Спектр и функциональные свойства мутаций гена ERG11 флуконазол-резистентных грибов Candida albicans, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов

Полный текст

Введение

Широкое применение флуконазола в профилактике и терапии кандидозной инфекции, особенно в группе иммунокомпрометированных лиц, привело к распространению устойчивости к азоловым препаратам среди грибов рода Candida [1, 2]. У грибов Candida spp. часто наблюдается повышенная экспрессия генов, кодирующих синтез мишени антимикотического лекарственного препарата. В этом немаловажную роль играет ген ERG11, определяющий структуру ланостерол-14α-деметилазы. Этот фермент обеспечивает конечный этап синтеза эргостерола — важного компонента клеточной стенки гриба и мишени препаратов азолового ряда. За счёт гиперэкспрессии гена ERG11 обеспечивается синтез большого количества эргостерола, что в итоге делает грибы рода Candida малочувствительными к терапевтическим дозам препаратов [3]. При этом флуконазол может сам стимулировать развитие данного механизма лекарственной резистентности микроба [4], которая, в свою очередь, наиболее эффективна против короткоцепочечных азолов типа флуконазола [5].

В гене ERG11 обнаружен ряд мутаций, способных в определённой степени модифицировать эффекты его гиперэкспрессии. При этом они ассоциировались как с повышением, так и со снижением резистентности к азолам [6–10]. Однако сведения, полученные в различных лабораториях и странах, весьма противоречивы.

Цель настоящего исследования — выявление спектра и анализ функциональных свойств мутаций гена ERG11 в устойчивых к флуконазолу штаммах C. albicans, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 10 штаммах грибов C. albicans, изначально устойчивых к действию флуконазола и вориконазола, из коллекции Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Штаммы C. albicans были охарактеризованы по:

• степени экспрессии и наличию мутаций в гене ERG11, кодирующем ланостерол-14α-деметилазу;
• чувствительности к ряду антимикотических препаратов, относящихся к группам триазолов, эхинокандинов, полиенов и пиримидинов.

Штаммы грибов C. albicans были выделены из ротоглотки ВИЧ-инфицированных пациентов в возрасте 20–69 лет с клиническими проявлениями орофарингеального кандидоза, находившихся на стационарном лечении в КИБ № 2 г. Москвы. ВИЧ-инфекция у всех пациентов была диагностирована на основании клинико-эпидемиологических данных и подтверждена обнаружением специфических антител/антигенов методом иммуноферментного анализа и лизатного иммуноблотинга к белкам вируса иммунодефицита человека («Profiblot 48 TECAN», «АвтоБлот 3000») в соответствии с клинической классификацией ВИЧ-инфекции¹. У всех обследованных было получено информированное согласие на использование данных лабораторных анализов в научных целях. Все исследования проведены с согласия Комитета по этике при Южноуральском государственном медицинском университете (протокол № 4 от 25.04.2014) на основании требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» 1964 г.

Видовую идентификацию грибов C. albicans производили различными методами:

1. Ориентировочная дифференцировка грибов по цвету колоний при инкубировании на специфических хромогенных средах («Oxoid», «HiMedia») при 37ºС в течение 24–48 ч, согласно инструкции производителей;
2. Определение биохимической активности при инкубировании стандартизованных суспензий клеток в лунках планшетов коммерческих биохимических тест-систем «Remel RapID YEAST PLUS» и «ErbaLachema» при 37ºС в соответствии с инструкцией производителя. Учёт результатов производился визуально или полуавтоматически в каждой лунке, интерпретация — в соответствии с инструкцией производителя либо с помощью официального программного обеспечения.
3. В мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов для одновременного выявления ДНК C. albicans, C. glabrata и C. krusei с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс C.albicans/C.glabrata/C.krusei — МУЛЬТИПРАЙМ-FL». ДНК выделяли из чистых культур Candida spp. с использованием наборов реагентов «ДНК-сорб-АМ» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Использовали амплификатор «Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System».

Исследовали чувствительность к ряду эхинокандинов (анидулафунгин, микафунгин, каспофунгин), азолов (позаконазол, вориконазол, итраконазол, флуконазол), амфотерицину В и 5-флуцитозину. Анализ проводили в соответствии с рекомендациями Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии по определению чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам, основанными на стандартах CLSI M44 и M60 для грибов и стандартах и критериях Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам для метода микроразведений и бактериальных культур².

Минимальную ингибирующую концентрацию препарата (МИК; мг/мл) определяли методом серийных микроразведений с помощью планшетов «Sensititre YeastOne10» («Trek Diagnostic System») в соответствии с инструкцией производителя. Для этого инокулят подготавливали аналогично диско-диффузионному методу, после чего вносили в модифицированную среду RPMI-1640 и распределяли по 96-луночным планшетам для серийных микроразведений с внесёнными субстанциями антимикотиков [11]. Учёт результатов производили визуально по сравнению с ростом в лунке с положительным контролем в соответствии с критериями Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам [12].

Уровни экспрессии гена ERG11 определяли с помощью количественной ПЦР и метода 2-ΔΔCt [13]. РНК выделяли из суточной чистой культуры исследуемого штамма с помощью реагента ExtractRNA («Евроген») в соответствии с инструкцией производителя. Обратная транскрипция проводилась с помощью набора «Реверта-L» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя: 30 мин при 37ºC. В работе использовали следующие праймеры:

ERG11:

• F — aactacttttgtttataatttaagatggactattga;
• R — aatgatttctgctggttcagtaggt;

PMA1:

• F — ttgaagatgaccacccaatcc;
• R — gaaacctctggaagcaaattgg;

ACT1:

• F — ttggtgatgaagcccaatcc;
• R — catatcgtcccagttggaaaca.

Амплификацию осуществляли с помощью набора реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя Sybr-Green I («Синтол») с использованием амплификатора «Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System») со следующими параметрами: 95ºC 3 мин; 40 циклов 95ºC 10 с, 55ºC 20 с.

Гены домашнего хозяйства ACT и PMA использовали в качестве контрольных генов. Базовые значения 2-ΔΔCt для гена ERG11 получены при исследовании чувствительных изолятов (n = 7). Уровень экспрессии исследуемого штамма считали достоверно повышенным в случае, если он превышал базовые средние значения для чувствительных изолятов (m) более чем на 3 стандартных отклонения (3σ).

Для секвенирования гена ERG11 по Сэнгеру [14] использовали следующие праймеры:

ERG11-1:

• F — atggctattgttgaaactgtcatt;
• R — ggatcaatatcaccacgttctc;

ERG11-2:

• F — attggagacgtgatgctgctcaa;
• R — ccaaatgatttctgctggttcagt.

Амплификацию ERG11 для секвенирования проводили с использованием набора реактивов «Qiagen PCR Master Mix, 2x» и прибора «Applied Biosystems Veriti» по программе: 95ºC 15 мин; 35 циклов 95ºC 40 с, 60ºC 40 с, 72ºC 1,5 мин; затем 72ºC 10 мин. Очистку продуктов ПЦР осуществляли с помощью набора «ExoSAP-IT» («Thermo Fisher Scientific Inc.») в соответствии с инструкцией производителя. Реакцию секвенирования проводили с помощью набора реагентов «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit» («Applied Biosystems») со следующими параметрами: 95ºC 15 мин, 35 циклов 95ºC 15 с, 55ºC 15 с, 72ºC 30 с; 72ºC 7 мин. Очистку продуктов производили с помощью набора реагентов «BigDye Xterminator Purification Kit» («Applied Biosystems»), секвенирование — на генетическом анализаторе «3500 Applied Biosystems» («Applied Biosystems»).

Для статистического анализа и визуализации данных использовали программное обеспечение «Microsoft Excel», «SciPy» [15], «Matplotlib» [16]. Значимость различий между группами оценивали по точному критерию Фишера для дискретных величин и U-критерию Манна–Уитни — для непрерывных. Критический уровень ошибки при проверке статистических гипотез принимали за общепринятую в медицине величину р < 0,05. Тесноту связей оценивали в корреляционном анализе Пирсона.

Результаты

В ходе исследования в 7 (70%) штаммах C. albicans в структуре гена ERG11 были обнаружены 5 вариантов мутаций, идентифицированных как E266D, G464S, I471L, D116E и V488I. Наиболее частой была мутация E266D, редкой — I471L (табл. 1). Общее число мутаций составило 13.

 

Таблица 1. Мутации, выявленные в гене ERG11

Table 1. Mutations identified in the ERG11 gene

Мутация | Mutation	Абс. | Abs.	%
E266D	4	40
G464S	2	20
I471L	1	10
D116E	3	30
V488I	3	30

 

Носителями сочетанных, двукомпонентных мутаций оказались 6 (92,3%) штаммов (табл. 2). Наибольшей склонностью к формированию сочетанных мутаций обладали E266D и V488I — по 3 (30%) случая. Заметного сопряжения между мутациями не наблюдалось — коэффициент корреляции не превышал 0,410.

 

Таблица 2. Ассоциации мутаций, выявленные в гене ERG11

Table 2. Associations of mutations identified in the ERG11 gene

Мутация Mutation	Абс. Abs.	%	Коэффициент ассоциации Аssociation coefficient
E266D + G464S	1	10	0,100
E266D + D116E	2	20	0,356
E266D + V488I	1	10	0,089
V488I + I471L	1	10	0,409
V488I + D116E	1	10	0,045

 

В 60% исследованных штаммов C. albicans была установлена повышенная экспрессия гена ERG11. При этом выявленные мутации гораздо чаще встречались в штаммах с гиперэкспрессией данного гена (табл. 3), чем без неё. Однако статистический анализ практически не выявил значимых ассоциаций между ними. Вместе с тем для мутации V488I была характерна сильная отрицательная связь с повышенной экспрессией гена ERG11 (r = –0,845; p < 0,05).

 

Таблица 3. Ассоциация мутаций в гене ERG11 с его гиперэкспрессией

Table 3. Association of mutations in the ERG11 gene with its hyperexpression

Мутация Mutation	Штаммы с гиперэкспрессией гена Strains with overexpression of the gene		Штаммы без гиперэкспрессии гена Strains without overexpression of the gene		Коэффициент ассоциации Аssociation coefficient
	абс. | abs.	%	абс. | abs.	%
E266D	3	75,0	1	25,0	0,251
G464S	1	50,0	1	50,0	0,457
I471L	1	100,0	0	0,0	–
D116E	2	66,7	1	33,3	0,094
V488I	1	33,3	2	66,7	–0,845
Всего | The sum	8	61,5	5	38,5	0,089
Сочетанные | Combined	4	66,7	2	33,3	0,251

 

Результаты исследования взаимосвязи мутаций с чувствительностью к антимикотическим препаратам представлены в табл. 4, из которой видно, что МИК штаммов — носителей какой-либо мутации был примерно равен или существенно ниже, чем показатель штаммов без мутаций. Наиболее заметно выделялась чувствительность к препаратам азолового ряда, МИК которых была на 2 порядка ниже у носителей мутаций (p < 0,05) по сравнению со штаммами без мутаций.

 

Таблица 4. Взаимосвязь мутаций в гене ERG11 с чувствительностью C. albicans к антимикотическим препаратам

Table 4. Relationship of mutations in the ERG11 gene with the sensitivity of C. albicans to antimycotic drugs

Мутация Mutation		n	Анидулафунгин Anidulafungin	Микафунгин Micafungin	Каспофунгин Caspofungin	Позаконазол Posaconasole	Вориконазол Voriconasole	Итраконазол Itraconazole	Флуконазол Fluconazole	Амфотерицин B Amphotericin В	5-Флуцитозин 5-Flucitosine
Все The sum	+	12	0,03 ± 0,003	0,012 ± 0,001	0,08 ± 0,009	0,043 ± 0,019	1,083 ± 0,393	0,082 ± 0,038	33,333 ± 10,130	0,708 ± 0,074	0,065 ± 0,005
	–	28	0,041 ± 0,003	0,013 ± 0,001	0,086 ± 0,006	3,471 ± 1,117	4,036 ± 1,067	6,941 ± 2,234	98,857 ± 20,285	0,768 ± 0,048	0,066 ± 0,004
E266D	+	4	0,026 ± 0,004	0,012 ± 0,002	0,075 ± 0,015	0,023 ± 0,004	1,375 ± 0,875	0,038 ± 0,008	28,00 ± 12,000	0,75 ± 0,144	0,06 ± 0,000
	–	6	0,045 ± 0,007	0,013 ± 0,001	0,09 ± 0,013	4,057 ± 2,716	4,333 ± 2,635	8,113 ± 5,432	113,333 ± 48,637	0,75 ± 0,112	0,07 ± 0,010
G464S	+	2	0,045 ± 0,015	0,012 ± 0,004	0,12 ± 0,000	0,133 ± 0,118	2,25 ± 1,750	0,265 ± 0,235	96,00 ± 32,000	1,00 ± 0,000	0,06 ± 0,000
	–	8	0,036 ± 0,006	0,012 ± 0,001	0,075 ± 0,010	3,021 ± 2,100	3,375 ± 2,028	6,038 ± 4,201	75,00 ± 39,509	0,688 ± 0,091	0,068 ± 0,007
D116E	+	3	0,025 ± 0,005	0,01 ± 0,002	0,06 ± 0,000	0,03 ± 0,000	0,50 ± 0,000	0,05 ± 0,010	16,00 ± 0,000	0,667 ± 0,167	0,06 ± 0,000
	–	7	0,043 ± 0,006	0,013 ± 0,001	0,094 ± 0,012	3,477 ± 2,368	4,286 ± 2,228	6,954 ± 4,735	106,286 ± 41,705	0,786 ± 0,101	0,069 ± 0,009
V488I	+	3	0,03 ± 0,000	0,013 ± 0,002	0,08 ± 0,020	0,025 ± 0,005	0,50 ± 0,000	0,05 ± 0,010	16,00 ± 0,000	0,50 ± 0,000	0,08 ± 0,020
	–	7	0,041 ± 0,007	0,012 ± 0,001	0,086 ± 0,012	3,479 ± 2,367	4,286 ± 2,228	6,954 ± 4,735	106,286 ± 41,705	0,857 ± 0,092	0,06 ± 0,000

Примечание. «+» — мутация присутствует, «–» — мутация отсутствует.

Note. "+" — mutation is present, "–" — mutation is absent.

 

Среди триазолов заметно выделялись позаконазол и итраконазол, МИК которых у носителей мутаций был на 2 порядка ниже (p < 0,05), чем у штаммов без мутаций в гене ERG11. Кроме того, МИК этих препаратов был в среднем в 16,5 раза ниже, чем МИК вориконазола и флуконазола (p < 0,001). Из выявленных мутаций обратила на себя внимание G464S, у носителей которой МИК триазолов снижался менее выраженно, чем при других мутациях (p < 0,05). Корреляционный анализ не выявил зависимости между химической структурой и молекулярной массой триазолового препарата и наличием мутации.

Наличие мутаций в гене ERG11 практически не отражалось на уровне МИК тестированных эхинокандинов, амфотерицина B и 5-флуцитозина. Однако у носителей мутации G464S МИК анидулафунгина, каспофунгина и амфотерицина В незначительно смещалась в сторону резистентности (p > 0,05).

Обсуждение

В ходе проведённого молекулярно-генетического исследования штаммов C. albicans, изначально устойчивых к флуконазолу и вориконазолу, мы обнаружили высокую частоту повышенной экспрессии гена ERG11, а также ряд мутаций в нем: D116E, E266D, G464S, I471L и V488I. Наиболее частой в нашей выборке C. albicans оказалась мутация E266D. Данные мутации были описаны ранее, однако они не имеют повсеместного распространения [17–26]. Поскольку все штаммы были жизнеспособны, мы заключили, что локализация этих мутаций не затрагивала критических областей генома и они не являются летальными.

Теоретически гиперэкспрессия гена должна создавать благоприятные условия для мутационного или рекомбинационного процесса. Однако в соответствии с полученными нами данными мутации в гене ERG11 не связаны с его повышенной экспрессией. Более того, гиперэкспрессия гена и его мутация V488I чаще всего появлялись дискордантно. Можно предположить, что само возникновение мутации V488I блокирует возможность мультипликации гена.

Одной из особенностей обнаруженных мутаций явилось их сочетанное проявление. Данный факт в отношении мутаций E266D и G464S был ранее показан исследователями из Китая, США и ряда других стран [7, 20, 25, 27–30]. Между тем, исходя из выявленной нами низкой вероятности сцепления между отдельными мутациями, отмеченное следует рассматривать как случайное событие. Это означает, что, скорее всего, мутации не сцеплены друг с другом, т.е. они образуются независимо друг от друга, в различных участках гена, а их локализация ничем не детерминируется.

Постоянный приём азоловых препаратов в клинике ВИЧ-инфицированных пациентов с орофарингеальным кандидозом оказывает мощное давление на популяцию C. albicans — в ней накапливаются резистентные штаммы, в том числе с повышенной экспрессией гена ERG11. С функциональной точки зрения данный механизм лишь обеспечивает повышение темпа синтеза мишени азолов. В то же время несинонимичные мутации в гене ERG11 ведут к модификации молекулы-мишени и, как следствие, изменению сродства противогрибковых препаратов к ней [21]. Это в итоге нивелирует эффекты повышенной экспрессии данного гена. Такое явление было отмечено при исследовании штаммов с мутациями D116E, G464S и E266D [5–7, 9, 10, 17, 22, 24, 31–36], где была показана их ассоциация с многократным повышением МИК препаратов азолового ряда. Вместе с тем мутация V488I, а также в ряде исследований мутации E266D и D116E были нейтральными и не влияли на величину МИК [4–6, 9, 32, 37]. Считается, что в отсутствие гиперэкспрессии ERG11 данный механизм может не задействоваться [20].

В отличие от цитированных выше работ других исследователей, все обнаруженные нами виды мутаций ассоциировались с повышением чувствительности к препаратам триазолового ряда по сравнению со штаммами без мутаций, хотя сами тестированные штаммы C. albicans были резистентными. Лишь мутация G464S немного отставала в проявлении таких свойств. Можно предположить, что выявленные мутации в значительной степени затрагивали структуру сайта взаимодействия молекулы мишени с триазолами, что снижало их сродство. При этом нам не удалось обнаружить ассоциации МИК мутантных штаммов с особенностями химической структуры лекарственного препарата, хотя повышенная экспрессия гена ERG11 более эффективна против короткоцепочечных азолов [3]. Выявленные нами мутации не влияли на чувствительность тестированных штаммов к эхинокандинам, амфотерицину B и 5-флуцитозину.

В нашем исследовании отмечена более высокая чувствительность мутантных штаммов C. albicans на воздействие итраконазола и позаконазола по сравнению с эффектами вориконазола и флуконазола. Вероятно, отмеченное может быть связано с редким применением первых двух препаратов в клинике ВИЧ-инфицированных пациентов и направленным отбором штаммов по устойчивости к последним.

Таким образом, у большинства исследованных штаммов C. albicans, устойчивых к флуканазолу и вориконазолу, выявлен ряд мутаций в гене ERG11: D116E, E266D, G464S, I471L и V488I, которые, за исключением мутации V488I, не имеют сопряжения с повышенной экспрессией данного гена. Обнаруженные мутации снижали эффекты гиперэкспрессии гена ERG11 до 100 раз, хотя полностью не отменяли исходной резистентности к триазоловым препаратам и не влияли на чувствительность к эхинокандинам, амфотерицину B и 5-флуцитозину.

Следует принять во внимание, что исследованные штаммы были выделены от ВИЧ-инфицированных пациентов, постоянно проживающих в Москве. Поэтому полученные в работе результаты следует расценивать как особенность Московского региона. Вместе с тем отсутствие однозначного суждения об эффектах мутаций гена ERG11 требует дальнейших исследований, в том числе клинических.

Выводы

1. В структуре гена ERG11 штаммов C. albicans, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов, жителей Москвы, выявлены мутации D116E, E266D, G464S, I471L и V488I.
2. За исключением V488I обнаруженные мутации не имеют сопряжения с повышенной экспрессией гена ERG11.
3. Штаммы C. albicans — носители мутаций — были до 100 раз более чувствительны к триазоловым препаратам. Наличие мутаций не влияло на чувствительность к эхинокандинам, полиену и пиримидину.

 

Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Комитетом по этике Южноуральского государственного медицинского университета (протокол № 4 от 25.04.2014).

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The research protocol was approved by the Ethics Committee of the South Ural State Medical University (protocol No. 4, April 25, 2014).

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution. Аll authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.

¹ Российская клиническая классификация ВИЧ-инфекции. URL: https://base.garant.ru/12145892/

² Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам: рекомендации. 2021. URL: https://www.antibiotic.ru/minzdrav/category/clinical-recommendations

Об авторах

Юрий Владимирович Несвижский

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Автор, ответственный за переписку.
Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0386-3883

д.м.н., профессор, профессор каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии ПМГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); г.н.с. МНИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского

Россия, Москва; Москва

Станислав Степанович Афанасьев

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6497-1795

д.м.н., профессор, г.н.с.

Россия, Москва

Александр Дмитриевич Воропаев

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6431-811X

аспирант кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Москва

Юлия Николаевна Урбан

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0189-3608

к.б.н., с.н.с. лаб. клинической микробиологии и биотехнологии

Россия, Москва

Марьям Эмильевна Сулейманова

Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9255-6481

ординатор

Россия, Москва

Максим Станиславович Афанасьев

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5860-4152

д.м.н., проф. каф. клинической аллергологии и иммунологии

Россия, Москва

Елена Вячеславовна Буданова

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1864-5635

к.м.н., доцент, доцент каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Москва

Елена Александровна Воропаева

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0463-0136

д.м.н., г.н.c.

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы