМ, циркулирующие на территории России. В то же время определение антигенов не может быть использовано для изучения эволюционных процессов, происходящих в бактериальной популяции, для выявления возбудителей с повышенными вирулентными или патогенными свойствами.
Предложенная ранее отечественными исследователями трёхлокусная схема типирования на основании секвенирования фрагментов генов p66, glpQ и 16S [4] может быть использована для характеристики представителей рода Borrelia, однако данная схема не обладает необходимой дискриминирующей способностью для B. miyamotoi.
Удобным инструментом изучения генетических свойств возбудителей, не находящихся под давлением иммунной системы, позволяющим идентифицировать отдельные штаммы и проводить характеристику их генетических взаимоотношений, является метод мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ), успешно применяющийся в эпидемиологической практике с 1998 г. [5, 6]. Помимо неоднократно продемонстрированных ранее преимуществ использования нескольких генетических локусов в анализе генетических взаимоотношений патогенов, важным преимуществом МЛСТ является абсолютная межлабораторная воспроизводимость результатов, что позволяет объединять генетическую и эпидемиологическую информацию в единой базе данных [7]. В настоящее время Интернет-ресурс PubMLST содержит информацию о схемах МЛСТ для более чем 130 видов микроорганизмов; для многих видов опубликованные схемы МЛСТ являются «золотым стандартом» их внутривидовой характеристики. В то же время разработанная схема МЛСТ для бактерий рода Borrelia и её модификации1 не обладают достаточной дискриминирующей способностью, необходимой для дифференциации B. miyamotoi. Это связано с тем, что схема МЛСТ изначально была разработана для B. burgdorferi [8], что не позволяет использовать её для мониторинга российских возбудителей ИКБ-БМ. Поскольку геном B. miyamotoi имеет значительные отличия от бактерий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, возникает необходимость в проведении дополнительного анализа имеющихся полногеномных последовательностей с целью создания и апробации методики МЛСТ B. miyamotoi.
Материалы и методы
Нуклеотидные последовательности
При выборе последовательностей для проведения МЛСТ использовали полногеномные последовательности 6 российских штаммов — Izh-4 (идентификационный номер в GenBank CP024390.2, номер в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» B-8324), Izh-5 (CP024205.2, B-8325), Izh-14 (CP024371.2, B-8326), Izh-16 (CP024351.2, B-8327), Yekat-1 (CP024333.2, B-8328), Yekat-6 (CP024316.2, B-8329) [1, 9] и 4 зарубежных штаммов — FR64b (CP004217.2), HT-31 (CP114703.1), LB-2001 (CP114690.1) и CA17-2241 (CP021872.1) [1, 10, 11], известных на момент начала исследования.
Штаммы и образцы биологического материала
При разработке схему МЛСТ апробировали на 7 штаммах: NL-IR-1 (CP044783.1), Yekat-18 (CP037471.1, B-8810), Yekat-76 (CP037058.1, B-8814), Yekat-19 (CP036557.1, B-8811), Yekat-17 (CP037215.2, B-8330), Yekat-21 (CP036914.2, B-8812), Yekat-31 (CP036726.1, B-8813) и 81 образцах ДНК B. miyamotoi, выделенных в 2012–2022 гг. из 50 клещевых суспензий и крови 31 больного ИКБ-БМ. Клещевые суспензии получили из клещей-переносчиков рода Ixodes, собранных в странах Западной Европы и европейских регионах России (I. ricinus), а также центральных и восточных регионах России (I. persulcatus). Бóльшую часть биологических образцов получили и охарактеризовали при разработке методики для определения антигенных свойств основных поверхностных белков B. miyamotoi [2]. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (протокол № 83 от 26.06.2018).
Дополнительно провели исследование 9 штаммов, полногеномные последовательности которых были использованы для выбора МЛСТ-локусов. Характеристика 10 референсных штаммов и 81 образца биологического материала приведена в табл. 1.
Таблица 1. Источники ДНК B. miyamotoi и их генетическая характеристика (сиквенс-тип и клональный комплекс)
Table 1. The B. miyamotoi DNA samples sources and their genetic characteristics (sequence types and clonal complex)
Источник ДНК DNA source | Сиквенс-тип Sequence type | Клональный комплекс Сlonal complex | Территория Territory | Годы Years | Количество образцов Number of samples |
Кровь больных ИКБ-БМ (n = 37) Blood of patients with ixodid tick-borne borreliosis caused by B. miyamotoi (n = 37) | ST-1* | I | Свердловская область | Sverdlovsk Region Удмуртская Республика | Udmurt Republic | 2016–2018 2016 | 19 1 |
ST-2* | I | Свердловская область | Sverdlovsk Region Удмуртская Республика | Udmurt Republic | 2017 2016 | 2 1 | |
ST-3 | I | Удмуртская Республика | Udmurt Republic | 2016 | 1 | |
ST-4 | I | Свердловская область | Sverdlovsk Region | 2016 | 1 | |
ST-5* | I | Удмуртская Республика | Udmurt Republic | 2016 | 1 | |
ST-12* | I | Свердловская область | Sverdlovsk Region Красноярский край | Krasnoyarsk Territory | 2017 2017 | 1 1 | |
ST-13 | I | Свердловская область | Sverdlovsk region | 2017 | 1 | |
ST-14* | I | Новосибирская область | Novosibirsk Region Хабаровский край | Khabarovsk Territory Свердловская область | Sverdlovsk Region Красноярский край | Krasnoyarsk Territory | 2012 2012 2017 2017, 2019 | 1 2 2 3 | |
Суспензии клещей рода Ixodes (n = 54) Suspensions of ticks of Ixodes genus (n = 54) | ST-1* | I | Новосибирская область | Novosibirsk Region Свердловская область | Sverdlovsk Region Самарская область | Samara Region Омская область | Omsk Region | 2014, 2017 2013–2014 2019 2022 | 4 3 1 5 |
ST-2* | I | Республика Алтай | Altai Republic Самарская область | Samara Region | 2016 2019 | 1 1 | |
ST-5* | I | Омская область | Omsk Region | 2022 | 1 | |
ST-6 | I | Япония | Japan | 1992 | 1 | |
ST-7 | I | Япония | Japan | 1990 | 1 | |
ST-8 | – | Коннектикут, США | Connecticut, USA | 2001 | 1 | |
ST-9 | – | Калифорния, США | California, USA | 2015 | 1 | |
ST-10 | II | Нидерланды | Netherlands Чехия | Czech Republic Кабардино-Балкарская Республика Kabardino-Balkarian Republic | 2018 2019 2021 | 1 6 1 | |
ST-11 | II | Кабардино-Балкарская Республика Kabardino-Balkarian Republic | 2021 | 1 | |
ST-12* | I | Новосибирская область | Novosibirsk Region Омская область | Omsk Region | 2017 2022 | 4 3 | |
ST-14* | I | Республика Алтай | Altai Republic Амурская область | Amur Region Новосибирская область | Novosibirsk Region Омская область | Omsk Region | 2016 2016 2017 2022 | 6 1 9 1 | |
ST-15 | I | Томская область | Tomsk Region | 2014 | 1 | |
Примечание. *ST найдены как в образцах от пациентов, так и в клещах. Note. *Sequence types found both in patient samples and ticks. | |||||
ПЦР и секвенирование
Выделение ДНК, постановку ПЦР проводили с использованием реагентов производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Амплификацию и секвенирование фрагментов генов выполняли с праймерами (табл. 2) по программе: 95ºС — 15 мин (1 цикл), 95ºС — 10 с, 60ºС — 20 с, 72ºС — 20 с (40 циклов). Методики постановки ПЦР и секвенирования, проведённого с помощью оборудования и реагентов компании «Applied Biosystems», были аналогичны методикам, использованным ранее [2, 12].
Таблица 2. Фрагменты генов для МЛСТ и праймеры для ПЦР и секвенирования
Table 2. Fragments of genes for MLST, PCR and sequencing primers
Фрагмент гена Fragment name | Белок Protein* | 5'–3' последовательности праймеров 5’-3’ primer sequences | Длина ПЦР- продукта, п.о. The length of the PCR products, bp | Длина МЛСТ- локуса**, п.о. The length of the MLST loci, bp |
acpS | ACP-синтаза holo-ACP synthase | gACgAAATCAATAggATgTgATATAATAAAggT CTATTACAAATgCAATAgAgTACTCCCTTTCA | 365 | 192 |
nusB | Фактор антитерминации транскрипции Transcription antitermination factor NusB | ggATTTAAgACATAAggCTAgAgTTTTAgCTTTTC gAgCTCTCCATATTTTTTAACAAAgCATCAAg | 417 | 380 |
motB | Моторный белок Flagellar motor protein MotB | CCTgAATATATgTTgACATATggAgACATggTT CCTgCAAATCCAgATACCTCAAATTTACTC | 623 | 413 |
dnaX | ДНК-полимераза III DNA polymerase III subunit gamma/tau | CTgCTATTAAgAAgCgTCCCAgAgAT CTgATCAAAAAgAgTATAAgCATCCCTTACAC | 653 | 560 |
rplP | 50S-рибосомальный белок 50S ribosomal protein L16 | gTATAgAAAgAAgCAAAgAggAAgACTgTCA CACCTCAAATCTCgCCTTATCACAAATATAg | 393 | 269 |
сdd | Цитидиндезаминаза Cytidine deaminase | GAAGCTGCAAGAAATAATGCATATTCACCAT GCTGCATAATCCTATTATTTGTAAAGATAGC | 620 | 233 |
lysM | Пептидогликансвязывающий домен LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein | gACTTgATCCTggTgCTATTgTTAAAgCTAg CCCgATCTCTAAgCTTAgAAgATCTAATTgC | 624 | 522 |
miaA | Изопентилпирофосфаттрансфераза tRNA (adenosine(37)-N6)-dimethylallyltransferase MiaA | TCCTACgggTgTAggTAAAAgTgACATT CCTCTTCAAgCAATCCACAATCAATC | 626 | 555 |
Примечание. *Приведено обозначение продукта гена из базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). **Нуклеотидные позиции фрагментов МЛСТ-локусов референсных штаммов указаны в табл. 3.
Note. *The designation of the protein from NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). **The nucleotide positions of MLST loci in the reference strains were presented in the Table 3.
Анализ данных МЛСТ
Обработку результатов секвенирования с обозначением аллелей и сиквенс-типов (sequence type, ST) проводили в соответствии с требованиями разработчиков метода [5–7]. Анализ ST с использованием алгоритмов BURST и UPGMA, а также построение генетического дерева выполнены с помощью программы «START2 v. 1.0.5» [13].
Результаты
В соответствии с принципами МЛСТ выбор фрагментов ДНК для обозначения аллелей (МЛСТ-локусов) был подчинён следующим условиям: фрагменты должны находиться в несцепленных генах, расположенных на хромосоме, и должны быть представлены несколькими аллелями, при этом комбинации аллелей должны обеспечивать возможность проведения внутривидовой классификации возбудителей [5, 6]. Анализ полногеномных последовательностей 6 штаммов позволил выделить несколько десятков групп несцепленных генетических локусов, из которых последовательно были выбраны 8 (табл. 2), позволяющие дифференцировать эпидемиологически не связанные, т.е. выделенные в разное время, на разных территориях и от разных источников штаммы. В табл. 3 представлены предложенные нами обозначения аллелей и аллельные профили, которые определяют ST штаммов и ДНК B. miyamotoi в биологических образцах. Для обозначения аллелей приведены координаты МЛСТ-локусов в полногеномных нуклеотидных последовательностях референсных штаммов, за исключением аллелей nusB-6 и lysM-7, для которых приведены идентификационные номера в базе данных GenBank. Отличия в МЛСТ-локусах представлены однонуклеотидными заменами, за исключением фрагмента nusB, для которого выявили 2 аллеля (nusB-4 и nusB-6 в аллельных профилях ST-10 и ST-11), содержащие инсерцию 6 нуклеотидов.
Таблица 3. Обозначения аллелей и ST
Table 3. Designations of alleles and sequence types
Источник ДНК DNA source | Фрагменты (длина, п.о.)*** | Fragments (lenght, bp)*** | ST Sequence type | ||||||||
acpS (192) | nusB (380, 386) | motB (413) | dnaX (560) | rplP (269) | сdd (233) | lysM (522) | miaA (555) | |||
Штаммы** Strains** | Yekat-1* | 1 896361–896170 | 1 800974–801353 | 1 613232–613644 | 1 423437–423996 | 1 404829–405097 | 1 265228–265460 | 1 253627–254148 | 1 37083–37637 | ST-1 |
Izh-14 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 404724–404992 | 1 | 1 | 1 | ST-2 | |
Izh-4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 253612–254133 | 2 37068–37622 | ST-3 | |
Yekat-6 | 1 | 2 800953–801332 | 2 613211–613623 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ST-4 | |
Izh-5 | 2 896194–896385 | 1 | 1 | 2 423437–423996 | 1 | 2 265228–265460 | 1 | 1 | ST-5 | |
FR64b | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 3 650921–651442 | 1 | ST-6 | |
HT31 | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 3 37098–37652 | ST-7 | |
LB-2001 | 3 897013–897204 | 3 801812–802191 | 3 613265–613677 | 3 423552–424111 | 3 404960–405228 | 3 265566–265798 | 4 253956–254477 | 4 37153–37707 | ST-8 | |
CA17-2241 | 5 10054–10245 | 5 105075–105454 | 5 292933–293345 | 6 482530–483089 | 5 501393–501661 | 5 640132–640364 | 6 651447–651968 | 6 868175–868729 | ST-9 | |
NL-IR-1 | 4 893710–893901 | 4 798494–798879 | 4 611883–612295 | 4 422636–423195 | 4 404082–404350 | 4 265475–265707 | 5 253875–254396 | 5 37104–37658 | ST-10 | |
Образцы ДНК DNA samples | 136_KBR21 | 4 | 6 | 4 | 4 | 4 | 4 | 5 | 5 | ST-11 |
Bal_Y17 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ST-12 | |
Sha_Y17 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | ST-13 | |
4426_Y17 | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | ST-14 | |
2154_T14 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 7 | 1 | ST-15 | |
Примечание. *Штамм Izh-16 отнесен к ST-1. **Аллели и ST первых 9 штаммов обозначены на основании анализа полногеномных последовательностей при выборе МЛСТ-локусов, аллельные профили штамма NL-IR-1 и образцов ДНК получены при апробации схемы МЛСТ. ***Для уникальных аллелей обозначены нуклеотидные позиции МЛСТ-локусов относительно референсных последовательностей штаммов, указанных в разделе «Материалы и методы». Аллели nusB-6 и lysM-7 имеют идентификационные номера в базе данных GenBank OR192576 и OR134830 соответственно.
Note. *The Izh-16 strain is assigned to ST-1. **Alleles and sequence types of the first nine strains were designated based on the whole genome sequences, allelic profiles of the NL-IR-1 strain and isolates were obtained by testing the MLST scheme. ***For the unique alleles the nucleotide positions of MLST loci in the reference strains sequences described in Material and Methods section are indicated. The alleles nusB-6 and lysM-7 have identification numbers in the GenBank database OR192576 and OR134830, respectively.
При разработке схемы МЛСТ in silico были найдены 9 ST у 10 штаммов. Для 9 штаммов провели секвенирование фрагментов генов, вошедших в схему МЛСТ, при этом дискордантных результатов при сравнении с данными полногеномного секвенирования, представленными в GenBank, не выявлено. При последующем анализе нуклеотидных последовательностей образцов ДНК найдены ещё 6 ST, из которых 2 образованы двумя новыми аллелями и 4 — новыми сочетаниями ранее выявленных аллелей. Наиболее часто в изученной выборке встречались ST-1 (33; 36%) и ST-14 (25; 27,4%), реже — ST-12 (9; 10%), ST-10 (8; 9%), ST-2 (5; 5,5%) и ST-5 (2; 2,2%). ST-3, ST-4, ST-6, ST-7, ST-8, ST-9, ST-11, ST-13 и ST-15 встречались однократно (по 1,1%).
На рисунке представлена дендрограмма, иллюстрирующая генетические взаимоотношения ST. Дендрограмма и результаты, представленные в табл. 1, объединяют данные о 91 представителе вида B. miyamotoi из разных источников.
Генетические взаимоотношения ST, найденные внутри вида B. miyamotoi, определённые на основании количества несовпадений в аллельных профилях (алгоритм UPGMA). В скобках приведено обозначение источников ДНК для ST, найденных однократно. Римская цифра — обозначение клональных комплексов.
Genetic relationships of sequence types within the B. miyamotoi species based on allelic profiles differences (the UPGMA algorithm). The number in parentheses is the strain or isolates name for the sequence types found once. The Roman numeral is the designation of clonal complexes.
Обсуждение
Представленные на рисунке генетические взаимоотношения B. miyamotoi, определённые на основании анализа количества несовпадений в аллельных профилях, позволяют классифицировать обозначенные ST на 4 группы. Первым 2 группам соответствуют клональные комплексы, обозначенные на рисунке как I и II, 2 другие группы образованы ST-8 и ST-9, которые имеют отличия по всем 8 локусам друг от друга и от остальных ST.
Первый клональный комплекс (I) объединяет 11 ST, которым соответствуют 80 (88%) охарактеризованных штаммов и образцов ДНК. ST-14 может быть обозначен как центральный, поскольку соответствующий ему аллельный профиль имеет максимальное количество несовпадений по 1 МЛСТ-локусу от аллельных профилей других ST этого клонального комплекса, равное 4. Второй клональный комплекс (II) образован ST-10 и ST-11, найденными у 8 (8,7%) образцов ДНК и 1 (1,1%) штамма. Аллельные профили ST-10 и ST-11 имеют несовпадения по 1 МЛСТ-локусу и отличаются от аллельных профилей ST I клонального коплекса по всем 8 МЛСТ-локусам.
В табл. 1 представлены ST и характеристика источников ДНК B. miyamotoi. Большинство охарактеризованных образцов ДНК имеют ST, найденные как в выборках образцов от пациентов ИКБ-БМ, так и в суспензиях клещей. Однократно найденные у возбудителей ИКБ-БМ ST-3, ST-4 и ST-13 и обнаруженные в суспензиях клещей ST-6, ST-7, ST-11 и ST-15 не позволяют делать вывод об особенностях генотипов, ассоциированных со случаями заболевания ИКБ-БМ. Предположительно все представители I клонального комплекса, найденные в переносчиках, могут вызывать ИКБ-БМ.
Выраженные генетические отличия охарактеризованных B. miyamotoi связаны с источниками ДНК B. miyamotoi. Все входящие в I клональный комплекс возбудители выделены из суспензий клещей вида I. persulcatus, полученных на территории России. Также в I клональный комплекс входят штаммы FR64b и HT31, выделенные на территории Японии из того же вида переносчиков. Входящие во II клональный комплекс ST были найдены в суспензиях клещей вида I. ricinus, полученных из европейских стран и в Кабардино-Балкарской Республике. B. miyamotoi ST-8 и ST-9 выделены из клещей видов I. scapularis и I. pacificus соответственно, распространённых в Северной Америке.
Таким образом, предложенная на основании МЛСТ классификация подтверждает продемонстрированную ранее генетическую гетерогенность популяций B. miyamotoi, соответствующих азиатскому (клональный комплекс I), европейскому (клональный комплекс II) и американскому (ST, не входящие в клональные комплексы I и II) генотипам [1, 14, 15], циркулирующим на разных континентах, что связано с экологически не связанными переносчиками возбудителей.
Заключение
В данном исследовании на основании имеющихся полногеномных данных разработана схема МЛСТ, позволяющая дифференцировать возбудителей ИКБ-БМ, собранных на разных территориях. На примере распределения ST I клонального комплекса можно сделать вывод о наиболее распространённых вариантах B. miyamotoi, циркулирующих на территории России и некоторых зарубежных стран. Данный подход может стать удобным инструментом для мониторинга возбудителей ИКБ-БМ и характеристики эволюционных изменений в описанных клональных комплексах. Применение МЛСТ предполагает исследование образцов биологического материала после качественного обнаружения ДНК B. miyamotoi или получения культуры возбудителя. В связи со сложностью культивирования B. miyamotoi основная масса возбудителей ИКБ-БМ может быть охарактеризована с использованием МЛСТ и только незначительная часть — с использованием полногеномного секвенирования, которое на современном этапе необходимо для исчерпывающего анализа эволюционных изменений, происходящих в бактериальных популяциях.
Дальнейшие исследования должны быть направлены на расширение выборки охарактеризованных изолятов, в том числе валидацию разработанной схемы МЛСТ in silico с использованием информации о нуклеотидных последовательностях, опубликованных в GenBank, а также на поиск возможных связей описанных ST и антигенных вариантов B. miyamotoi, определяемых на основе данных типирования основных поверхностных белков [2]. После расширенной апробации предлагаемой схемы МЛСТ может быть рассмотрена возможность объединения всех полученных данных в общую базу данных, аналогично существующим стандартам для внутривидовой характеристики других патогенов [7].
1 URL: https://pubmlst.org/organisms/borrelia-spp
Об авторах
Константин Олегович Миронов
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Автор, ответственный за переписку.
Email: mironov@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0001-8207-9215
д.м.н., зав. лаб. молекулярных методов изучения генетических полиморфизмов Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия, МоскваАнтон Владимирович Титков
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Email: mironov@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0001-7548-9267
н.с. лаб. эпидемиологии природно-очаговых инфекций Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия, МоскваКонстантин Валерьевич Кулешов
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Email: mironov@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0002-5238-7900
к.б.н., зав. лаб. молекулярной диагностики и эпидемиологии кишечных инфекций Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия, МоскваАлександр Евгеньевич Платонов
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Email: mironov@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0001-7450-0081
д.б.н., проф., г.н.с. лаб. эпидемиологии природно-очаговых инфекций Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия, МоскваСписок литературы
- Платонов А.Е. «Новая» инфекция, вызываемая Borrelia miyamotoi: микробиология, эпидемиология, диагностика, клиника и патогенез. М.;2017. Platonov A.E. A «New» Infection Caused by Borrelia miyamotoi: Microbiology, Epidemiology, Diagnostics, Clinic and Pathogenesis. Moscow;2017. EDN: https://elibrary.ru/yabrqr
- Миронов К.О., Титков А.В., Кулешов К.В. и др. Разработка и практическое применение методики для идентификации поверхностных антигенов Borrelia miyamotoi. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021;98(3):339–50. Mironov K.O., Titkov A.V., Kuleshov K.V., et al. Development and application of the technique for identification of Borrelia miyamotoi surface antigens. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2021;98(3):339–50. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-142 EDN: https://elibrary.ru/kmeswh
- Миронов К.О., Титков А.В., Платонов А.Е. Комплекс молекулярно-биологических методик для внутривидовой характеристики бактерий вида Borrelia miyamotoi. Национальные приоритеты России. 2021;42(3):208–11. Mironov K.O., Titkov A.V., Platonov A.E. Complex of molecular biological techniques for Borrelia miyamotoi typing. National Priorities of Russia. 2021;42(3):208–11. EDN: https://elibrary.ru/kmeswh
- Фоменко Н.В., Боргояков В.Ю., Панов В.В. Генетические особенности ДНК боррелий вида Borrelia miyamotoi, выявляемых в таежных клещах. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011;(2):12–7. Fomenko N.V., Borgoyakov V.Yu., Panov V.V. Genetic features of DNA of Borrelia miyamotoi transmitted by Ixodes persulcatus. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2011;(2):12–7. EDN: https://elibrary.ru/nwewlr
- Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998;95(6):3140–5. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.95.6.3140
- Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Платонова О.В. Мультилокусное секвенирование – новый метод генотипирования бактерий и первые результаты его применения. Генетика. 2000;36(5):597–605. Platonov A.E., Shipulin G.A., Platonova O.V. Multilocus sequence typing: a new method and the first results in the genotyping of bacteria. Genetika. 2000;36(5):597–605. EDN: https://elibrary.ru/mpfxxb
- Jolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 2018;3:124. DOI: https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.14826.1
- Margos G., Gatewood A.G., Aanensen D.M., et al. MLST of housekeeping genes captures geographic population structure and suggests a European origin of Borrelia burgdorferi. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008;105(25):8730–5. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0800323105
- Kuleshov K.V., Koetsveld J., Goptar I.A., et al. Whole-genome sequencing of six Borrelia miyamotoi clinical strains isolated in Russia. Genome Announc. 2018;6(1):e01424-17. DOI: https://doi.org/10.1128/genomeA.01424-17
- Fukunaga M., Takahashi Y., Tsuruta Y., et al. Genetic and phenotypic analysis of Borrelia miyamotoi sp. nov., isolated from the ixodid tick Ixodes persulcatus, the vector for Lyme disease in Japan. Int. J. Syst. Bacteriol. 1995;45(4):804–10. DOI: https://doi.org/10.1099/00207713-45-4-804
- Kingry L.C., Replogle A., Dolan M., et al. Chromosome and large linear plasmid sequences of a Borrelia miyamotoi strain isolated from Ixodes pacificus ticks from California. Genome Announc. 2017;5(37):e00960-17. DOI: https://doi.org/10.1128/genomeA.00960-17
- Миронов К.О., Платонов А.Е., Королева И.С., Шипулин Г.А. Анализ московской популяции штаммов Neisseria meningitidis методом мультилокусного секвенирования-типирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006;93(2):31–6. Mironov K.O., Platonov A.E., Koroleva I.S., Shipulin G.A. Analysis of the Moscow population of Neisseria meningitidis strains by the method of multilocus sequencing-typing. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2006;93(2):31–6. EDN: https://elibrary.ru/htqatx
- Jolley K.A., Feil E.J., Chan M.S., Maiden M.C. Sequence type analysis and recombinational tests (START). Bioinformatics. 2001;17(12):1230–1. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/17.12.1230
- Platonov A.E., Karan L.S., Kolyasnikova N.M., et al. Humans infected with relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2011;17(10):1816–23. DOI: https://doi.org/10.3201/eid1710.101474 EDN: https://elibrary.ru/pbdedx
- Crowder C.D., Carolan H.E., Rounds M.A., et al. Prevalence of Borrelia miyamotoi in Ixodes ticks in Europe and the United States. Emerg. Infect. Dis. 2014;20(10):1678–82. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2010.131583
Дополнительные файлы
