Генотипический портрет SARS-CoV-2 на территории Приморского края в период пандемии COVID-19

Полный текст

Введение

Коронавирусное заболевание 2019 г. (Coronavirus disease 2019 — COVID-19) этиологически связано с коронавирусом тяжёлого острого респираторного синдрома 2-го типа (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 — SARS-CoV-2; Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus) [1, 2] и возникло в результате преодоления возбудителем межвидового барьера и проникновения из популяций летучих мышей (Chiroptera, Microchiroptera) в человеческую популяцию [3, 4]. COVID-19 вызвал наиболее продолжительную (11.03.2020–05.05.2023, или 1150 дней), наиболее масштабную (свыше 750 млн подтверждённых случаев) и одну из самых смертоносных (порядка 6 млн летальных исходов) пандемий острого респираторного заболевания в истории человечества [3, 5]. Пандемия COVID-19 стала первой, связанной с коронавирусом рукокрылых (Chiroptera) [1, 6] — второго по массовости после грызунов отряда млекопитающих, обладающих рядом уникальных эволюционных особенностей [7–9], эпидемиологическое значение которых стало понятно лишь в начале XXI в. после эпидемий, вызванных коронавирусами тяжёлого острого респираторного синдрома (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus) [1, 10] и Ближневосточного респираторного синдрома (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Merbecovirus) [11, 12].

Пандемия COVID-19 стимулировала широкое внедрение молекулярно-генетических [13, 14] и информационных [15, 16] технологий в практику противоэпидемических мероприятий. В условиях деградации широких международных связей в начале 2020-х гг., усугубившейся пандемией, и падения авторитета международных организаций, включая Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ), Российская Федерация была вынуждена развернуть собственную национальную платформу молекулярно-генетических данных — Virus genome aggregator of Russia (VGARus), разработанную Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор). VGARus была введена в эксплуатацию на базе Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Распоряжением Правительства РФ № 448 от 23.03.2021. К концу 2023 г. в системе зарегистрировано более 150 организаций, осуществляющих её пополнение; в базе данных содержатся свыше 300 тыс. нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2, из которых более половины — полноразмерные вирусные геномы [14, 17]. Таким образом, в отличие даже от последней пандемии гриппа А (H1N1 pdm09) (Articulavirales: Orthomyxoviridae, Alphainfluenzavirus) (2009–2010 гг.) [18], когда молекулярно-генетические методы активно использовались для контроля инфекционного процесса, пандемия COVID-19 стала первым глобальным эпидемическим процессом, который детально характеризовался с помощью данных полногеномного секвенирования «в режиме реального времени» (по крайней мере — в развитых странах) [14, 17, 19].

Россия, имеющая самую большую в мире территорию, обладает колоссальным региональным разнообразием природно-климатических и социально-демографических условий, что необходимо учитывать в процессе эпидемиологического анализа динамики инфекционных заболеваний. Например, Приморский край (ПК), расположенный на крайнем юге российского Дальнего Востока (практически — на широте Крымского полуострова), характеризуется уникальным муссонным умеренным климатом, формируемым широтной климатической аномалией вследствие проникновения из Татарского пролива холодного Приморского течения. ПК обеспечивает удобный выход через незамерзающие порты (Владивосток, Восточный, Зарубино, Находка, Посьет) к динамично развивающемуся Азиатско-Тихоокеанскому региону и традиционно тесно связан с северо-восточными провинциями Китайской Народной Республики всеми видами транспорта. Административный центр ПК Владивосток, являющийся столицей Дальневосточного федерального округа, хорошо узнаваем как в России, так и за её пределами благодаря статусу свободного порта и наличию одного из крупнейших в азиатской части страны Дальневосточного федерального университета.

Цель работы — молекулярно-генетический анализ закономерностей развития эпидемического процесса COVID-19 на территории ПК в период пандемии этого заболевания (2020–2023 гг.).

Материалы и методы

Назофарингеальные смывы для проведения ПЦР-тестирования и получения вирусных штаммов отбирали у лиц, проживавших на территории ПК. Отбор биологического материала осуществлялся квалифицированным персоналом, прошедшим предварительное обучение и регулярную проверку навыков на риноларингологических симуляторах [20, 21]. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова (протокол № 2 от 16.11.2021).

Индикация РНК SARS-CoV-2 осуществлялась с помощью метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ): выделение РНК проводили с использованием комплекса реагентов «М-Сорб-НК» (НПФ «Синтол») ручным способом или (при больших количествах образцов) на автоматической станции «AutoPure 96» («Hangzhou Allsheng Instruments Co.»), набора реагентов «ОТ-ПЦР-РВ-SARS-CoV-2» (НПФ «Синтол»). Положительные образцы, предназначенные для последующего использования в исследовательских целях, хранились при –20ºС без разрыва холодовой цепи.

Секвенирование полноразмерного генома SARS-CoV-2 проводили для положительных образцов с пороговым циклом при первичном ПЦР-тестировании С_t ≤ 25 на технологической платформе Nanopore [22, 23] согласно протоколу ARTIC SARS-CoV-2 v3: обратную транскрипцию осуществляли с помощью набора «Midnight RT-PCR Expansion»; ампликоны получали и кодировали с использованием 29 пар перекрывающихся праймеров и «Rapid Barcoding Kit 96» (SQK-RBK110.96); очистку кДНК проводили на магнитных частицах «AMPure XP beads»; полученные геномные библиотеки секвенировали на приборе «MinION» с использованием ячеек «FLO-MIN106 R9.4.1» («Oxford Nanopore Technologies»). Полученные данные в формате FAST5 (программный пакет «MinKNOW» переводили в формат FASTQс помощью программы «Guppy v. 6.3.8»). Сборку геномов SARS-CoV-2 в формате FASTA проводили путём выравнивания относительно референсных последовательностей из VGARus с использованием программного пакета «Epi2me v. 22» и модуля «ARTIC v. 1». Для оценки качества собранных последовательностей и распределения геномов по линиям использовали сервисы «Nextclade» и «Pangolin COVID-19 Lineage Assigner v. 4.3». Последовательности, в которых количество нераспознанных или неоднозначных нуклеотидов составляло более 10% полногеномной последовательности SARS-CoV-2, были исключены из выборки для анализа.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили после множественного выравнивания с использованием программы «MAFFT v. 7.475» методом «ближайших соседей» [24] средствами программного пакета «MEGA v. 11.0.13» при уровне bootstrap-поддержки в 1000 повторов. Визуализацию полученных данных осуществляли с помощью сервиса «iTOL v. 6».

Изоляция штаммов SARS-CoV-2 проводилась из ОТ-ПЦР-РВ-положительных образцов назофарингеальных смывов, осветлённых низкоскоростным центрифугированием и фильтрованных через насадки «Millex» («Merck») с диаметром пор 0,22 мкм, на модели клеточной линии Vero E6 (почки африканской зелёной мартышки), которую культивировали в пластиковых пробирках («Nunc») со скошенным дном площадью 5,5 см² в среде DMEM («БиолоТ») с добавлением 1% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко»), 100 ЕД/мл гентамицина при 37ºС в атмосфере 5% СО₂ [25, 26]. Эффективность изоляции вируса оценивали по снижению порогового цикла ПЦР в 3 последовательных пассажах. На 5-е сутки после инфицирования культуральную жидкость отбирали для постановки ОТ-ПЦР-РВ (после 3-го пассажа дополнительно проводили определение lg 50% инфекционной дозы тканевой культуры (lg TCID₅₀) с помощью МТТ-теста).

МТТ-тест использовали для оценки выживаемости клеток Vero E6 под действием различных разведений вируса при оценке инфекционного титра штаммов SARS-CoV-2 после 3-го пассажа. Сущность этого метода заключается в способности жизнеспособных клеток превращать хорошо растворимый жёлтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы (E,Z)-5(4,5-диметилтиазол-2-ил)-1,3-дифенилформазана (МТТ-формазана) под действием внутриклеточных дегидрогеназ [27, 28]:

 

 

На 5-е сутки после заражения в лунки с клетками 96-луночного планшета («Merck») добавляли по 20 мкл раствора 5 мг/мл МТТ («Sigma-Aldrich»); инкубировали при 37ºC в атмосфере с 5% CO₂ в течение 2 ч; после удаления культуральной жидкости в лунки вносили по 150 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М HCl; оптическую плотность в лунке определяли при 540 нм (вблизи максимума поглощения МТТ-формазана) с вычетом фонового значения при 620 нм с помощью планшетного ридера («Labsystems»). Уровень цитопатогенности (cytopathogenicity level — CPL) штамма в конкретном разведении вычисляли по формуле:

$CPL=\left(1-\frac{D_v}{D_0}\right)\times 100\%$,

где D_v — оптическая плотность инфицированного образца; D₀ — оптическая плотность неинфицированной клеточной культуры.

Инфекционный титр штамма определяли как предельное разведение исходной вирусосодержащей жидкости, зафиксированное в эксперименте, для которого CPL > 0 (неравенство нулю оценивалось в t-тесте Стьюдента при уровне значимости p = 95% и 8-кратных повторах каждого разведения вирусосодержащей жидкости).

Эпидемиологический анализ заболеваемости COVID-19 в ПК с 20.04.2020 по 30.06.2023 проводили на основе данных Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю, Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае¹, в России — по данным официального сайта Роспотребнадзора² и российского информационного портала «Стопкоронавирус»³. Использовали информацию о распространении генетических вариантов SARS-CoV-2 на территории России из обзорно-аналитической работы [17, 19] и российской базы данных VGARus, в странах Восточной Азии — из международной базы данных GISAID⁴.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью следующих функций из программного пакета «MS Excel 2010»: объём анализируемой выборки (n); среднее арифметическое (М); стандартная ошибка среднего (m); медиана (Me); нижний (25%) квартиль (LQ); верхний (75%) квартиль (UQ); интерквартильный размах (LQ–UQ). Нормальность распределения количественных признаков проверяли с использованием W-критерия Шапиро–Уилка; t-критерия Стьюдента (при уровне значимости альтернативной гипотезы р = 0,05); U-критерия Манна–Уитни [29, 30].

Метод главных компонент как способ поиска подпространства меньшей размерности, в проекции на которое исходные данные имеют наименьший разброс квадратичных отклонений [31, 32], применяли с помощью программных пакетов «Statistica v. 7.0» («StatSoft Inc.») и «Mathworks Matlab R2007b» («MathWorks Inc.»).

Результаты

Индикация РНК SARS-CoV-2 в назофарингеальных смывах в период пандемии COVID-19 на территории ПК проводилась в 24 лабораториях (в том числе 5 частных): было проведено 3 007 009 ОТ-ПЦР-РВ-тестирований, из которых 399 821 (13,3%) оказались положительными⁵. Получаемая информация интегрировалась для оперативного анализа в эпидемиологических подразделениях Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае и Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю.

Полногеномные нуклеотидные последовательности SARS-CoV-2, полученные из образцов биологического материала, собранного на территории ПК в период пандемии COVID-19, представлены в табл. 1. Помимо 553 геномов, секвенированных в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова в рамках реализации Федерального проекта «Санитарный щит страны — безопасность для здоровья», ещё 502 генома секвенированы в других научных учреждениях, в которые были направлены ОТ-ПЦ-РВ-положительные образцы из Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае в соответствии с Приказом Роспотребнадзора⁶.

 

Таблица 1. Число полногеномных последовательностей SARS-CoV-2, обнаруженных на территории ПК в 2020–2023 гг., в базе данных VGARus

Table 1. Data on full-genome sequences of SARS-CoV-2 detected in the territory of Primorsky Krai (2020–2023) in the VGARus database

Год Year	НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова (Владивосток) G.Р. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology (Vladivostok)	Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Новосибирск) State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector" (Novosibirsk)	НИИ гриппа (Санкт-Петербург) Institute of Influenza (St.-Petersburg)	Всего Total
2020	173	2	23	198
2021	90	11	1	102
2022	105	158	306	569
2023	185	0	1	186
Итого | Total	553	171	331	1055

 

Результаты филогенетического анализа полноразмерных геномов SARS-CoV-2 с территории ПК (табл. 1), представленные на рис. 1, а, свидетельствуют о дифференцировке на геноварианты по классификации Pango (рис. 1, б) и ВОЗ (рис. 1, в).

 

Рис. 1. Генотипирование 804 полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2, выявленных в ПК в 2020–2023 гг. а — филогенетическое древо; б — распределение по генетическим линиям Pango; в — распределение по геновариантам ВОЗ.

Fig. 1. Genotyping of 804 full-genome SARS-CoV-2 nucleotide sequences identified in Primorsky Krai (2020–2023). a — phylogenetic tree; b — distribution according to Pango genetic lines; c — distributions according to WHO genovariants.

 

Эпидемическая динамика COVID-19 в связи со сменой геновариантов SARS-CoV-2 на территории ПК (2020–2023 гг.) представлена в табл. 2 и на рис. 2: как и в целом по России, подъём заболеваемости COVID-19 за период пандемии этого заболевания (11.03.2020–05.05.2023), начавшийся с крупных мегаполисов [17, 19], имел выраженный волнообразный характер с 7 эпидемическими периодами.

 

Таблица 2. Динамика эпидемии COVID-19 в ПК в сравнении с Россией в целом в 2020–2023 гг.

Table 2. Characteristics of epidemic dynamics of COVID-19 in Primorsky Krai in comparison with a whole Russian Federation (2020–2023)

Период Period	Территория Territory	Сроки эпидемических периодов Dates of epidemic periods					Заболеваемость на 100 тыс. населения Incidence (per 100 000 population)									Клиническая форма Clinical form
		начало | beginning		конец | end		продолжительность, недели duration, weeks	заболеваемость в начале периода incidence in the beginning of the period	заболеваемость в конце периода incidence in the end of the period	максимум maximum	M	m	Me	LQ	UQ	общее число случаев total number of incidences	тяжёлая, % severe, %	средней тяжести, % average severity, %	лёгкая и бессимптомная, % mild and asymptomatic, %
		дата date	номер недели number of a week	дата date	номер недели number of a week
I	ПК | PK	20.04.2020	17	20.09.2020	38	22	12,83	2,65	41,8	27,6	1,7	28,2	21,1	32,6	606,6	2,1	31,5	66,4
	РФ | RF	30.03.2020	13	30.08.2020	36	22	19,6	25,6	54,5	29,8	3,0	29,8	25,1	38,8	654,9	4,5	47,7	47,8
II	ПК | PK	21.09.2020	39	09.05.2021	18	33	28,7	9,5	91,6	54,0	5,4	54,9	24,2	87,2	1783,4	5,8	32,2	62
	РФ | RF	31.08.2020	36	09.05.2021	18	36	28,1	41,3	154,9	73,4	6,2	60,6	42,5	101,7	2641,9	3,1	41,6	55,3
III	ПК | PK	10.05.2021	19	03.10.2021	39	21	11,8	82,6	107,7	67,4	7,4	83,7	32,6	93,5	1415,9	3,1	35,6	61,3
	РФ | RF	10.05.2021	19	12.09.2021	37	18	39	101,6	119,2	83,6	7,0	93,5	47,6	110,3	1504,3	2,6	41,1	56,3
IV	ПК | PK	04.10.2021	40	09.01.2022	1	14	86,67	100,7	177,1	142,9	9,3	157,7	109,8	171,8	2001,1	3,0	36,5	60,5
	РФ | RF	13.09.2021	37	09.01.2022	1	17	115,7	95,5	191,8	141,8	8,3	145,5	115,7	172,8	2411,1	2,2	40,9	56,8
V	ПК | PK	10.01.2022	2	18.07.2022	29	27	104,8	8,7	581,5	144,2	35,8	56,9	11,1	149,6	3893,5	1,3	29,8	68,9
	РФ | RF	10.01.2022	2	18.07.2022	29	27	76,5	15,6	915,1	201,3	52,2	65,8	21,5	240,6	5435,3	0,4	33,0	66,6
VI	ПК | PK	19.07.2022	29	09.01.2023	2	25	10,8	20,4	232,2	69,9	14,0	30,7	18,3	107,3	1747,7	0	12,1	87,9
	РФ | RF	19.07.2022	26	09.01.2023	2	25	20,3	18,0	258	91,8	16,2	44,9	29,9	164,9	2296	–	–	–
VII	ПК | PK	10.01.2023	2	25.06.2023	25	23	14,3	3,04	44,4	20,1	2,5	16,1	12,7	28,7	482,2	0	25,1	74,9
	РФ | RF	10.01.2023	2	04.06.2023	22	20	15,2	8,8	64,9	36,2	3,9	34,4	21,3	54,7	767,1	–	–	–

Примечание. РФ — Российская Федерация; «–» — нет данных.

Note. PK — Primorsky Krai; RF — Russian Federation; “–” — no data.

 

Рис. 2. Заболеваемость COVID-19 и генетическое разнообразие SARS-CoV-2 на территории ПК в 2020–2023 гг.

Fig. 2. Incidence of COVID-19 and genetic diversity of SARS-CoV-2 on the territory of Primorsky Krai (2020–2023).

 

В ПК первый случай COVID-19 был зарегистрирован 21.03.2020 (женщина 30 лет, гражданка России, проживающая во Владивостоке, вернувшаяся 15.03.2020 из служебной командировки в Мексику, г. Канкун), и на 05.05.2023 документировано 217 196 случаев этого заболевания.

В целом динамика эпидемического процесса в регионе соответствовала таковой в среднем по России (рис. 2, табл. 2), но с некоторым запаздыванием (примерно на 2 нед) по сравнению с центральными регионами страны (аналогично тому, как это имело место при распространении пандемического гриппа А (H1N1 pdm09) [18]). Первый подъём заболеваемости COVID-19 в ПК характеризовался медленным нарастанием в течение 13 нед с пиком на 29-й неделе. В России этот процесс развивался более быстрыми темпами — пик заболеваемости был зарегистрирован уже через 5 нед от начала подъёма с локальным максимумом через 19 нед. Более медленное развитие эпидемического роста в ПК было обусловлено в первую очередь введением строгих режимно-ограничительных мероприятий. В этот период в России от больных COVID-19 выделяли в основном Ухань-подобные (Wuhan) варианты возбудителя: B.1.1 (62,0%), B.1.1.317 (3,3%). В ПК большинство геновариантов вируса также относились к линиям B.1.1 (26%) и B.1.1.х (B.1.1.317 и B.1.1.277.2) — 74% (рис. 2, табл. 3).

 

Таблица 3. Распределение геновариантов вируса SARS-CoV-2 по периодам пандемии COVID-19 на территории ПК и России в целом в 2020–2023 гг.

Table 3. Distribution of SARS-CoV-2 genetic variants by COVID-19 pandemic periods on the territory of Primorsky Krai and a whole Russian Federation (2020–2023).

Период Period	Территория Territory	Число образцов Number of samples	Геноварианты, % | Genovariants, %
			Wuhan	Alpha	Delta	Omicron				не встречавшиеся в ПК not found in PK
			B.1.1 + B.1.1.х	B.1.1.7.x	B.1.617.2.x	BA.1.x	BA.2.x	BA.5.x	XBB.x
I	ПК | PK	23	100,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
	РФ | RF	1701	65,3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	34,7
II	ПК | PK	201	100,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
	РФ | RF	7417	55,0	7,2	1,6	0,0	0,0	0,0	0,0	36,2
III	ПК | PK	30	3,3	0,0	96,6	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
	РФ | RF	10 602	5,1	2,5	89,6	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8
IV	ПК | PK	46	2,2	0,0	97,8	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
	РФ | RF	23 315	0,1	0,0	93,5	6,1	0,0	0,0	0,0	0,3
V	ПК | PK	368	0,0	0,0	33,4	48,9	17,7	0,0	0,0	0,0
	РФ | RF	24 416	0,1	0,0	11,4	38,9	42,5	6,2	0,0	0,9
VI	ПК | PK	201	0,0	0,0	1,0	0,0	1,0	98,0	0,0	0,0
	РФ | RF	28 300	0,0	0,0	0,0	2,1	11,4	85,7	0,7	0,1
VII	ПК | PK	130	0,0	0,0	0,9	0,0	2,7	1,1	96,2	0,0
	РФ | RF	4928	0,0	0,0	0,0	1,5	0,3	35,9	62,3	0,0

Примечание. РФ — Российская Федерация.

Note. PK — Primorsky Krai; RF — Russian Federation.

 

Во время II волны рост заболеваемости как в ПК, так и в среднем по России был более медленным — 11 и 17 нед с пиками на 50-й и 52-й неделях соответственно. Доля B.1.1 в России снизилась до 33,7%, а доля B.1.1.317 и B.1.1.523 увеличилась до 21,3%; появились новые геноварианты: Alpha (B.1.1.7) — 7,2% и Delta (B.1.617.2) — 1,6 %. В ПК в этот период доминировала генетическая линия B.1.1 (68,4%); прочие геноварианты B.1.1.х (прежде всего B.1.1.317 и B.1.1.277.2) в совокупности составили 31,6%. В 2021 г. периоды подъёма заболеваемости были менее длительными, но характеризовались более интенсивным развитием эпидемического процесса. В это время в ПК были зарегистрированы III и IV подъёмы уровней заболеваемости с пиками на 27-й и 48-й неделях соответственно; в России III подъём продолжался в среднем 4 мес с максимальным уровнем заболеваемости на 29-й неделе, IV подъём — с сентября по январь 2021 г. В этот период активно шёл процесс изменения биологических свойств возбудителя: доля геноварианта Delta (B.1.617.2.x) увеличилась до 93–97%, практически вытеснив все ранее циркулировавшие линии.

Пятый подъём заболеваемости в целом по России и в ПК характеризовался резким скачком — пик заболеваемости был достигнут спустя 4 и 5 нед от начала подъёма. Показатели заболеваемости в этот период были значимо (р < 0,05) выше, чем в предыдущие периоды. Этот подъём был обусловлен совместной циркуляцией уходящего варианта Delta (B.1.617.2.х) и приходящих ему на смену первых двух линий варианта Omicron (BA.1.х и BA.2.х). К концу V периода в мире установилось доминирование варианта Omicron. Сублинии Omicron BA.5.х, доля которых увеличилась до 90%, вызвали VI подъём заболеваемости в различных регионах России. При этом и в ПК, и в России в целом течение эпидемического процесса отличалось от предыдущего периода меньшей интенсивностью и скоростью достижения пиковых показателей. Во время VII периода наблюдалось дальнейшее снижение интенсивности эпидемического процесса. Максимальное значение пика заболеваемости в среднем в России было зарегистрировано на 8-й неделе, в ПК — на 9-й неделе от начала подъёма. В этот период значительно увеличилось разнообразие субвариантов Omicron, один из них (XBB) быстро распространился по миру [33]. К концу января 2023 г. в России в целом и в ПК субварианты XBB.х преобладали, их доля в структуре субвариантов Omicron возросла до 62,3 и 92,8% соответственно.

При анализе клинических проявлений COVID-19 в ПК, как и в России в целом, преобладали заболевания в лёгкой (68,4 и 54,2% соответственно) и средней (29,3 и 42,7%) тяжести. Доля тяжёлых форм составляла 2,3 и 3,1% соответственно. Первая волна характеризовалась высокой долей пневмоний (20,9%) и бессимптомных форм (30,3%), доля тяжёлых форм составила 2,1% (табл. 2). По мере развития эпидемического процесса во II волне отмечался самый большой за весь период наблюдения удельный вес тяжёлых форм заболевания (5,8%), доля внебольничных пневмоний составляла 17,7%. На протяжении последующих периодов доля внебольничных пневмоний постепенно уменьшалась с 16,2% в III волне до 1,9% в VI волне. Удельный вес тяжёлых форм пневмоний также снизился с 3,1% до 0. Следует отметить, что удельный вес форм средней степени тяжести течения COVID-19 распределялся по периодам подъёма неравномерно: увеличивался от I к III периоду (с 31,5 до 36,5%), к VI периоду снижался до 12,1% и в VII периоде вновь увеличивался до 25,1%.

В VII эпидемическом периоде (май 2023 г.) в ПК преобладал вариант XBB.x, впервые зарегистрированный 31.01.2023 (линия XBB.1.14), к концу марта — линия XBB.1.5.24, подвид варианта XBB.1.5 (Kraken), к 05.05.2023 доминирующим стал вариант XBB.1.9.1 (Hyperion) (рис. 3). Особенно важно отметить высокую долю вариантов XBB.1.5.24 (9% в ПК и 6% по России в целом) и XBB.1.9.1 (45 и 51% соответственно), что резко контрастировало с генетическим пейзажем штаммов SARS-CoV-2 в сопредельных странах Юго-Восточной Азии (рис. 4). Такая картина, возможно, является следствием своевременного введения в России жёстких ограничительных мер, включающих прекращение транспортного сообщения со странами Азиатско-Тихоокеанского региона, в то время как относительная свобода сообщения России со странами Европы и ПК с центральной частью России сохранялась на всём протяжении пандемии.

 

Рис. 3. Генетическое разнообразие SARS-CoV-2 в ПК с января по май 2023 г.

Fig. 3. Genetic diversity of SARS-CoV-2 in Primorsky Krai from January to May 2023.

 

Рис. 4. Генетическое разнообразие SARS-CoV-2 в ПК, России в целом и сопредельных странах Восточной Азии накануне официального окончания пандемии 05.05.2023 (цифры при секторах круговых диаграмм соответствуют процентной доле данного геноварианта по данным GISAID).

Fig. 4. Genetic diversity of SARS-CoV-2 in Primorsky Krai, whole Russia, and neighboring countries of East Asia on the eve of the official end of the pandemic on May 05, 2023 (figures in the sectors of pie charts correspond to the percent portion of this genovariant according to GISAID).

 

Изоляция штаммов SARS-CoV-2 была успешно проведена из 151 образца ОТ-ПЦР-РВ-положительных назофарингеальных смывов (эффективность изоляции составила 151/217 ≈ 69,6%). Полученные вирусные штаммы были депонированы в коллекцию патогенных микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова. Признаки цитопатического действия вируса в культуре клеток Vero-E6 наблюдались начиная со 2–4-х суток после инфицирования (рис. 5, а, б). Распределение полученных штаммов SARS-CoV-2 по генетическим линиям представлено на рис. 5, в, а по значениям lg TCID₅₀ — в табл. 4.

 

Рис. 5. Штаммы SARS-CoV-2, изолированные в чувствительной клеточной линии Vero-E6 в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова. а — интактная клеточная линия; б — клеточная линия с проявлениями цитопатогенного действия штамма SARS-CoV-2/Russia_Primorje/FE-R-6932 (Delta AY.122) на 5-е сутки после инфицирования (3 пассаж); в — распределение штаммов по геновариантам (цифры при секторах круговых диаграмм соответствуют процентной доле данного геноварианта).

Fig. 5. SARS-CoV-2 strains isolated in the sensitive Vero-E6 cell line at the G.P. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor a — intact cell line; b — cell line with manifestations of cytopathogenic action of the SARS-CoV-2 strain/Russia_Primorje/FE-R-6932 (Delta AY.122) for 5 days after infection (3 passage); с — the distribution of strains by genovariants (the numbers in the sectors of the pie charts correspond to the percentage of this genovariant).

 

Таблица 4. Инфекционные титры штаммов SARS-CoV-2, изолированных в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова (2020–2023 гг.)

Table 4. Infectious titers of SARS-CoV-2 strains isolated at the G.P. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology (2020–2023)

Геновариант штамма Genovariant of the strain		Количество штаммов Number of strains	Распределение штаммов по значениям десятичного логарифма инфекционного титра, lg TCID50 Distribution of strains according to the values of the decimal logarithm of the infectious titer, lg IT				M ± m
			3	4	5	6
Wuhan	B.1.1	49	2	8	11	28	5,3 ± 0,1	5,3 ± 0,1
	B.1.1.1	2	0	0	1	1	5,5 ± 0,5
	B.1.1.317	4	0	1	2	1	5,0 ± 0,4
	B.1.1.397	5	0	0	2	3	5,6 ± 0,2
	B.1.1.485	1	0	0	1	0	5,0 ± 0,0
	B.1.143	1	0	1	0	0	4,0 ± 0,0
Delta	AY.121	1	0	0	1	0	5,0 ± 0,0	4,3 ± 0,2
	AY.122	36	8	14	9	5	4,3 ± 0,2
Omicron	BA.1.x	20	10	4	6	0	3,8 ± 0,2	3,7 ± 0,1
	BA.2	5	2	3	0	0	3,6 ± 0,2
	BA.5.2	5	1	3	1	0	4,0 ± 0,3
	XBB.x	22	13	8	1	0	3,5 ± 0,1

 

Плоскость главных компонент для различных периодов пандемии COVID-19 в ПК и России, рассматриваемых как точки в восьмимерном пространстве признаков — компонент распределения SARS-CoV-2 по геновариантам (табл. 3) — представлена на рис. 6. Две первые главные компоненты на рис. 6, соответствующие двум наибольшим собственным значениям ковариационной матрицы признаков, включают 63,6% информации о взаимном расположении объектов в многомерном признаковом пространстве. Известно, что вращение главных компонент на один и тот же угол не изменяет значения собственных чисел ковариационной матрицы [32]: на рис. 6 вращение компонент осуществлено таким образом, чтобы максимизировать дисперсию факторных нагрузок.

 

Рис. 6. Плоскость двух первых главных компонент для различных эпидемических периодов COVID-19, обозначаемых латинскими цифрами (так же, как на рис. 2 и в табл. 2, 3): серые точки соответствуют ПК, белые — России.

Fig. 6. The plane of the first two main components for various epidemic periods of COVID-19 indicated by Latin numerals (as in Figure 2 and Tables 2–3): the gray dots correspond to the Primorsky Krai, the white ones — to the Russian Federation.

 

Обсуждение

В России пандемия COVID-19 началась позже, чем во многих странах, вследствие применения строгих режимно-ограничительных и противоэпидемических мероприятий в отношении COVID-19, которые были регламентированы Указами Президента РФ⁷, Распоряжениями Правительства РФ⁸ и Постановлениями Главного государственного санитарного врача РФ⁹. Мероприятия по предупреждению завоза и снижению рисков распространения COVID-19 на территории ПК вводились на основании как вышеперечисленных указов и распоряжений, так и Постановления губернатора ПК¹⁰ и главного государственного санитарного врача по ПК¹¹. Все проведённые на начальном этапе мероприятия позволили замедлить темпы распространения COVID-19, увеличить объём исследований на COVID-19 и мощность лабораторных баз, подготовить медицинские организации для оказания помощи больным, что предотвратило увеличение числа случаев тяжёлых форм заболевания и летальности.

Анализ проявлений эпидемического процесса COVID-19 в период с апреля 2020 г. по июнь 2023 г. на территории ПК и России в целом выявил 7 подъёмов заболеваемости, различавшихся по клинико-эпидемиологическим проявлениям течения COVID-19 в зависимости от геноварианта возбудителя (рис. 1, 2, табл. 2, 3). Сравнение заболеваемости COVID19 в каждом периоде показало, что динамика развития эпидемического процесса в ПК аналогична общероссийской, что особенно наглядно демонстрирует рис. 6. При этом в структуре клинических форм заболевания в течение всей пандемии преобладали лёгкие и средней степени тяжести клинические формы.

Введение ограничительных мер в марте–апреле 2020 г. практически прекратило перемещение людей между ПК и сопредельными государствами (Китаем, Республикой Кореей, Японией), в результате чего динамика циркуляции геновариантов вируса SARS-CoV-2 в регионе объяснялась исключительно внутрироссийской миграцией, поэтому во время I и II периодов пандемии в ПК (как и в России в целом) доминирующим был геновариант Wuhan, в III и IV периодах — Delta, в V и в последующих подъёмах — различные геноварианты Omicron (рис. 2). Смена доминирующих геновариантов проиллюстрирована на рис. 3.

С середины 2022 г. началось постепенное смягчение режима перемещения с сопредельными странами, что не могло не сказаться на разнообразии геновариантов Omicron, циркулирующих в ПК. Так, в ПК к концу апреля – началу мая 2023 г. доля вариантов XBB.1.9.2 и XBB.1.16 (Arcturus) была несколько выше, чем в России в целом. В то же время доля варианта XBB.1.9.2 была наиболее велика в Республике Корея, а варианта XBB.1.16 — в Японии (рис. 4). Эти данные позволяют предполагать определённое участие сопредельных стран Азиатско-Тихоокеанского региона в формировании генетического ландшафта SARS-CoV-2 в ПК на заключительном этапе пандемии. Данные филогенетического анализа образцов редкого в России субварианта BN (рис. 5) также могут служить косвенным подтверждением множественности путей проникновения вируса в регион. При этом в ПК доля зарегистрированных случаев COVID-19, этиологическим фактором которых являлись XBB.1.9.2 (5%) и XBB.1.16 (3%), была сопоставима с таковыми в Республике Корея (XBB.1.9.2 — 7%), и в Японии (XBB.1.16 — 12%; рис. 4), в отличие от среднероссийских значений (XBB.1.9.2 — 2%, XBB.1.16 — 1%) [34–36]. Эти данные позволяют предполагать возможное участие геновариантов возбудителя, циркулирующих в сопредельных странах Азиатско-Тихоокеанского региона, в формировании генетического ландшафта SARS-CoV-2 в ПК на заключительном этапе пандемии.

Филогенетический анализ изолятов, относящихся к линии BN, слабо представленной в России (около 150 образцов в GISAID), но характерной для Республики Корея [37], подтверждает возможность завоза новых вариантов вируса в ПК из этой страны. По данным сайта Pango, 37% изолятов линии BN.1.2, 41% линии BN.1.2.3 и 25% линии BN.1.3 происходят из РК. Филогенетический анализ наиболее близких по структуре образцов SARS-CoV-2 из России и Республики Корея показал, что образец prim000233 (BN.1.2, дата забора 14.04.2023) относится, скорее, к группе южнокорейских изолятов, в то время как образец prim000314 (BN.1.2.3, дата забора 10.04.2023) — к группе изолятов, выделенных из центральной части России (рис. 7; низкие значения bootstrap-поддержки для некоторых кластеров на этом рисунке объясняются высокой степенью гомологии анализируемых последовательностей, что характерно для большинства региональных исследований SARS-CoV-2 [38–42]). Данные результаты могут также служить косвенным подтверждением множественности путей проникновения вируса в регион.

 

Рис. 7. Филогенетическое древо наиболее гомологичных друг другу вирусов SARS-CoV-2 линии BN. Для образцов из России указаны номера в VGARus и номера в GISAID (в скобках). Для образцов из Республики Корея указаны номера в GISAID. Номера образцов из ПК выделены жирным шрифтом.

Fig. 7. Phylogenetic tree of the most homologous viruses of the BN line of SARS-CoV-2. Numbers in VGARus and GISAID (in parentheses) databases are given for the samples from Russia. Numbers in GISAID database are given for the samples from Republic of Korea. Numbers of samples from Primorsky Krai are given in bold.

 

В процессе изоляции штаммов SARS-CoV-2 отмечено значимое снижение титров геновариантов Delta и Omicron, что свидетельствует об уменьшении их вирулентности (скорости репликации и накопления вируса) по сравнению с Wuhan-подобными вариантами (табл. 4). Полученные результаты согласуются с эпидемиологическими проявлениями инфекционного процесса — повышением контагиозности вариантов SARS-CoV-2 и снижением тяжести клинических проявлений инфекции.

Распределение генотипов SARS-CoV-2, выявленных в клиническом материале (рис. 1, б, в), свидетельствует о преобладании варианта Omicron (59,7%), в то время как среди изолированных штаммов доминируют Wuhan-подобные варианты (41,0%), что объясняется их более высокой вирулентностью. Это подтверждает правильность выбора стратегии оперативного эпидемиологического мониторинга, основанного на секвенировании полноразмерного вирусного генома именно из первичного клинического материала (хотя это не исключает необходимость изоляции различных вариантов возбудителя для проведения вирусологических исследований).

Таким образом, уникальность формирования генотипического портрета SARS-CoV-2 на территории ПК в период пандемии COVID-19 заключается в возможности завоза вируса как из европейской части России, так и из стран Восточной Азии. Последнее направление представляется наиболее актуальным в связи со стратегическим «восточным вектором» внешней политики, который последовательно реализует Правительство РФ. Сохраняющаяся возможность возникновения в сопредельных государствах новых, особо опасных вариантов вируса делает молекулярно-генетический мониторинг SARS-CoV-2 на территории ПК особенно актуальным. Ретроспективный анализ эпидемического процесса COVID19 на конкретной территории является необходимым условием для формирования моделей и прогнозов развития ситуации, позволяет идентифицировать факторы риска, связанные с распространением и тяжестью заболевания, оценить эффективность принятых мер, повысить надёжность обеспечения биологической безопасности.

 

¹ Отчётная форма Роспотребнадзора № 970 «Информация о случаях заболевания лиц с подозрением на коронавирусную инфекцию», отчёт № 1076 «Сводный отчет о случаях COVID-19 в регионах».

² URL: https://www.rospotrebnadzor.ru/region/korono_virus/epid.php

³ URL: https://стопкоронавирус.рф/

⁴ URL: https://gisaid.org

⁵ Количество ОТ-ПЦР-РВ-положительных проб не следует ассоциировать с количеством пациентов с COVID-19: в 2020 г. больные обследовались в среднем 3,6 раза, т.к. в то время из лечебного учреждения выписывали после получения двукратного отрицательного результата, который достигался не с первого раза; в 2021 г. выписка стала производиться при получении однократного отрицательного результата, а позже — по факту выздоровления.

⁶ Приказ Роспотребнадзора от 19.02.2021 № 56 «О совершенствовании молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции».

⁷ Указы Президента: от 25.09.2020 № 206; от 02.04.2020 № 239; от 02.04.2020 № 294.

⁸ Распоряжения Правительства РФ: от 30.01.2020 № 140-р; от 31.01.2020 № 154-р; от 03.02.2020 № 194-р; от 18.02.2020 № 338-р; от 27.02.2020 № 447-р; от 27.02.2020 № 446-р; от 27.02.2020 № 448-р; от 16.03.2020 № 635-р; от 06.03.2020 № 550-р; от 12.03.2020 № 597-р; от 14.03.2020 № 622-р; от 16 марта 2020 № 730-р; от 27.03.2020 № 763-р.

⁹ Постановления Главного государственного санитарного врача РФ: от 24.01.2020 № 2; от 31.01.2020 № 3; от 02.03.2020 № 5; от 13.03.2020 № 6; от 18.03.2020 № 7; от 30.03.2020 № 9.

¹⁰ Постановление губернатора ПК от 18.03.2020 № 21-пг.

¹¹ Постановление Главного государственного санитарного врача ПК от 20.04.2020 № 17.

Об авторах

Анна Юрьевна Попова

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: uglevas@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-2567-9032

д.м.н., профессор, руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Россия, Москва

Михаил Юрьевич Щелканов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; Дальневосточный федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8610-7623

д.б.н., директор НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; зав. каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины Дальневосточного федерального университета

Россия, Владивосток; Владивосток

Наталья Владимировна Крылова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; Дальневосточный федеральный университет

Email: krylovanatalya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9048-6803

д.б.н., в.н.с., зав. лаб. респираторных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; доцент каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины Дальневосточного федерального университет

Россия, Владивосток; Владивосток

Алексей Анатольевич Белик

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Email: belik_a_a@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0303-3188

к.б.н., н.с. лаб. респираторных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Россия, Владивосток

Любовь Михайловна Семейкина

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Email: lms78@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-1095-7968

аспирант НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; зам. зав. отделом эпидемиологии Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Россия, Владивосток; Владивосток

Татьяна Станиславовна Запорожец

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Email: niiem_vl@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8879-8496

д.м.н., г.н.с. лаб. респираторных вирусных инфекций, зам. директора по научной работе НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Россия, Владивосток

Вячеслав Юрьевич Смоленский

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: aidscouncil@gsen.ru
ORCID iD: 0000-0003-1773-4097

к.м.н., зам. руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Россия, Москва

Елена Викторовна Персиянова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Email: helen-pers@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5686-8672

к.б.н., с.н.с. лаб. респираторных вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Россия, Владивосток

Марина Николаевна Просянникова

Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Email: marpros67@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-5265-8106

зав. лаб. вирусных и особо опасных бактериальных инфекций Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Россия, Владивосток

Юрий Александрович Белов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; Дальневосточный федеральный университет

Email: bornley@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8313-5610

м.н.с., зав. Центром молекулярной диагностики НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; ассистент каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины Дальневосточного федерального университета

Россия, Владивосток; Владивосток

Ольга Викторовна Иунихина

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; Дальневосточный федеральный университет

Email: olga-iun@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-6723-582X

к.м.н., зав. лаб. зоонозных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; доцент каф. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии с Международным научно-образовательным Центром биологической безопасности Роспотребнадзора Школы наук о жизни и биомедицины Дальневосточного федерального университета

Россия, Владивосток; Владивосток

Анастасия Борисовна Потт

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1235-4960

н.с. лаб. респираторных вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Россия, Владивосток

Татьяна Фатеевна Хомичук

Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-3941-228X

зав. отделом эпидемиологии Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Россия, Владивосток

Анна Ивановна Симакова

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3334-4673

д.м.н., зав. каф. инфекционных болезней Тихоокеанского государственного медицинского университета

Россия, Владивосток

Светлана Алексеевна Абрамова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2428-3186

м.н.с. лаб. патоморфологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова

Россия, Владивосток

Ольга Борисовна Романова

Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Email: adorob@mail.ru

главный врач Центра гигиены и эпидемиологии в Приморском крае

Россия, Владивосток

Татьяна Николаевна Детковская

Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в Приморском крае

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7543-0633

руководитель Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю

Россия, Владивосток

Сергей Петрович Крыжановский

Медицинское объединение Дальневосточного отделения Российской академии наук

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1981-1079

д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, научный руководитель Медицинского объединения Дальневосточного отделения Российской академии наук

Россия, Владивосток

Наталия Николаевна Беседнова

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; Медицинское объединение Дальневосточного отделения Российской академии наук

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2760-9778

D. Sci. (Med.), Professor, Full Member of the Russian Academy of Sciences, main researcher, Laboratory of immunobiological preparations, G.Р. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology; Chief Researcher, Research Department, Medical Association of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Россия, Владивосток; Владивосток

Список литературы

Дополнительные файлы