Отправить статью по E-mail Нанокомпозиты, состоящие из наночастиц диоксида титана, антисмысловых олигонуклеотидов и фотоактивируемых групп, как агенты для эффективного воздействия на нуклеиновые кислоты
- Авторы: Левина А.С.1, Репкова М.Н.1, Мазурков О.Ю.2, Макаревич Е.В.2, Мазуркова Н.А.2, Зарытова В.Ф.1
-
Учреждения:
- Институт химической биологии и фундаментальной медицины
- Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
- Выпуск: Том 101, № 1 (2024)
- Страницы: 127-132
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Дата подачи: 03.10.2023
- Дата публикации: 13.03.2024
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/17775
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-456
- EDN: https://elibrary.ru/zopuhr
- ID: 17775
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Актуальность. Исследования на модельных системах подтвердили эффективность антисмысловых олигонуклеотидов, в том числе содержащих фотоактивируемые группы, для модификации нуклеиновых кислот (НК), однако эта стратегия пока не нашла широкого применения из-за отсутствия успешных методов доставки в клетки. Создание эффективных препаратов, способных воздействовать на НК-мишени в клетках, является актуальной задачей.
Цель работы — создание нанокомпозитов, состоящих из наночастиц TiO2, олигонуклеотидов и фотоактивируемых групп, и исследование их воздействия на НК-мишени на примере ингибирования репликации вируса гриппа А в клеточной системе.
Материалы и методы. В работе использовали вирус гриппа A/Aichi/2/68 (A/H3N2), N-сукцинимидный эфир п-азидотетрафторбензойной кислоты, TiO2-наночастицы (анатаз) и олигодезоксирибонуклеотиды. Противовирусную активность созданных нанокомпозитов исследовали на клетках MDCK, заражённых вирусом A/H3N2.
Результаты и обсуждение. Созданы уникальные нанокомпозиты, состоящие из трех функциональных компонентов: наночастиц TiO2, олигонуклеотидов и фотоактивируемой тетрафторарилазидогруппы, обеспечивающих, соответственно, проникновение в клетки, селективное взаимодействие с НК-мишенями и фотомодификацию этих мишеней. Продемонстрирован значительный противовирусный сайт-специфический эффект предложенных нанокомпозитов в отношении вируса гриппа А в клеточной системе, который превышает эффект аналогичных препаратов, не содержащих фотоактивируемую группировку.
Заключение. Продемонстрирована биологическая активность созданных нанокомпозитов на примере высокоэффективного подавления репликации вируса гриппа А в клеточной системе. Полученные результаты указывают на перспективность использования предложенных препаратов для воздействия на НК-мишени внутри клеток.
Полный текст
Введение
Реакционноспособные производные олигонуклеотидов (ON) широко используются для сайт-специфической модификации нуклеиновых кислот (НК). Этот подход, впервые предложенный Н.И. Гриневой и соавт. [1], основан на сохранении способности ON, несущих химически активные группы, образовывать комплементарные комплексы с НК-мишенью, что обеспечивает её направленную модификацию. ON играет роль адреса, обеспечивающего комплементарное связывание с фрагментом целевой НК. Реактивная группа модифицирует этот фрагмент и блокирует функцию НК. В последние годы эта стратегия, так называемый антисмысловой подход, получила широкое признание.
Для воздействия на НК широко используются производные ON, содержащие различные фотоактивируемые группы. Эти группы стабильны в физиологических условиях и инертны в темноте и реагируют только при облучении, поэтому можно инициировать реакцию в любой момент и легко контролировать процесс модификации. Ароматические азиды представляют особый интерес, поскольку они обладают высоким квантовым выходом, т.е. не требуют высокой интенсивности и длительного времени экспозиции для активации. Ранее показано, что производные ON, несущие перфторарилазидную группу, оказались высокоэффективными реагентами для модификации НК [2, 3].
Исследования на различных модельных системах подтвердили эффективность ON для модификации НК, однако эта стратегия пока не нашла широкого применения. Основным препятствием является отсутствие эффективных методов доставки ON и их реакционноспособных производных в клетки. Для этой цели часто используются неорганические наночастицы различной природы [4, 5]. Известно, что наночастицы оксида титана (TiO2) проникают в клетки [6]. В наших предыдущих работах показано, что ON-содержащие нанокомпозиты на основе наночастиц TiO2 способны проникать через клеточную мембрану [7, 8]. В работах [9–11] продемонстрирован противовирусный эффект нанокомпозитов на основе наночастиц TiO2, несущих нативные олигодезоксирибонуклеотиды, в отношении вируса гриппа А.
Целью данной работы было создание нанокомпозитов, состоящих из наночастиц TiO2 и ON с фотоактивируемыми группами, и исследование их воздействия на НК-мишени на примере ингибирования репликации вируса гриппа А в клеточной системе.
Материалы и методы
В работе использовали клетки MDCK, вирус гриппа A/Aichi/2/68 (A/H3N2) (ГНЦ ВБ «Вектор»); ON, синтезированные на ДНК-синтезаторе «ASM-800» («Biosset»). N-сукцинимидный эфир п-азидотетрафторбензойной кислоты (ArN3-SuIm) получен по методу [12].
Наночастицы TiO2 в кристаллической форме анатаза получали гидролизом изопропоксида титана Ti(O-iPr)4 [7, 8].
Нанокомпозиты первого типа TiO2/PL–ON с ковалентной связью между ON и полилизином (PL) получали с практически количественным выходом [8] при смешивании заранее полученного конъюгата PL–ON с наночастицами анатаза. Нанокомпозиты второго типа TiO2/PL▪ON с ионной связью между ON и PL получали при смешивании ON с TiO2-наночастицами с заранее иммобилизованным PL с ёмкостью по аминогруппам PL 1 мкмоль/мг [8]. Выход при получении обоих типов нанокомпозитов был практически количественный; ёмкость по ON — 20 нмоль/мг.
Все манипуляции с наночастицами и нанокомпозитами проводили после обработки ультразвуком в течение 30 с в ультразвуковой ванне («Сапфир»). Характеристика нанокомпозитов проведена с использованием физико-химических методов (просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения, сканирующая электронная микроскопия, малоугловое рентгеновское рассеяние) и описана ранее [7, 8]. Показано, что размер нанокомпозитов был больше на ~1 нм размера исходных наночастиц (~5 нм), что указывало на образование комплексов между фрагментами ДНК и наночастицами. Соотношение фосфата и титана (P/Ti) в нанокомпозитах показало хорошую корреляцию между расчётными и экспериментальными данными. Используя радиоактивно и флуоресцентно меченные ON, мы подтвердили их прикрепление к наночастицам и показали, что ON в обоих типах нанокомпозитов сохранили свою способность образовывать комплементарные комплексы и могут проникать в эукариотические клетки [7, 8, 11].
Введение фотоактивируемой арилазидной группы в ON проводили по методу [2] при обработке ON, содержащего концевую аминогруппу, с помощью ArN3-SuIm и получали ON*, содержащий арилазидную группу, который использовали для получения нанокомпозитов TiO2/PL▪ON*. Нанокомпозиты TiO2/PL*–ON получали при обработке нанокомпозитов TiO2/PL–ON с помощью ArN3-SuIm [13].
Противовирусную активность созданных нанокомпозитов исследовали на клетках MDCK, заражённых вирусом A/H3N2 [13]. Заражённые вирусом клетки MDCK, не обработанные нанокомпозитами, использовали в качестве контроля.
УФ-облучение зараженных клеток MDCK проводили в процессе инкубации с нанокомпозитами лампой «PL-S 9W/10» (350–400 нм, 10 мВ/см2, дистанция 1 см; «Philips»).
Результаты и обсуждение
Для создания нанокомпозитов использовали две стратегии [8]. Первый метод (1) состоит в электростатическом связывании ON с предварительно подготовленными наночастицами, покрытыми PL (TiO2/PL). Второй метод (2) состоит в иммобилизации PL-содержащих олигодезоксирибонуклеотидов (PL–ON) на TiO2-наночастицах.
TiO2/PL + ON → TiO2/PL▪ON; (1)
TiO2 + PL–ON → TiO2/PL–ON. (2)
Для получения фотоактивируемых нанокомпозитов в первом случае на наночастицах TiO2/PL иммобилизовали ON с предварительно введённой фотоактивируемой арилазидной группой [2] и получали нанокомпозиты TiO2/PL▪ON*. Во втором случае перфторарилазидную группу присоединяли к аминогруппам PL в сформированном нанокомпозите и получали TiO2/PL*–ON. Таким образом, получены два типа нанокомпозитов: с ионной (▪) или ковалентной (–) связью между ON и PL, причём фотоактивируемая группа введена либо в ON в первом случае, либо в остаток PL во втором случае.
В качестве ON в нанокомпозитах использовали 21-мерный олигодезоксирибонуклеотид 5’-GCAAAAGCAGGGTAGATAATCp (ODN), комплементарный 3’-концевой области (–)РНК 5-го сегмента вируса гриппа А, кодирующего белок NP, и 5’-GATCAACTCCATATGCCATGTp (SCR) со случайной последовательностью в качестве контроля.
В исследованиях противовирусной активности на клетках MDCK, заражённых вирусом A/H3N2, использовали нанокомпозиты в нетоксичной для клеток концентрации 100 мкг/мл. Ингибирование вируса в клетках MDCK выражали в виде логарифма индекса подавления продукции (ИПП) вируса. Значение log ИПП равняется разности логарифмов титра вируса в клетках в отсутствие (контроль) и в присутствии образцов. Таким образом, log ИПП означает, на сколько порядков происходит ингибирование вируса; чем выше log ИПП, тем более эффективно действует исследуемый препарат.
Прежде всего, следует отметить, что нанокомпозиты обладают сайт-специфическим действием, т.е. «комплементарные» нанокомпозиты, несущие ODN, комплементарный вирусной РНК, проявляют существенно бóльшую активность по сравнению с «некомплементарными» нанокомпозитами, несущими случайную последовательность SCR (рисунок). Разница составляет 1,5–2,0 порядка до облучения, после облучения этот эффект выражен даже в большей степени.
Противовирусная активность образцов нанокомпозитов на основе наночастиц TiO2, содержащих комплементарный (ODN) и некомплементарный (SCR) ON по отношению к вирусной РНК, а также содержащих или не содержащих фотоактивируемую арилазидную группу на остатке полилизина или ON (соответственно PL*, ODN*, SCR* и PL, ODN, SCR). Светлые столбики — до ультрафиолетового облучения культуры зараженных клеток с образцами, тёмные — после. lpf — липофектамин.
Antiviral activity of samples expressed as the logarithm of the virus production suppression index. TiO2-based nanocomposites contained complementary and non-complementary oligonucleotides to viral RNA (ODN and SCR, respectively); they contained the photoactive arylazide group on the polylysine residue or oligonucleotide (PL*, ODN*, or SCR*) or did not contain this group. The light and dark columns correspond to the results before and after UV irradiation of infected cell cultures with samples, respectively; lpf, lipofectamine.
ODN* проявляет примерно на порядок бóльшую активность после облучения независимо от того, в составе какого нанокомпозита он доставлен в клетки (рисунок). Как и следовало ожидать, «комплементарные» нанокомпозиты, не содержащие фотоактивируемую группу, не отличаются по своей активности до и после облучения. Противовирусная активность комплементарных ODN почти не зависит от наличия фотоактивируемой группы в составе нанокомпозита, если они не подвергаются облучению. Положение фотоактивируемой группы в нанокомпозите (на остатке полилизина или в ODN) практически не влияет на противовирусный эффект.
Интересно отметить, что «некомплементарные» нанокомпозиты, несущие фотоактивируемую группу, менее активны после облучения (рисунок). Возможно, этот эффект вызван автодеструкцией SCR при облучении в том случае, если он не находится во взаимодействии с комплементарной мишенью, что приводит к снижению противовирусной активности.
Как и в случае, когда ODN находится в составе нанокомпозитов, не связанный с наночастицами ODN, доставленный в клетки с помощью липофектамина (широко используемого трансфекционного агента), проявляет бόльшую активность после облучения, если он содержит арилазидную группу, а активность немеченого ODN не зависит от облучения (рисунок). Во всех случаях ODN в составе нанокомпозитов проявляет несколько бóльшую противовирусную активность по сравнению с тем, когда он доставлен в клетки в присутствии липофектамина.
Заключение
Таким образом, созданы уникальные нанокомпозиты, состоящие из трех функциональных компонентов: наночастиц TiO2, антисмыслового ODN и фотоактивируемой тетрафторарилазидогруппы, обеспечивающих, соответственно, проникновение в клетки, селективное взаимодействие с НК-мишенями и фотомодификацию этих мишеней. Продемонстрирован значительный противовирусный сайт-специфический эффект предложенных нанокомпозитов для воздействия на НК-мишени на примере ингибирования репликации вируса гриппа А в клеточной системе. Показано, что нанокомпозиты, содержащие фотоактивируемую группу, более эффективны по сравнению с немодифицированными аналогами. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования предложенных препаратов для воздействия на НК-мишени внутри клеток.
Об авторах
Ася Сауловна Левина
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Email: Levina@niboch.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-2423-3805
к.х.н., с.н.с. лаб. нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН
Россия, НовосибирскМарина Николаевна Репкова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Email: repk56@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7108-9036
к.х.н., н.с. лаб. нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН
Россия, НовосибирскОлег Юрьевич Мазурков
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Email: mazurkov_oyu@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-8164-4091
к.б.н., н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор»
Россия, Кольцово, Новосибирская областьЕлена Викторовна Макаревич
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Email: makarevich_ev@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-5146-8979
н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор»
Россия, Кольцово, Новосибирская областьНаталья Алексеевна Мазуркова
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Email: mazurkova@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-1896-2684
д.б.н., в.н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор»
Россия, Кольцово, Новосибирская областьВалентина Филипповна Зарытова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Автор, ответственный за переписку.
Email: zarytova@niboch.ncs.ru
ORCID iD: 0000-0002-9579-9972
д.х.н., г.н.с. лаб. нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН
Россия, НовосибирскСписок литературы
- Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. Tetrahedron Lett. 1967;37:3557–62. DOI: https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)89794-x
- Levina A.S., Berezovskii M.V., Venjaminova A.G., et al. Photomodification of RNA and DNA fragments by oligonucleotide reagents bearing arylazide groups. Biochemie. 1993;75(1-2): 25–7. DOI: https://doi.org/10.1016/0300-9084(93)90020-s
- Levina A.S., Tabatadze D.R., Dobrikov M.I., et al. Site-specific photomodification of single-stranded DNA targets by arylazide and perfluoroarylazide derivatives of oligonucleotides. Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 1996;6(2):119–26. DOI: https://doi.org/10.1089/oli.1.1996.6.119
- Kim T.H., Kim M., Eltohamy M., et al. Efficacy of mesoporous silica nanoparticles in delivering BMP-2 plasmid DNA for in vitro osteogenic stimulation of mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 2013;101(6):1651–60. DOI: https://doi.org/10.1002/jbm.a.34466.
- Kovtun A., Neumann S., Neumeier M., et al. Nanoparticle-mediated gene transfer from electrophoretically coated metal surfaces. J. Phys. Chem. B. 2013;117(6):1550–5. DOI: https://doi.org/10.1021/jp303448v
- Thurn K.T., Arora H., Paunesku T., et al. Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells. Nanomedicine. 2011;7(2):123–30. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nano.2010.09.004
- Levina A., Ismagilov Z., Repkova M., et al. Nanocomposites consisting of titanium dioxide nanoparticles and oligonucleotides. J. Nanosci. Nanotech. 2012;12(3):1812–20. DOI: https://doi.org/10.1166/jnn.2012.5190
- Левина А.С., Исмагилов З.Р., Репкова М.Н. и др. Создание TiO2~DNA-нанокомпозитов, способных проникать в клетки. Биоорганическая химия. 2013;39(1):87–98. Levina A.S., Repkova M.N., Shatskaya N.V., et al. Design of TiO2~DNA nanocomposites for penetration into cells. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2013;39(1):77–86. DOI: https://doi.org/10.1134/S1068162013010068 EDN: https://elibrary.ru/reyqpd
- Levina A.S., Repkova M.N., Bessudnova E.V., et al. High antiviral effect of TiO2·PL-DNA nanocomposites targeted to conservative regions of (–)RNA and (+)RNA of influenza A virus in cell culture. Beilstein J. Nanotechnol. 2016;7:1166–73. DOI: https://doi.org/10.3762/bjnano.7.108
- Levina A.S., Repkova M.N., Ismagilov Z.R., et al. High-performance method for specific effect on nucleic acids in cells using TiO2~DNA nanocomposites. Sci. Rep. 2012;2:756. DOI: https://doi.org/10.1038/srep00756
- Levina A.S., Repkova M.N., Mazurkova N.A., Zarytova V.F. Nanoparticle-mediated nonviral DNA delivery for effective inhibition of influenza A viruses in cells. IEEE Trans. Nanotechnol. 2016;15(2):248–54. DOI: https://doi.org/10.1109/TNANO.2016.2516561 EDN: https://elibrary.ru/wtfubh
- Добриков М.И., Приходько T.A., Сафронов И.В., Шишкин Г.В. Синтез и свойства светочувствительных капроновых мембран. Фотоиммобилизация ДНК. Сибирский химический журнал. 1992;(2):18–24. Dobrikov M.I., Prikhod'ko T.A., Safronov I.V., Shishkin G.V. Synthesis and properties of photosensitive nylon membranes. Photo immobilization of DNA. Siberian Chemical Journal. 1992;(2):18–24.
- Зарытова В.Ф., Исмагилов З.Р., Левина А.С. и др. Нанокомпозит с активным лигандом, способ его приготовления и способ адресной инактивации вируса гриппа внутри клетки. Патент РФ № 2496878;2012. Zarytova V.F., Ismagilov Z.R., Levina A.S., et al. A nanocomposite with an active ligand, a method for its preparation and a method for targeted inactivation of the influenza virus inside the cell. Patent RF № 2496878;2012.
Дополнительные файлы
