Молекулярно-генетический портрет вирулентности Stenotrophomonas maltophilia

Полный текст

Введение

Stenotrophomonas maltophilia — грамотрицательный микроорганизм, который широко распространён в природе и часто выделяется из водных источников, почвы, образцов растительного и животного происхождения [1]. Согласно классификатору Берджи¹ род Stenotrophomonas включает три вида. Современные же альтернативные таксономические ресурсы причисляют к данному роду по меньшей мере 19 видов, которые демонстрируют широкое многообразие метаболических путей, а также генетическую и фенотипическую гетерогенность как внутри рода, так и между штаммами каждого отдельно взятого вида [2–4].

S. maltophilia хорошо адаптирована к существованию в различных условиях обитания, включая среды с низким содержанием питательных субстратов, способна утилизировать большой спектр источников углерода (включая трихлорэтилен, бензин, хлороформ) и обладает природной устойчивостью к солям тяжёлых металлов [5, 6].

S. maltophilia является условно-патогенным (оппортунистическим) агентом, обладающим природной множественной лекарственной устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Микроорганизм ассоциирован с рядом серьёзных заболеваний и выделяется при респираторных, урологических инфекциях, бактериемии, эндокардитах и др. [7]. Бактерия представляет интерес и как активный член полимикробных бактериальных сообществ, который воздействует на метаболизм окружающих микроорганизмов, в том числе путём антагонистического подавления представителей других видов (межвидовой антагонизм). Яркий пример такого сообщества наблюдается при муковисцидозе, где S. maltophilia колонизирует респираторный тракт пациентов и часто сосуществует с Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Burkholderia cenocepacia, микобактериями нетуберкулёзного комплекса и др. [8, 9].

Патогенетический базис бактерии определяется факторами вирулентности — молекулярными структурами, обеспечивающими развитие инфекционного процесса. S. maltophilia обладает достаточно широким спектром факторов вирулентности (или факторов, потенциально связанных с вирулентностью), в число которых входят поверхностные структуры бактериальной клетки (липополисахариды (ЛПС), пили/фимбрии и флагеллы (жгутики), продукция внеклеточных энзимов (в частности, протеаз, эластаз, липаз, ДНК- и РНКаз, фибринолизина), способность формировать биоплёнки на абиотических поверхностях и на тканях макроорганизма и осуществлять секрецию во внешнюю среду малых молекул через QS-системы (quorum sensing), получившие название «диффузный сигнальный фактор» (diffusible signal factor — DSF) [6, 11].

Адгезины как фактор вирулентности

Ключевым этапом первоначального взаимодействия «микроорганизм–хозяин» служит адгезия — присоединение бактерии к клеткам ткани макроорганизма. Уже на фазе адгезии бактерии инициируют собственные биохимические процессы, направленные на пролиферацию, инвазию, секрецию токсинов и активацию ответных сигнальных каскадов клеток хозяина.

Бактериальные факторы адгезии (адгезины) представлены белками и ЛПС. Белковые адгезины подразделяются на фимбриальные и афимбриальные. Липополисахаридные и полисахаридные адгезины ассоциированы с клеточной оболочкой (клеточной стенкой, наружной мембраной и капсулой). Следует отметить, что функции ЛПС в патогенезе не ограничиваются первичным взаимодействием «бактерия–макроорганизм»: их значимая роль сохраняется и на последующих этапах инфекционного процесса.

ЛПС (эндотоксин) S. maltophilia состоит из липида A, корового олигосахарида и O-антигена (О-полисахарида) [12, 13]. Липид А в составе ЛПС является потенциальным индуктором продукции макрофагами фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), что было продемонстрировано V.J. Waters и соавт. на мышиной модели [14]. Несмотря на относительно невысокую инвазивность S. maltophilia, уровень ФНО-α после стимуляция клеточной линии макрофагов RAW очищенным липидом А S. maltophilia был значительно выше уровня, полученного при стимуляции липидом A, выделенным из референсного штамма P. aeruginosa PAO1 [14]. Коровые олигосахариды играют важную роль в формировании структуры ЛПС, а следовательно, и вирулентности. Для многих микроорганизмов установлено, что дефектные формы коровых олигосахаридов приводят к существенному снижению вирулентности или возникновению авирулентных штаммов, например, P. aeruginosa [15] и Bordetella bronchiseptica [16]. Не менее важный вклад в формирование вирулентности вносят O-антигены, полная утрата которых или наличие дефектов в их структуре, обусловленных нарушением биосинтеза, может снижать вирулентность микроорганизма, что продемонстрировано, в частности, на видах Burkholderia pseudomallei [17], P. aeruginosa [15], Brucella abortus [18]. ЛПС различных штаммов S. maltophilia отличаются значительной гетерогенностью: известен по меньшей мере 31 вариант O-антигена [19].

В процессах метаболизма сахаров и включения их в ЛПС у S. maltophilia задействованы ряд генов. Ген spgM, кодирующий бифункциональный энзим фосфоглюкомутазу/фосфоманномутазу, аналогичен гену algC, ответственному за синтез алгината у P. aeruginosa [13, 20]. В биосинтезе О-антигена важная роль отводится двум оперонам: rmlBACD и xanAB. T.P. Huang и соавт., выполнив анализ SDS-PAGE очищенных ЛПС из штаммов S. maltophilia с мутациями в генах rmlA, rmlC и xanB, установили, что эти гены непосредственно участвуют в контроле биосинтеза O-антигена, а ген xanB также задействован в синтезе коровой компоненты ЛПС [21]. Авторами показано, что оба оперона также влияют на синтез продуцируемых S. maltophilia экзополисахаридов — ключевых составляющих биоплёнок.

Кроме поверхностных ЛПС, в стадии адгезии задействованы флагеллы (жгутики). S. maltophilia имеет от одной до нескольких флагелл, расположенных на полюсе(ах) бактериальной клетки, которые, в частности, способствуют первичному присоединению к клеткам слизистой трахей мышей и индуцируют специфический имунный ответ макроорганизма [22, 23]. При инфицировании мышей линии BALB/c очищенным флагеллином S. maltophilia через 4 ч у животных регистрировали повышенный уровень цитокинов: интерлейкинов (ИЛ) -1β, -10 и ФНО-α. Также увеличивалось число нейтрофилов, лейкоцитов и моноцитов, что повышало неспецифическую защиту мышей как от S. maltophilia, так и от Staphylococcus aureus [24].

А. Pompilio и соавт. сравнивали тяжесть заболевания мышей при аэрозольном инфицировании диким штаммом S. maltophilia SM111 и мутантным вариантом (ΔfliI), лишённым флагелл. Авторы не обнаружили статистически значимых отклонений в потере животными массы, равно как и в повреждении лёгочной ткани и уровне смертности, хотя значения ФНО-α были выше у животных, инфицированных диким штаммом. В результате авторы сделали своеобразное предположение, что наличие флагелл (следовательно, и подвижность) могут быть не связаны с вирулентными свойствами S. maltophilia в патогенезе заболеваний лёгких [25]. Гипотетически допустимо, что при хронической инфекции микроорганизм, лишённый такого значимого имуногенного фактора, как флагеллин, будет иметь преимущества за счёт снижения иммунного ответа хозяина, что, в частности, наблюдали у не продуцирующих флагеллы штаммов P. aeruginosa от пациентов с муковисцидозом [26]. Однако большинство работ указывают на позитивную корреляцию между подвижностью и первичной адгезией, например [22, 23, 27]. По всей видимости, упомянутое выше предположение об отсутствии связи между наличием флагелл и вирулентными свойствами S. maltophilia может распространяться только на более поздние, хронические стадии инфекции, когда предшествующие заболеванию этапы адгезии микроорганизма уже пройдены.

Подвижность S. maltophilia и уровень экспрессии флагеллинов зависят от факторов внешней среды и контролируются сложной и не полностью изученной генетической системой. Достаточно давно установлено, что в регуляции экспрессии участвует циклический дигуанозинмонофосфат (c-di-GMP) — важная сигнальная молекула (вторичный мессенджер), контролирующая физиологию микроорганизма, его подвижность и процесс образования биоплёнок [28]. Высокая концентрация c-di-GMP в клетке ассоциирована со снижением подвижности [29].

Внутриклеточная концентрация c-di-GMP регулируется изменением активности двух классов энзимов: дигуанилатциклаз и фосфодиэстераз. Первые синтезируют c-di-GMP из 2 молекул гуанозинтрифосфата, а фосфодиэстеразы гидролизуют c-di-GMP до линейного дигуанозинмонофосфата или гуанозинмонофосфата (GMP) [30–32].

Для ряда микроорганизмов известны некоторые генетические детерминанты, так называемые мастер-регуляторы и их гомологи, которые инициируют и регулируют экспрессию генов флагеллинов, например, flaA (fleQ) у P. aeruginosa и Vibrio cholera, flaK и flaM у V. parahaemolyticus [33–36]. Для S. maltophilia механизмы, которыми c-di-GMP контролирует синтез и количество флагелл, остаются малоизученными, и лишь считанные работы посвящены фундаментальным аспектам их функционирования.

В 2014 г. J. Yang и соавт. установили, что регулирование экспрессии флагеллярных генов у S. maltophilia осуществляется гомологичным с P. aeruginosa мастер-регулятором FleQ (Smlt2295) [37]. Этот транскрипционный фактор (энхансер-связывающий белок), действующий в комплексе с предполагаемой АТФазой FleN, ингибируется, связывясь с c-di-GMP, что, в свою очередь, приводит к снижению экспрессии флагеллярных генов и способствует инициации формирования биоплёнок. В отсутствие c-di-GMP, т.е. в несвязанном состоянии, ситуация меняется на противоположную: FleQ способствует повышению экспрессии флагеллинов и, соответственно, снижает способность к «оседлому» образу жизнедеятельности в биоплёнках.

W. Liu и соавт. продемонстрировали наличие корреляции между повышенной экспрессией гена bsmR (регуляторного белка, фосфодиэстеразы с EAL-связывающим доменом) и увеличением подвижности, а также снижением способности к агрегации у штамма S. maltophilia CGMCC 1.1788 [38]. Таким образом, BsmR выступает в роли негативного регулятора образования биоплёнок. Оперон bsmR контролирует экспрессию по меньшей мере 349 генов, 34 из которых участвуют в синтезе флагеллинов под позитивной регуляцией транскрипционного фактора FsnR, который инициирует транскрипцию, связываясь с промотерными регионами двух оперонов: smlt2303 и smlt2318 [39, 40].

В 2022 г. Х. Zhang и соавт. проанализировали гены, потенциально влияющие на уровень c-di-GMP у S. maltophilia, а именно кодирующие белки, содержащие домены GGDEF, EAL и HD-GYP [41]. Авторы обнаружили в геноме микроорганизма 33 гена с искомыми последовательностями и сконструировали мутантные штаммы с инактивированными генами. Из 33 мутантных штаммов 13 обладали пониженной подвижностью, что свидетельствовало о потенциальной роли соответствующих генов в её регуляции. Кроме того, в результате анализа дигуанилатциклаз и фосфодиэстераз авторы идентифицировали новую Fe²⁺-зависимую фосфодиэстеразу SisP, которая при повышении концентрации катионов железа прямо пропорционально увеличивала свою ферментативную активность, т.е. дозозависимо гидролизовала c-di-GMP.

Фимбрии типа 1 (SMF-1) играют роль адгезинов, обеспечивая закрепление S. maltophilia на эпителиальных клетках. В частности, было показано, что адгезия к биотическим и абиотическим поверхностям ингибируется в присутствии анти-SMF-1-антител [42]. Фимбрии также вовлечены в гемагглютинацию и формирование биоплёнок [42], а введение фимбрина мышам линии BALB/c стимулировало у последних выработку ИЛ-1β, ФНО-α и увеличение активности фагоцитов [43]. Важно отметить, что, в отличие от клинических изолятов, штаммы S. maltophilia, выделенные из окружающей среды, были лишены подобных фимбрий [44], что предполагает их значимую роль в адгезии/колонизации респираторного тракта у пациентов с муковисцидозом.

Продукция фимбрий у S. maltophilia контролируется опероном smlt0706–smlt0709 [45]. Несмотря на то что аминокислотные последовательности фимбрина у S. maltophilia схожи с последовательностями патогенных штаммов E. coli, N-терминальный регион белка SMF-1 у S. maltophilia значительно отличается от других бактериальных семейств (50–61% соответствия), что предполагает достаточно сильную филогенетическую удалённость данного вида [42].

Пили IV типа также играют важную роль при адгезии S. maltophilia к биотическим и абиотическим поверхностям, в том числе при формировании биоплёнок [46]. Невзирая на то что пили IV типа рассматриваются многими авторами как важный фактор вирулентности, значимых корреляций между вирулентностью и наличием семейства генов pil, ассоциированных с формированием пилей, у S. maltophilia не обнаружено. Феномен формирования более массивных биоплёнок у штаммов с повышенной подвижностью был описан А. Pompilio и соавт., но данное явление наблюдали на малой выборке штаммов, выделенных из образцов мокроты больных муковисцидозом [5]. Из 9 изученных штаммов, не обладающих подвижностью, только 2 не образовывали биоплёнки. Авторы сделали заключение о том, что подвижность не является обязательным фактором, влияющим на способность образовывать биоплёнки. В то же время штаммы S. maltophilia, выделенные при других заболеваниях, обладали повышенной способностью формировать биоплёнки в сравнении с изолятами от больных муковисцидозом. Очевидно, здесь следует уточнить, что многие авторы под подвижностью подразумевают как «плавательную активность», так и «подёргивание» бактериальной клетки.

Системы секреции и экстрацеллюлярные энзимы

Клинические штаммы S. maltophilia продуцируют сидерофоры, протеазы (StmPr1-4), липазы (включая фосфолипазы C и D), нуклеазы, желатиназу, эластазу, фибролизин/стрептокиназу, эстеразы, гиалуронидазы, гемолизин и цитотоксины, которые выступают как факторы вирулентности и способствуют колонизации и персистированию микроорганизма, участвуя в адгезии, повреждении и уничтожении клеток хозяина, захвате ионов железа, необходимых для бактериального размножения [47, 48].

Основываясь на данных геномного секвенирования, из 9 известных бактериальных систем секреции у S. maltophilia обнаружены системы типов I, II, IV, V и VI [45, 49, 50]. Если для многих микроорганизмов роль систем секреции в формировании вирулентности хорошо известна, то для S. maltophilia она достаточно подробно описана только для систем II (Xps type II) и IV типов.

Клинический штамм S. maltophilia K279a обладает системой T2SS (гены gsp и xps), посредством которой секретируются по меньшей мере 7 белков, в число которых входят три сериновые протеазы StmPr1-3, которые вызывают цитотоксический эффект в эпителиальных клетках лёгких, деградацию фибронектина, фибриногена и ИЛ-8 [51, 52]. Известна и продуцируемая S. maltophilia протеаза StmPr4, но функциональная её роль пока не выяснена [53, 54].

S. maltophilia продуцирует 13 потенциальных антибактериальных белков-эффекторов. При этом кодирующие их нуклеотидные последовательности высоко консервативны для разных штаммов S. maltophilia [55]. Данные эффекторы вырабатываются системой секреции IV типа (T4SS), которая обнаружена как у штаммов, выделенных из природных источников, так и у клинических изолятов S. maltophilia [56]. Эта система, называемая VirB/D4 T4SS, схожа с T4SS у бактерий наиболее близкого рода Xanthomonas и кодируется хромосомными генами virB1-virB11 и virD4. Белки-эффекторы секретируются системой T4SS в окружающую среду или прямым контактным путем непосредственно в бактериальную клетку-конкурент, реализуя тем самым межвидовой антагонизм.

Межвидовой антагонизм, присущий S. maltophilia, изящно описали M.Y. Nas и соавт. [56]. Авторы показали, что штаммы S. maltophilia, используя T4SS, вызывали гибель природного изолята P. aeruginosa 7700, штаммов P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa PAK. Интересно, что S. maltophilia оказывает влияние и на некоторые другие виды рода Pseudomonas, но весьма избирательно. Например, S. maltophilia убивает P. mendocina, но не P. fluorescens, P. putida или P. stutzeri.

Заслуживает внимания факт выделения из упомянутых выше 13 антибактериальных эффекторов S. maltophilia двух потенциальных белков — RS14245 и RS14255, обладающих бактерицидными свойствами в отношении представителей родов Pseudomonas и Escherichia. Нейтрализованные при помощи блокирующих белков эффекторы RS14245 и RS14255 при добавлении в среду не приводили к гибели лабораторных и клинических штаммов P. aeruginosa и E. coli. Мутантные штаммы, лишённые этих белков или системы T4SS, обладали значительно сниженными бактерицидными свойствами [55].

Полученные данные интересны с различных точек зрения. С одной стороны, секреция эффекторов, подавляющих иные бактериальные виды, является значимым фактором, повышающим вирулентность S. maltophilia; с другой — выделение и изучение таких эффекторов потенциально может быть использовано для создания новых противомикробных препаратов для таргетной (адресной) терапии инфекций, вызванных псевдомонадами и эшерихиями.

Следует отметить, что система T4SS используется S. maltophilia не только для конкурентного межвидового ингибирования. Продукты данной системы выполняют и другие важные функции — ингибируют апоптоз в эпителиальных клетках хозяина и инициируют его в макрофагах [56].

Биоплёнки

При формировании биоплёнок первичная адгезия (слабое обратимое присоединение) планктонных форм S. maltophilia наступает уже в течение 30–60 мин. Вторая стадия развивается после 4 ч, при которой с участием полугибких фимбрий, филаментов флагелл и поверхностных ЛПС микроорганизм прочно закрепляется на поверхности. Закрепившиеся клетки начинают продуцировать экзополисахариды, формируя внеклеточный матрикс, а приблизительно через 10 ч образуют первые поверхностные микроколонии. Через 18–24 ч процесс переходит в третью стадию, на которой в созревающих биоплёнках происходит дифференциация клеток, образуются микроканалы для транспорта воды, солей, питательных веществ и обмена коммуникационными сигнальными молекулами (QS), о которых будет сказано ниже. На последней стадии созревшие биоплёнки порционно «отпочковывают» планктонные формы бактерий, которые за счёт присущей им подвижности начинают распространяться и колонизировать новые ниши [20].

В 2020 г. L. Ramos-Hegazy и соавт., проанализировав созданную ими библиотеку мутантных транспозонов, идентифицировали ген gpmA, кодирующий фосфоглицератмутазу — гликолитический энзим, потенциально участвующий в начальных стадиях формирования биоплёнок как на полистироле, так и на линии человеческих эпителиальных клеток бронхов [57]. Штаммы S. maltophilia с нокаутированным геном gpmA в первые часы обладали существенно сниженной скоростью образования биоплёнок в сравнении со штаммом дикого типа. Интересно, что через 6 ч разница в скорости образования биоплёнок у штаммов дикого и мутантного типов полностью нивелировалась, что предполагает участие гена gpmA как медиатора на начальных этапах адгезии и образования биоплёнок [57, 58].

А. Pompilio и соавт. проанализировали 85 штаммов, выделенных как от больных муковисцидозом, так и при других инфекциях. Подавляющее большинство всех штаммов (88,2%) образовывали биоплёнки в тесте на планшетах. При этом штаммы, ассоциированные с муковисцидозом, демонстрировали меньшую оптическую плотность биоплёнок, но обладали большей множественной устойчивостью в сравнении с «немуковисцидозными» штаммами [59]. Вероятно, усиленное образование биоплёнок может служить защитным механизмом выживания именно для чувствительных микроорганизмов.

Анализ транскриптомных профилей клеток из биоплёнок (в сравнении с планктонными формами) показал, что лишь относительно малая доля генов вовлечена в переход к существованию в биоплёнках: уровень экспрессии снижается у 1–3% генов и увеличивается у 6–9% генов [60]. Тем не менее анализ имеющихся сведений о роли многочисленных факторов вирулентности приводит к заключению о том, что переход клеток от планктонного образа жизни к «оседлому» в биоплёнках инициируется множеством механизмов, которые требуют дальнейшего изучения.

Эффлюкс-помпы как факторы вирулентности

Как правило, эффлюкс-помпы принято рассматривать в числе механизмов, обеспечивающих микроорганизму устойчивость к противомикробным препаратам. Тем не менее функции некоторых типов эффлюкс-помп более широкие — они выходят за рамки, определённые термином «антибиотикорезистентность», и вовлечены в молекулярные механизмы формирования вирулентных свойств.

Эффлюкс-помпы вносят существенный вклад в природную устойчивость S. maltophilia к противомикробным препаратам. Обнаруженные у бактерии помпы различных типов выводят широкий спектр препаратов: фторхинолоны, тетрациклин и доксорубицин под контролем SmrA-помпы; аминогликозиды, макролиды и полимиксины — посредством принадлежащей к этому же семейству ABC-помп (от ATP-binding cassette) MacABCsm [61].

Помпа EmrCABsm из суперсемейства транпортеров MFS (major facilitator superfamily) ответственна за вывод налидиксовой кислоты, эритромицина, карбонил-цианид-3-хлорфенилгидразона и тетрахлорсалициланилида) [62]. FusA (тип ABC) выводит фузариевую кислоту [63]. Кроме того, S. maltophilia имеет 8 типов помп RND-типа (Sme*), для 7 из которых (кроме SmeMN) их роль в формировании антибиотикорезистентности уже установлена. Кроме перечисленных выше противомикробных препаратов они также участвуют в транпорте сульфаметоксазола, хлорамфеникола, триметоприма и триметоприм-сульфаметоксазола [64].

Интересно отметить, что эффлюкс-помпы SmeYZ и MacABCsm, кроме известной (и считающейся в настоящее время основной) фунции вывода ксенобиотиков из бактериальной клетки, оказывают влияние и на формирование флагелл, подвижность S. maltophilia и образование биоплёнок. При этом MacABCsm отличается от гомологичных помп других микроорганизмов. В частности, экспрессия её оперона конститутивна, имеет «врождённую» природу, и помпа обладает собственным оригинальным внешним мембранным белком MacCsm. Кроме того, в сравнении с гомологичной помпой MacAB-TolC из E. coli, она, как уже отмечалось, имеет расширенный спектр выводимых анитибиотиков, включая макролиды, аминогликозиды и полимиксины [61].

Ещё одна заслуживающая внимания функция эффлюкс-помп была описана C.J. Wu и соавт., которые показали, что помпы SmeYZ, SmeDEF и SbiAB оказывают влияние на секрецию сидерофора стенобактина и утилизацию ионов железа [65].

Для некоторых микроорганизмов продемонстрирована роль эффлюкс-помп, в частности, их внешних мембранных структур — поринов — в увеличении инвазивных свойств бактерий [66] и защите последних от фагоцитоза [67], но для S. maltophilia такой информации не опубликовано.

Вновь полученные данные свидетельствуют о том, что сложившееся у нас представление об основной функции эффлюкс-помп, сводящейся только к выводу из клетки ксенобиотиков, не является абсолютной догмой и требует критического пересмотра и дальнейшего изучения.

Связь факторов вирулентности с доступностью железа

Железо является жизненно необходимым элементом для нормального метаболизма неферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий, включая S. maltophilia. Конкуренция за железо между бактериями и организмом хозяина при хронических инфекциях может негативно влиять на организм хозяина. Захват железа бактериями может сопровождаться как местными повреждениями тканей, так и системными поражениями, например, выраженными анемиями. Поэтому системы, обеспечивающие захват и транспорт железа внутрь бактериальной клетки, рассматриваются как значимые факторы вирулентности [68].

У S. maltophilia обнаружены сидерофор- и гем-опосредованные системы транспорта в бактериальную клетку ионов железа. Опероном entAFDBEC кодируется синтез сидерофора энтеробактина, относящегося к классу катехоламинов, связывающего и переносящего Fe³⁺ в бактериальную клетку. Гем-опосредованная система находится под контролем оперонов hgbBC и, вероятно, hmuRSTUV [69].

Очень интересно, что система захвата железа не только сама является фактором вирулентности, но и может индуцировать активность других механизмов, ответственных за вирулентные свойства. Это происходит при дефиците железа в окружающей среде. Например, в лёгочной ткани при наличии в микроокружении железосвязывающих белков человека (трансферрин, лактоферрин), снижающих уровень свободного железа в среде, микроорганизм становится более вирулентным [70, 71]. В частности, при дефиците железа референс-штамм S. maltophilia K279a продуцировал повышенное количество экзополисахаридов, сигнальных молекул DSF и формировал более утолщённые и массивные биоплёнки [69, 71]. Установлено, что в регуляции такого метаболического изменения задействованы железообеспечивающая система Fur и транскрипционный регулятор σ-фактор, а от биодоступности железа потенциально зависят ответ микроорганизма на окислительный стресс и секреция экстрацеллюлярных энзимов [69, 71].

Система Quorum Sensing

Как большинство грамотрицательных бактерий, S. maltophilia (в частности, референс-штамм K279a) обладает QS-системой — уникальным сигнальным механизмом межклеточного бактериального обмена информацией [72]. Система отвечает за продукцию внеклеточных сигнальных молекул, называемых аутоиндукторами, их детекцию и ответ (изменение экспрессии определённых генов) на появление сигнальных молекул в среде. Аутоиндукторы накапливаются в среде, и при достижении некой пороговой концентрации окружающие бактериальные клетки способны их детектировать. Посредством такого обмена сигнальными молекулами клетки регулируют свои метаболические механизмы, отвечающие за колонизацию и вирулентность, включая изменение подвижности, образование биоплёнок, продукцию экстрацеллюлярных эффекторов и резистентные свойства [73, 74].

T.P. Huang и соавт. установили, что основной молекулой в QS-системе у S. maltophilia является аутоиндуктор DSF, представляющий собой cis-Δ2-11-метил-лауриновую кислоту — одноосновную насыщенную жирную кислоту, синтез которой регулируется генами rpfF и rpfB (от regulation of pathogenicity factors) [72]. За синтез собственного DSF и узнавание «чужих» сигнальных молекул ответственен генный кластер rpf — регулятор факторов вирулентности, для которого известны два варианта: rpf1 и rpf2, делящие всю популяцию S. maltophilia на фено- и генотипически отличающиеся субпопуляции [74]. Кластер rpf кодирует синтез RpfF-синтазы и двукомпонентной системы RpfC/RpfG, отвечающих за детекцию и трансдукцию DSF. В активной форме RpfG-фосфодиэстераза гидролизует c-di-GMP до линейного GMP, таким образом регулируя экспрессию ряда генов вирулентности [75]. Здесь необходимо отметить, что только штаммы с вариантом гена rpf-1 изначально способны продуцировать DSF в детектируемом количестве без внешнего стимула и, следовательно, контролировать образование биоплёнок, а также подвижность и вирулентность окружающих бактерий [74, 76]. У штаммов с rpf-2 N-терминальный (сенсорный) конец RpfF-синтазы укорочен. Предполагается, что таким штаммам с редуцированным сенсорным доменом для выработки в среду собственных сигнальных молекул (DSF) требуется предварительная активация извне (например, под воздействием DSF от других бактерий или от штаммов S. maltophilia с системой rpf-1) [76].

Интересно отметить, что штаммы, несущие rpf-2-вариант гена (в частности, геногруппы C), проявляли больший уровень устойчивости к колистину и повышенную вирулентность в отношении личинок восковой моли Galleria mellonella, которые используются в качестве одной из моделей для оценки вирулентности. По всей видимости, это связано с повышенной способностью rpf-2-штаммов образовывать биоплёнки [77]. В то же время на другой модели определения вирулентности, в которой используются нематоды Caenorhabditis elegans, такой ассоциации не выявлено [77]. Генотипирование и идентификация варианта rpf являются полезными и важными инструментами эпидемиологического мониторинга, при котором следует учесть, что штаммы S. maltophilia потенциально могут обмениваться кластерами rpf путём рекомбинации при горизонтальном переносе генов [76].

У S. maltophilia обнаружена двухкомпонентная сигнальная система трансдукции, названная BfmA–BfmK (Smlt4209–Smlt4208). Транскрипционный фактор BfmA, входящий в систему, связывется с промотерным регионом bfmA–bfmK и Smlt0800 (acoT) — геном, кодирующим ацил-коэнзим A-тиоэстеразу, которая ассоциирована с образованием биоплёнок [40].

В отличие от P. aeruginosa, у S. maltophilia не обнаружено полноценной канонической QS-системы LuxI/LuxR, основанной на сигнальных молекулах ацил-гомосерин лактонов. Тем не менее Р. Martínez и соавт., выполнив сравнительный анализ геномов, показали, что у S. maltophilia присутствует схожий с регулятором LuxR ген smlt1839, кодирующий регулятор SmoR (Stenotrophomonas maltophilia orphan regulator), который in vitro связывал синтетический лактон oxo-C8-HSL, природный аналог которого синтезирует P. aeruginosa. Добавление же концентрированного супернатанта среды, на которой культивировалась P. aeruginosa, продуцирующая лактоны, стимулировало повышенную подвижность S. maltophilia на чашках Петри [78]. Другими словами, несмотря на отсутствие канонической системы LuxI/LuxR, собственные гомологичные системы межклеточного обмена позволяют S. maltophilia распознавать QS-сигнальные молекулы других видов с системой LuxI/LuxR. Гипотетически возможно, что эти системы связаны с T4SS и в определённых условиях могут инициировать секрецию эффекторов, нацеленных на ингибирование роста конкурентов (см. выше).

Рассматривая систему DSF у S. maltophilia, следует упомянуть феномен секреции через везикулы внешней мембраны [79]. Везикулы представляют собой малые наноструктуры, секретируемые бактериями, способные переносить нуклеиновые кислоты, белки и иные молекулы, например β-лактамазы. S. Devos и соавт. обнаружили, что в присутствии имипенема S. maltophilia секреция этих везикул резко увеличивается [80]. Интересен и состав обнаруженных переносимых в них молекул: это были кодируемые хромосомами два типа β-лактамаз, белки внешней мембраны и флагеллины Smlt0387 и Smlt0184. Эти флагеллины являются гомологами Ax21 — белка, влияющего на подвижность и образование биоплёнок у Xanthomonas oryzae. Функциональная роль этого белка для S. maltophilia пока не установлена, но предполагается, что его секреция инициируется DSF. Саму же систему секреции через везикулы относят к потенциальным факторам вирулентности на основе данных, что она влияет на подвижность и образование биоплёнок X. oryzae [81].

Заключение

В последнее десятилетие изучению механизмов вирулентности S. maltophilia уделяется пристальное внимание. Природная множественная лекарственная устойчивость микроорганизма, его быстрая адаптация к неблагоприятным условиям окружающей среды и к новым нишам обитания, изящное переключение бактерией метаболических процессов — всё это вызывает немалый интерес как у специалистов, изучающих фундаментальные механизмы вирулентности, так и у клинических исследователей.

Обсуждая вирулентные свойства S. maltophilia, необходимо учитывать, что эта бактерия характеризуется выраженной внутривидовой вариабельностью: штаммы, выделенные в одном госпитале и даже от одного пациента, могут принадлежать к достаточно отдалённым филогенетическим группам и иметь разные фенотипы [4]. В качестве вероятных причин такой гетерогенности рассматривается быстрое накопление адаптивных мутаций, возникающих под влиянием селективного давления госпитальных условий или организма-хозяина, и горизонтальный перенос генов. Понимание молекулярных процессов, обеспечивающих быструю адаптацию и, соответственно, выживание микроорганизма в неблагоприятных условиях, позволит обнаружить потенциальные мишени для разработки новых антибактериальных препаратов, а также лучше понять межвидовые взаимодействия при полимикробных инфекциях и установить механизмы переключения метаболических путей при переходе оппортунистических патогенов от «природного» образа жизни к инфекционной интервенции.

В настоящем обзоре мы в кратком изложении представили актуальные данные, затрагивающие молекулярные аспекты факторов вирулентности S. maltophilia, для краткости не касаясь при этом механизмов антибиотикорезистентности. Надеемся, что обзорная статья будет интересна молекулярным биологам, клиническим микробиологам и биохимикам.

 

¹ Palleroni N.J. Stenotrophomonas // Bergey's Manual of Systematic of Archaea and Bacteria. URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9781118960608.gbm01237

Об авторах

Владимир Михайлович Михайлович

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

Email: nizarnn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4894-1304

д.б.н., с.н.с., зам. зав. лаб. биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

Россия, Москва

Рустам Николаевич Гейдаров

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

Email: nizarnn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4971-2629

старший лаборант лаб. биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

Россия, Москва

Юлия Александровна Бочарова

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова

Email: nizarnn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0197-0255

к.м.н., в.н.с. лаб. молекулярной микробиологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Россия, Москва

Игорь Викторович Чеботарь

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова

Автор, ответственный за переписку.
Email: nizarnn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6691-2171

д.м.н., зав. лаб. молекулярной микробиологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы