Influence of  Yersinia pestis  with different plasmid composition on the erythrocyte membrane in the blood of guinea pigs

Svetlana N. Klyueva; Клюева Cветлана Николаевна; Svetlana A.  Bugorkova; Бугоркова Светлана Александровна; Pavel S. Erokhin; Ерохин Павел Сергеевич; Anastasiya Yu. Goncharova; Гончарова Анастасия Юрьевна; Aleksandr L. Kravtsov; Кравцов Александр Леонидович

doi:10.36233/0372-9311-471

Влияние Yersinia pestis с различным плазмидным составом на мембрану эритроцитов в крови морских свинок

Авторы: Клюева C.Н.¹, Бугоркова С.А.¹, Ерохин П.С.¹, Гончарова А.Ю.¹, Кравцов А.Л.¹
Учреждения:
1. Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Выпуск: Том 101, № 3 (2024)
Страницы: 372-381
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 27.11.2023
Дата публикации: 16.07.2024
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18487
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-471
EDN: https://elibrary.ru/jlaxvc
ID: 18487

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Эритроциты участвуют в развитии и реализации вакцинального и инфекционного процессов при чуме. Изменения их поверхностной архитектуры могут стать информативными критериями для доклинической оценки противочумных вакцин.

Цель работы — методом атомно-силовой микроскопии охарактеризовать состояние мембраны эритроцитов крови морских свинок в ответ на подкожное введение вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных.

Материалы и методы. Для иммунизации животных использовали Y. pestis EV НИИЭГ (рYТ⁺, pYV⁺, рYP⁺) и его изогенные производные Y. pestis KM216 (рYТ^–, pYV^–, рYP⁺), Y. pestis КМ217 (рYТ^–, pYV⁺, рYP^–), Y. pestis КМ218 (рYТ^–, pYV^–, рYP^–). Анализ мембраны эритроцитов проводили на сканирующем зондовом микроскопе «Solver P47-PRO» («NT-MDT»).

Результаты. Наиболее выраженные изменения поверхностной архитектоники мембраны эритроцитов морских свинок установлены в течение первых 3 сут формирования иммунного ответа в отношении штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенного варианта Y. pestis КМ217, в геноме которого сохранена плазмида pYV, взятых в дозе 5 × 10⁸КОЕ. Регистрировали значимое (р < 0,05) повышение доли трансформированных форм клеток (43,67 ± 3,63 и 37,83 ± 7,03% против 4,08 ± 0,86% в контроле), среднеквадратичной шероховатости (319 ± 8 и 312 ± 7 нм против 70 ± 6 нм в контроле), модуля Юнга (125,73 ± 4,48 и 113,8 ± 5,41 кПа против 53,03 ± 1,47 кПа в контроле). К 21-м суткам величина указанных показателей снижалась в среднем в 2,7; 2,0 и 1,5 раза соответственно, что указывало на восстановление мембраны эритроцитов.

Заключение. Установлена зависимость формирования изменений и скорость их восстановления в мембране эритроцитов от плазмидного состава штаммов Y. pestis. Полученные данные способствуют пониманию процессов взаимодействия Y. pestis с мембраной эритроцитов и могут быть использованы как дополнительные характеристики при разработке новых критериев доклинической оценки средств специфической профилактики чумы.

Ключевые слова

Yersinia pestis, плазмиды рYТ, pYV, рYP, атомно-силовая микроскопия, эритроциты, морские свинки, трансформированные формы, среднеквадратичная шероховатость поверхности эритроцитов, модуль Юнга

Полный текст

Введение

В настоящее время сохраняется необходимость как в совершенствовании имеющихся средств иммунопрофилактики чумы, так и в разработке эффективных и безопасных новых препаратов, в том числе вакцин нового поколения, созданных на основе авирулентных штаммов Yersinia pestis с чётко контролируемыми генетическими дефектами [1, 2]. Наиболее сложной является доклиническая оценка вакцин, поскольку от информативности и адекватности используемых методов исследования на этом этапе будет зависеть качество готового препарата.

Основным индикатором, отражающим любые сдвиги в состоянии организма, является кровь, в составе которой одной из активно тестируемых клеточных групп являются эритроциты [3]. Эритроциты наряду с лейкоцитами и тромбоцитами включены в категорию защитных клеток, способных убивать бактерии, и являются участниками и регуляторами реакций воспаления и врождённого иммунитета [4]. Эритроцитарные мембраны представляют собой твердоупругий белковый каркас, ячейки которого заполнены липидным бислоем [5]. Белковый каркас обладает высокой эластичностью и обусловливает вязкоупругие свойства интактных мембран. Плазмолемма эритроцитов содержит не менее 100 различных белков, формирующих цитоскелетный каркас, который придает эритроциту характерную двояковогнутую форму. Доказано, что отличие формы эритроцитов от нормальной двояковогнутой является показателем патологического процесса [6]. Изучена роль эритроцитов крови человека в процессах модуляции пролиферации и выживания Т-клеток посредством усиления секреции ряда цитокинов, индукции рецепторов интерлейкина-2 и регуляции соотношения CD4⁺/CD8⁺ [7–9]. Именно поэтому представляет интерес изучение поверхностной структуры эритроцита, являющегося своеобразной клеточной тест-системой при различных физиологических, постинфекционных и поствакцинальных процессах.

Наиболее эффективным методом изучения состояния поверхностных мембран является атомно-силовая микроскопия (АСМ) [10, 11], применяемая для оценки таких трехмерных параметров, как толщина (высота), объём, среднеквадратичная шероховатость поверхности, позволяющих характеризовать функциональное состояние клеток. Анализ силовых кривых по результатам АСМ направлен на количественное определение механических параметров: деформации, жесткости, модуля Юнга (МЮ) (важный количественный параметр, от которого существенно зависят реологические свойства крови, её текучесть по капиллярному руслу) [6, 12].

Экспериментально показано, что от плазмидного профиля изогенных производных вакцинного штамма чумного микроба зависит их иммуногенность [13], поэтому для поиска информативных критериев доклинической оценки живых чумных вакцин представляет интерес детализация процессов взаимодействия штаммов с различным плазмидным составом с эритроцитами крови.

Цель работы — методом АСМ охарактеризовать состояние мембраны эритроцитов в крови морских свинок в ответ на подкожное введение вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных.

Материалы и методы

Исследования проводили с вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ (рYТ⁺, pYV⁺, рYP⁺) и его изогенными производными Y. pestis KM 216 (рYТ^–, pYV^–, рYP⁺), Y. pestis КМ 217 (рYТ^–, pYV⁺, рYP^–), Y. pestis КМ 218 (рYТ^–, pYV^–, рYP^–), полученными из Государственной коллекции патогенных бактерий при Российском противочумном институте «Микроб». Штаммы Y. pestis выращивали на агаре LB (рН 7,2) в течение 48 ч при 28ºС. Животных иммунизировали указанными штаммами Y. pestis в концентрациях 5 × 10⁸ КОЕи 5 × 10⁵ КОЕ.

В качестве биомодели были выбраны морские свинки массой 35–400 г, полученные из питомника при Российском противочумном институте «Микроб». Из животных (50 особей) были сформированы 8 опытных групп по 6 особей в каждой и контрольная группа — интактные морские свинки (2 особи). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации^¹ и международными принципами^². Программа экспериментальной работы с животными одобрена Комиссией по биоэтике при Российском противочумном институте «Микроб» (протокол № 3 от 15.04.2022).

На 1, 3 и 21-е сутки после иммунизации у морских свинок забирали кровь из ушной вены. Оценку состояния клеток проводили с помощью микроскопа «Olympus CX41» («Olympus») и цифровой камеры «VZ-C31S» («VideoZavr») в программе «VideoZavr v. 1.5». Подсчёт эритроцитов с характеристикой морфологии выполняли в 5 полях зрения, учитывая не менее 800 клеток.

Для АСМ кровь животных собирали в пробирки с 2,5% раствором глутаральдегида в соотношении 1 : 3 и фиксировали в течение 2,5 ч в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.3103-13 «Организация работы лабораторий, использующих методы электронной и атомно-силовой микроскопии при исследовании культур микроорганизмов I–IV групп патогенности». Эритроциты осаждали центрифугированием при 1500 оборотах в течение 5 мин. Клетки дважды отмывали фосфатным буфером рН 7,4 при тех же условиях центрифугирования. Полученную взвесь клеток путём десятикратного разведения дистиллированной водой доводили до концентрации 3 × 10⁶ клеток/л. Контроль абсолютного количества клеток в конечной пробе осуществляли подсчётом эритроцитов в камере Горяева, применяя световую микроскопию (увеличение ×400).

Анализ проб осуществляли на сканирующем зондовом микроскопе «Solver P47-PRO» («NT-MDT») [10] в режиме прерывистого и непрерывного контакта с использованием кремниевых кантилеверов «NSG01» («NT-MDT»; резонансная частота 120 кГц, константа жесткости 5,5 Н/м) и «CSG10» («NT-MDT»; резонансная частота 20 кГц, константа жесткости 0,1 Н/м) соответственно. Для обработки АСМ-изображений использовали программу «Nova» («NT-MDT»), позволяющую редактировать полученные АСМ-изображения, а также представлять их в трехмерном формате. На полях сканирования от 15 × 15 до 50 × 50 мкм² анализу подвергали поверхность отдельно лежащих эритроцитов. Визуализация результатов измерения состояла в представлении рельефа в виде топографической карты и трёхмерных изображений. На топографических картах проводили сечения, вдоль которых строили профиль поверхности и выполняли расчёт среднеквадратичной шероховатости мембран эритроцитов (Rq).

На каждом препарате в случайном порядке выбирали 10 эритроцитов, на мембране которых в 9 точках исследовали упругость мембраны с построением графика силовых кривых и с дальнейшим вычислением среднего арифметического значения МЮ по каждой сканированной клетке. МЮ применяли для оценки жёсткости мембран эритроцитов на основе модели Герца, описывающей упругую деформацию двух контактирующих тел [12]:

F = ⁴/₃ × E × R^0,5 × h^1,5,

где F — сила, действующая на образец; E — МЮ; R — радиус зонда; h — глубина прогиба мембраны. С учётом радиуса закругления кантилеверов, которые использовали в данном исследовании, выводили формулу определения МЮ (кПа):

E = ³/₄ × F/R^0,5 × h^1,5.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica v. 10.0» («StatSoft Inc.»). Взаимосвязь между переменными определяли с помощью рангового корреляционного анализа по Спирмену. Корреляционную связь считали сильной при коэффициенте корреляции r = 0,7–1,0, умеренной (средней) силы — при r = 0,3–0,7, слабой — при r = 0–0,3, характер связи (прямая, обратная) определяли по знаку (+; –) перед значением. Корреляционную связь считали достоверной при р ˂ 0,05. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде М ± m, где М — среднее арифметическое значение, m — ошибка среднего арифметического.

Результаты

Эритроциты интактных морских свинок при наблюдении в световом микроскопе в стандартном режиме светлого поля представляли собой оптически контрастные объекты округлой формы (рис. 1, а). В ответ на иммунизацию морских свинок штаммами Y. pestis в крови происходило изменение формы и размеров эритроцитов, появлялись эритроциты трансформированной формы (эхиноциты (рис. 1, б), сфероциты, кодоциты).

Рис. 1. Эритроциты морской свинки (световая микроскопия без окраски).

а — эритроциты интактной морской свинки (× 400); б — эритроциты морской свинки, иммунизированной Y. pestis EV НИИЭГ (× 1000): 1 — дискоцит; 2 — эхиноцит.

Fig. 1. Guinea pig erythrocytes (light microscopy without staining).

а — intact guinea pig erythrocytes (× 400); b — guinea pig erythrocytes immunized with Y. pestis EV NIIEG (× 1000): 1 — discocyte; 2 — echinocytе.

Методом АСМ установлено, что в крови интактных морских свинок абсолютное большинство эритроцитов (до 96%) было представлено двояковогнутыми дискоцитами (рис. 2, а), с гладкой поверхностью, с утолщениями по краям (тор) и центральной впадиной (пеллор). Средний диаметр клетки составлял 6,0 ± 0,2 мкм, что укладывается в диапазон значений диаметра нормальных эритроцитов у данного вида лабораторных животных (4,3–7,0 мкм) [14]. По данным АСМ, высота тора дискоцитов не превышала 1,3 ± 0,1 мкм, а глубина впадины — 0,47 ± 0,04 мкм (рис. 3, а).

Рис. 2. Трёхмерные АСМ-изображения эритроцитов морской свинки, иммунизированной Y. pestis EV НИИЭГ.

а — дискоциты, 20 × 20 мкм²; б: 1 — эхиноцит, 2 — сфероцит, 15 × 15 мкм²; в: 1 — кодоцит, 2 — эхиноцит, 3 — дискоцит, 25 × 25 мкм²; г — кодоцит, 15 × 15 мкм².

Fig. 2. 3D AFM images of erythrocytes from a guinea pig immunized with Y. pestis EV NIIEG.

а — discocytes, 20 × 20 µm²; b: 1 — echinocyte, 2 — spherocyte, 15 × 15 µm²; c: 1 — codocyte, 2 — echinocyte, 3 — discocyte, 25 × 25 µm²; d — codocyte, 15 × 15 µm².

Рис. 3. Профили различных форм эритроцитов морской свинки, иммунизированной Y. pestis КМ 217.

а — дискоцит; б — эхиноцит; в — кодоцит; г — сфероцит.

Fig. 3. Profiles of various forms of erythrocytes from a guinea pig immunized with Y. pestis KM 217.

а — discocyte; b — echinocyte; c — codocyte; d — spherocyte.

Атипичные формы клеток, которые появлялись в результате воздействия штаммов Y. pestis, — это эхиноциты (рис. 2, б, в), сфероциты (рис. 2, б), кодоциты (рис. 2, г) и плоские клетки. Анализ гистограмм нормальных эритроцитов и трансформированных форм (ТФ) показал, что у неизменённых форм типичный двояковогнутый профиль клетки на кривой сечения представлен двумя равномерными синусоидами (рис. 3, а), в то время как у ТФ были выявлены выраженные изменения структуры мембранной поверхности. Любое нарушение в рельефе эритроцита отражалось на изменении профиля клетки, представленного в гистограммах (рис. 3, б–г).

Среди изменённых форм эритроцитов большинство (65,2 ± 2,6%) приходилось на долю эхиноцитов с единичными и множественными выростами толщиной 220 ± 30 нм, равномерно распределёнными на поверхности клетки (рис. 3, б). На долю кодоцитов (в середине клетки находится не пэллор, а выпуклость или мишень — утолщение, в котором скапливается гемоглобин) и сфероцитов (эритроциты, имеющие неправильную, сферическую форму) приходилось 32,4 ± 1,2%. Диаметр мишени кодоцитов не превышал 3,0 ± 0,5 мкм, что составляет почти 40% диаметра клетки (рис. 3, в). Высота мишеневидной структуры составляла 0,70 ± 0,01 мкм, что в 1,7 раза меньше высоты остальной части клетки (1,2 ± 0,1 мкм). Профиль сфероцита имел вид купола высотой 2,5 ± 0,2 мкм и диаметром 6,0 ± 0,3 мкм (рис. 3, г). Плоские клетки, на долю которых приходилось всего 2,0 ± 0,5%, представляли собой диски с гладкой ровной поверхностью диаметром 7,5 ± 0,5 мкм и толщиной 0,40 ± 0,05 мкм, без углубления в центре.

Анализ результатов АСМ эритроцитов в опытных группах позволил количественно сравнить степень и характер воздействия вакцинного штамма Y. pestis EV и его изогенных производных на поверхностную структуру эритроцитов в крови морских свинок (табл. 1). Наиболее значимые различия, характеризующиеся повышением (в среднем в 8,6 раза) ТФ эритроцитов по сравнению с контролем (р < 0,05), установлены в течение первых 3 сут в отношении штаммов Y. pestis EV НИИЭГ и Y. pestis КМ 217, общим для которых является наличие в составе плазмиды pYV(45 мДа), с наличием которой связывают клеточную адгезию, аутоагглютинацию, поверхностную агглютинацию, а также синтез белков наружной мембраны, в том числе V- и W-антигенов и других белков, действие которых направлено на подавление фагоцитарной активности клеток иммунной системы, а следовательно, обеспечение лучшей приживаемости вакцинных штаммов. К 21-м суткам количество ТФ эритроцитов в этих группах достоверно снижалось в среднем в 2,8 раза (р < 0,05) по сравнению с 1-ми сутками, но продолжало в среднем в 3 раза превышать аналогичный показатель в группе интактного контроля. Следует отметить влияние дозы Y. pestis EV НИИЭГ на количество ТФ эритроцитов на 3-и сутки иммуногенеза. Так, применение Y. pestis EV НИИЭГ в высокой дозе (5 × 10⁸КОЕ) вызывало увеличение ТФ в 1,5 раза (р < 0,05) больше, чем на введение низкой дозы (5 × 10⁵ КОЕ). Количество ТФ в ответ на иммунизацию Y. pestis KM 216 — штаммом, в составе которого имелась лишь одна плазмида pYP, детерминирующая синтез бактериоцина (пестицин 1) и активатора плазминогена, впрочем, как и на введение штамма Y. pestis KM 218, лишённого всех 3 ключевых плазмид чумного микроба, увеличивалось на 1-е и 3-и сутки в среднем в 3,6 раза по сравнению с аналогичным показателем в интактном контроле, но на 21-е сутки достоверного отличия по этому показателю от интактного контроля не выявлено.

Таблица 1. Количество трансформированных форм эритроцитов в ответ на иммунизацию морских свинок штаммами Y. pestis с различной изогенной структурой по данным АСМ

Table 1. The number of transformed forms of erythrocytes in response to immunization of guinea pigs with Y. pestis strains with different isogenic structures according to AFM data

Штамм Strain	Группа Group	Иммунизирующая доза, КОЕ Immunizing dose, CFU	Количество клеток, % \| Number of cells, %
Штамм Strain	Группа Group	Иммунизирующая доза, КОЕ Immunizing dose, CFU	1-е сутки \| 1^st day	3-и сутки \| 3^rd day	21-е сутки \| 21^st day
Y. pestis EV НИИЭГ	1	5 × 10⁵	28,71 ± 6,24*	28,09 ± 3,83*^#	11,43 ± 1,47*°
Y. pestis EV НИИЭГ	2	5 × 10⁸	37,5 ± 5,07*	43,67 ± 3,63*^#	15,15 ± 2,02*³
Y. pestis KM 216	3	5 × 10⁵	13,57 ± 4,13*	17,66 ± 3,48*	8,0 ± 2,12
Y. pestis KM 216	4	5 × 10⁸	18,33 ± 4,26*	20,77 ± 4,54*	9,17 ± 3,29
Y. pestis КМ 217	5	5 × 10⁵	34,45 ± 5,23*	35,47 ± 6,85*	10,65 ± 2,56*°
Y. pestis КМ 217	6	5 × 10⁸	36,15 ± 6,07*	37,83 ± 7,03*	14,58 ± 4,84*°
Y. pestis КМ 218	7	5 × 10⁵	11,89 ± 3,71*	16,71 ± 2,72*	6,29 ± 2,87
Y. pestis КМ 218	8	5 × 10⁸	16,85 ± 2,74*	19,65 ± 3,27*	9,09 ± 2,3
Контроль \| Control	9	–	4,08 ± 0,86

Примечание. Здесь и в табл. 2: *р < 0,05 по сравнению с контролем; ^#р < 0,05 различия между дозами; °р < 0,05 по сравнению с 1-ми сутками.

Note. Here and in the Table 2: *р < 0.05 compared with control; ^#р < 0.05 differences between doses; °р < 0.05 compared with 1^st day.

В дальнейших исследованиях с целью характеристики клеточной поверхности был использован параметр функциональных изменений рельефа эритроцита — Rq [10]. В течение первых 3 сут показатель Rq мембран эритроцитов всех иммунных морских свинок достоверно превышал (р < 0,05) соответствующее значение в контроле (табл. 2). Наиболее значимые различия в значениях Rq установлены в отношении Y. pestis EV НИИЭГ (рYТ⁺, pYV⁺, рYP⁺) и Y. pestis КМ 217 (pYV⁺) в зависимости от дозы во все сроки иммунного ответа. Так, при использовании вышеперечисленных штаммов в высокой дозе (5 × 10⁸КОЕ) величина Rq в среднем в 1,7 раза превышала (р < 0,05) соответствующие величины при низкой дозе (5 × 10⁵ КОЕ). На 21-е сутки зарегистрировано статистически значимое снижение показателя Rq при иммунизации животных штаммами Y. pestis EV НИИЭГ (рYТ⁺, pYV⁺, рYP⁺), Y. pestis KM 216 (рYP⁺), Y. pestis КМ 217 (pYV⁺) в обеих дозах по сравнению с аналогичными показателями на 1-е сутки иммунного ответа (р < 0,05).

Таблица 2. Динамика изменения АСМ-параметров поверхности эритроцитов морских свинок в ответ на иммунизацию морских свинок штаммами Y. pestis с различной изогенной структурой по данным АСМ

Table 2. Dynamics of changes in AFM parameters of the surface of guinea pig erythrocytes in response to immunization of guinea pigs with Y. pestis strains with different isogenic structures according to AFM data

Группа Group	Штамм Strain	Иммунизирующая доза, КОЕ Immunizing dose, CFU	АСМ-параметры \| AFM parameters
			1-е сутки \| 1^st day		3-и сутки \| 3^rd day		21-е сутки \| 21^st day
			Rq, нм Rq, nm	МЮ, кПа MU, kPa	Rq, нм Rq, nm	МЮ, кПа MU, kPa	Rq, нм Rq, nm	МЮ, кПа MU, kPa
Контроль \| Control		–	70 ± 6	53,03 ± 1,47	72 ± 6	54,03 ± 1,79	68 ± 6	52,03 ± 1,62
1	Y. pestis EV НИИЭГ Y. pestis EV NIIEG	5 × 10⁵	131 ± 7*^#	95,25 ± 2,86*^#	137 ± 6*^#	125.00 ± 3,75*^#°	111 ± 7*^#°	61,14 ± 2,46^#°
2	Y. pestis EV НИИЭГ Y. pestis EV NIIEG	5 × 10⁸	319 ± 8*^#	125,73 ± 4,48*^#	183 ± 7*^#°	142,58 ± 5,98*^#°	150 ± 8*^#°	77,92 ± 3,73*^#°
3	Y. pestis KM 216	5 × 10⁵	129 ± 8*	62,28 ± 2,87	179 ± 9*°	70,02 ± 2,76*	101 ± 8*°	80,27 ± 2,76*°
4	Y. pestis KM 216	5 × 10⁸	153 ± 9*	72,11 ± 2,16*	203 ± 9*°	80,08 ± 3,73*	110 ± 9*°	76,98 ± 3,82*
5	Y. pestis КМ 217	5 × 10⁵	228 ± 7*^#	101,13 ± 3,04*	201 ± 7*^#°	76,14 ± 2,28*°	88 ± 5*^#°	80,60 ± 2,42*°
6	Y. pestis КМ 217	5 × 10⁸	312 ± 7*^#	113,80 ± 5,41*	280 ± 8*^#°	81,61 ± 2,45*°	164 ± 6*^#°	84,41 ± 2,53*°
7	Y. pestis КМ 218	5 × 10⁵	90 ± 5	65,80 ± 1,98*	101 ± 4*	71,22 ± 2,32*	71 ± 5^#	68,52 ± 2,29*
8	Y. pestis КМ 218	5 × 10⁸	110 ± 10*	74,70 ± 2,24*	111 ± 6*	80,37 ± 2,47*°	104 ± 6*^#	77,55 ± 2,51*

Деформационную способность эритроцитов морских свинок оценивали с помощью МЮ. Средние значения МЮ во всех опытных группах на протяжении с 3-х по 21-е сутки превосходили контрольный показатель (табл. 2). Наибольшие значения МЮ регистрировали на 3-и сутки иммуногенеза при иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, особенно при инокуляции вакцинного штамма в дозе 5 × 10⁸ КОЕ по сравнению с 1-ми сутками и контролем (р < 0,05). В случае применения штамма Y. pestis КМ 216 (pYP⁺) в дозе 5 × 10⁵ КОЕ к 21-м суткам иммуногенеза величина МЮ достоверно превышала значения 1-х суток (р < 0,05). При использовании бесплазмидного штамма Y. pestis КМ 218 (7-я и 8-я группы) показатель МЮ оставался на уровне 1-х суток. И, наоборот, при иммунизации морских свинок штаммами Y. pestis EV НИИЭГ, содержащего 3-и основные плазмиды (1-я и 2-я группы) и Y. pestis КМ 217 (pYV⁺) (5-я и 6-я группы), величина МЮ достоверно снижалась (р < 0,05) по сравнению с показателями, установленными в 1-е сутки.

Далее был проведён корреляционный анализ зависимости параметров, характеризующих поверхностную архитектонику мембраны эритроцитов (ТФ, Rq, МЮ), от плазмидного состава штаммов Y. pestis. В результате выявлена прямая умеренной силы связь между показателем Rq и наличием у штамма Y. pestis плазмиды pYV и/или pYP (r = 0,5; р = 0,04).

Обсуждение

В результате проведённого исследования наглядно продемонстрировано вовлечение эритроцитов крови морских свинок в процессы взаимодействия со штаммами Y. pestis, характер которого зависел от их плазмидного состава. Результатом такого взаимодействия было формирование ряда структурных преобразований мембраны клетки макроорганизма и, следовательно, изменение её функции. По нашим данным, большинство трансформированных форм эритроцитов составляли эхиноциты (65,2 ± 2,6%), а также кодоциты и сфероциты (32,4 ± 1,2%). Всего 2,0 ± 0,5% эритроцитов приходилось на долю плоских клеток, которые, по данным литературы [15], вероятнее всего, являются разновидностью молодых форм эритроцитов.

Основные изменения поверхностной архитектоники эритроцитов происходили в течение первых 3 сут после введения вакцинного штамма и его изогенных производных, что укладывается в рамки, предусмотренные развитием нестерильной фазы иммунитета, сопряжённой с активным размножением бактерий в месте введения, регионарных лимфатических узлах и во внутренних органах (селезёнка, печень, лёгкие) [16]). Степень выраженности этих изменений зависела от плазмидного состава штаммов, взятых в исследование, и их иммунизирующей дозы. Эти данные согласуются с ранее полученной информацией о различной способности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных индуцировать на 1-е сутки иммуногенеза секреторную дегрануляцию нейтрофилов крови морских свинок с высвобождением во внеклеточное пространство лейкоцитарной эластазы [17], которая, вызывая деструкцию белкового каркаса эритроцитов [18], может индуцировать появление в крови большого количества эхиноцитов и других морфологически изменённых форм эритроцитов [19].

В первые 3 сут иммунного ответа максимальное количество трансформированных эритроцитов обнаружено в ответ на иммунизацию полноценным по плазмидному составу штаммом Y. pestis EV НИИЭГ (рYТ⁺, pYV⁺, рYP⁺) и моноплазмидным штаммом Y. pestis КМ 217, содержащим плазмиду pYV, кодирующую белки системы секреции III типа (T3SS), эффекторные белки Yops (YopE, YopH, YopM, YopP, YopT, YopO) и регуляторные белки [20]. С одной стороны, эффекторные белки Yops эффективно активируют патогенные виды иерсиний для подавления врождённого иммунного ответа хозяина путём регуляции запрограммированной гибели клеток, а также для ингибирования фагоцитоза и продукции ряда провоспалительных цитокинов [21], нарушая актиновый цитоскелет клеток хозяина, а с другой — поверхностно расположенные белки внешней мембраны (Yops), кодируемые плазмидой pYV Y. pestis, являются наиболее перспективными мишенями для иммунопрофилактики и иммунотерапии чумы [22].

Известно, что плазмида pYV является генетическим элементом, имеющим решающее значение для патогенности, ответственна за мощную инвазионную способность возбудителя чумы Y. pestis и его геморрагические свойства [23]. Попадая в кровь, штамм Y. pestis EV НИИЭГ вступает во взаимодействие с эритроцитами крови. Так, ранее в экспериментах как in vivo, так и in vitro была обнаружена способность штаммов Y. pestis, независимо от их фенотипа, сопряжённого с пигментацией (Pgm⁺/ Pgm^–), и плазмидного профиля, проникать внутрь эритроцитов человека и мыши и разрушать их мембрану [24]. Кроме того, штамм Y. pestis EV НИИЭГ обладает выраженными адгезивными свойствами к эритроцитам человека в результате гидрофобных взаимодействий, которые обусловлены поверхностными структурами микробных клеток, относящимися к липопротеидам [25], что обусловливает его влияние на мембрану клетки.

Наименьшее количество трансформированных эритроцитов обнаружено в ответ на иммунизацию моноплазмидным штаммом Y. pestis КМ216, содержащим только плазмиду пестициногенности рYP, и бесплазмидным штаммом Y. pestis КМ 218, что сопряжено с их низкой иммуногенностью на фоне слабой приживаемости в макроорганизме [13]. К тому же штаммы чумного микроба, отличающиеся по плазмидному профилю, в частности, отсутствию плазмид (pYP, pYV), обладают низкой адгезивной активностью к эритроцитам и легко поглощаются фагоцитами при введении лабораторным животным [26].

В нашем исследовании выявлено изменение прогиба мембраны эритроцита при взаимодействии клеток с Y. pestis, обусловленное изменением упругих свойств мембраны, имеющим место в 1-е сутки иммуногенеза, и постепенно проходящее к 21-м суткам наблюдения [27]. Изменение величины прогиба мембраны сопряжено с нарушением её формы, когда уменьшается островершинность края эритроцита, пропадает линейный участок между центром эритроцита и его краем, координаты максимума на срезе мембраны становятся размытыми, а если прогиб исчезает полностью, то поверхность мембраны становится выпуклой, что сказывается на процессах микроциркуляции в тканях.

Ещё одним параметром, используемым для анализа АСМ-изображений поверхности клеток, является шероховатость, показывающая отклонение рельефа клеточной поверхности от среднего значения. Наиболее выраженное воздействие на величину среднеквадратичной шероховатости поверхности (Rq) эритроцитов в крови морских свинок оказывал штамм Y. pestis EV НИИЭГ (рYТ⁺, pYV⁺, рYP⁺) и его изогенный вариант Y. pestis КМ 217 (pYV⁺) при применении в высокой дозе (5 × 10⁸ КОЕ). Согласно результатам ряда исследований, повышение величины Rq обусловлено образованием выпячиваний интегральных белков из липидного бислоя мембраны эритроцита [28, 29], косвенным свидетельством чего является активация процессов перекисного окисления липидов [30]. В этой связи выявленная корреляционная связь между наличием плазмиды pYV и pYP у изученных штаммов чумного микроба и показателем Rq, по-видимому, объясняется повышенной адгезивной способностью штаммов, содержащих pYV и pYP [26], и укладывается в ранее описанную динамику изменения поверхностной архитектоники эритроцитов на живые вакцины в различные сроки после иммунизации биомодели [3].

Установленное нами достоверное повышение МЮ на 3-и сутки иммуногенеза под влиянием полноплазмидного штамма Y. pestis EV НИИЭГ является свидетельством снижения эластичности и вязкости клеточной мембраны и повышения её жёсткости [31]. Однако на момент формирования иммунного ответа в стерильной фазе иммунитета (21-е сутки) этот показатель существенно снижался, что указывает на восстановление параметров клеточной мембраны эритроцитов (повышение эластичности и увеличение вязкости при одновременном снижении жёсткости клеточной мембраны эритроцита).

Происходящие в первые 3 сут после иммунизации полноплазмидным вакцинным штаммом Y. pestis EV структурные изменения в мембране эритроцитов морских свинок сопряжены с высокой способностью этого штамма приживаться в клетках и тканях макроорганизма, следствием чего является его высокая иммуногенность. Это согласуется с результатами исследования сравнительной иммуногенности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных, продемонстрировавшего прямую зависимость этого показателя от наличия рYТ, pYV и рYP [13].

Таким образом, полученные данные, иллюстрирующие динамику изменения поверхностной архитектоники мембраны эритроцитов в процессе иммуногенеза в ответ на вакцинный штамм чумного микроба и его изогенные производные, не только способствуют пониманию отдельных этапов взаимодействия микро- и макроорганизма, но могут быть использованы как дополнительные характеристики при разработке новых информативных критериев доклинической оценки средств специфической профилактики чумы.

¹ Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199Н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

² Директива Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 № 2010/63/EU о защите животных, использующихся в научных целях.