Production of Bst polymerase for diagnosis of different infections using loop-mediated isothermal amplification

Maria I. Pika; Пика Мария Игоревна; Olga O. Mikheeva; Михеева Ольга Олеговна; Elena D. Solovyova; Соловьева Елена Дмитриевна; Anna V. Valdokhina; Валдохина Анна Владимировна; Victoria P. Bulanenko; Буланенко Виктория Петровна; Evgeny A. Cherkashin; Черкашин Евгений Александрович; Vadim V. Petrov; Петров Вадим Викторович; Kirill V. Krasovitov; Красовитов Кирилл Владимирович; Anna S. Cherkashina; Черкашина Анна Сергеевна; Vasily G. Akimkin; Акимкин Василий Геннадиевич

doi:10.36233/0372-9311-364

Получение Bst-полимеразы для диагностики различных инфекций методом петлевой изотермической амплификации

Авторы: Пика М.И.¹, Михеева О.О.¹, Соловьева Е.Д.¹, Валдохина А.В.¹, Буланенко В.П.¹, Черкашин Е.А.¹, Петров В.В.¹, Красовитов К.В.¹, Черкашина А.С.¹, Акимкин В.Г.¹
Учреждения:
1. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Выпуск: Том 100, № 3 (2023)
Страницы: 210-218
Раздел: НАУКА И ПРАКТИКА
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/15837
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-364
EDN: https://elibrary.ru/phcmoq
ID: 15837

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Большой фрагмент ДНК-полимеразы I из Geobacillus stearothermophilus GIM1.543 (ДНК-полимераза Bst) обладает 5'-3'-ДНК-полимеразной активностью, 5'-3'-вытесняющей активностью и высокой процессивностью. Благодаря этим свойствам ДНК-полимераза Bst используется в петлевой изотермической амплификации (LAMP), которая обеспечивает амплификацию целевой последовательности с высокой специфичностью и применяется для быстрого обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний человека.

Цель работы — получение рекомбинантного фермента Bst-полимеразы в бактериальной системе экспрессии и оценка его свойств в условиях LAMP для диагностики инфекционных заболеваний.

Материалы и методы. Методами генетической инженерии получали экспрессионные конструкции, несущие ген Bst-полимеразы. Экспрессию белка проводили в различных штаммах клеток Escherichia coli. Для получения очищенных препаратов белка использовали методы металл-хелатной и гель-фильтрационной хроматографии. Оценку каталитических свойств фермента проводили в реакциях петлевой изотермической амплификации в диагностических системах «АмплиСенс^® SARS-CoV-2-IT», «АмплиСенс^® IAV-IT» и «АмплиСенс^® IBV-IT», предназначенных для качественного определения РНК SARS-CoV-2, вируса гриппа А (IAV) и вируса гриппа B (IBV) соответственно.

Результаты. Разработанный протокол наработки, выделения и очистки рекомбинантной Bst-полимеразы позволяет получать фермент в бактериальной системе экспрессии на основе клеток E. coli в растворимой форме с выходом до 20% от собранной клеточной массы. В реакциях LAMР полученный фермент демонстрирует активность, сопоставимую с коммерческим ферментом Bst 2.0 («NEB»).

Заключение. Полученная рекомбинантная Bst-полимераза, учитывая быстрый способ очистки и получения фермента, пригодна для применения в диагностических наборах на основе LAMP.

Ключевые слова

полимераза, изотермическая амплификация, рекомбинантный фермент

Полный текст

Введение

Методы амплификации нуклеиновых кислот широко используются в диагностике инфекционных заболеваний, определении однонуклеотидных замен в генотипировании и других клинических применениях. Однако традиционная процедура полимеразной цепной реакции (ПЦР) занимает много времени и требует дорогостоящего специального оборудования. Сравнительно недавно T. Notomi и соавт. разработали метод быстрого обнаружения оснований нуклеиновых кислот — петлевую изотермическую амплификацию (LAMP), с помощью которой с высокой чувствительностью и специфичностью проводится амплификация целевой последовательности ДНК при постоянной температуре в любом термостатирующем устройстве, пренебрегая обычными температурными циклами, что позволяет ускорить процесс [1–4]. Метод LAMP широко используется для выявления возбудителей инфекционных заболеваний вирусной природы, таких как коронавирус SARS-CoV-2 [5, 6], вирусы гриппа и респираторно-синцитиальный вирус [7], вирус гепатита С [8], вирус денге (DENV) [9], вирус иммунодефицита человека (HIV) [10] и вирус Эбола (EVD) [11].

Bst-полимераза нашла широкое применение в изотермической амплификации и сыграла ключевую роль в развитии клинической экспресс-диагностики вирусных инфекций. ДНК-полимераза I из Geobacillus stearothermophilus [12] была впервые выделена в 1972 г. [13], а очищена в 1982 г. [14]. После получения трехмерной структуры фермента был сделан вывод о том, что ДНК-полимераза I состоит из 3 независимых доменов [15]. Домен I отвечает за 5'-3'-экзонуклеазную активность, домен II — за 5'-3'-ДНК-полимеразную активность, домен III подобен доменам, отвечающим за 3'-5'-экзонуклеазную активность у других полимераз [15]. Домены II и III расположены на С-конце ДНК-полимеразы I и обозначаются как большой фрагмент (БФ) [16]. Полноразмерный ген ДНК-полимеразы I из G. stearothermophilus состоит из 2628 пар оснований и кодирует белок, состоящий из 876 а.к. массой 98 кДа. Укороченный ген БФ Bst-полимеразы, лишённый 5'-конца из 930 пар оснований, кодирует белок из 587 а.к. массой 64 кДа и может быть клонирован с C-концевым полигистидиновым тэгом с расчётной массой 65 кДа. В данном случае из-за наличия метки из 6 гистидинов на C-конце гена Bst-полимераза лишена 5'-3'-экзонуклеазной активности и оказалась эффективна в полимеризации dNTP в ПЦР [17, 18]. Существуют, однако, данные, в которых говорится о клонировании гена БФ Bst-полимеразы без фьюжн-метки во избежание неправильного фолдинга рекомбинантного белка [19].

Поскольку ДНК-полимераза Bst характеризуется высокой процессивностью, обладает высокой полимеразной активностью и вытесняющей активностью, способна сохранять активность при температуре 65ºС [18] в течение длительного времени и широко применяется в методике изотермической амплификации для экспресс-детекции инфекционных заболеваний, цель данного исследования — предложить быстрый способ получения и очистки Bst-полимеразы, пригодной для применения в диагностических целях в методе LAMP.

Материалы и методы

В работе использовали эндонуклеазы рестрикции NdeI и XhoI («Thermo Scientific»), pET16b+ («Merck Millipore»), бактериальные штаммы Escherichia coli XL2, ER2566, BL21 (DE3) pLys, Rosetta (DE3) («Merck Millipore»); при культивировании — бакто-триптон, бакто-агар и дрожжевой экстракт («Хеликон»), при выделении белка — Трис(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид (Трис-HCl), NaCl, имидазол, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), глицерин («Panreac»); PageRuler Prestained Protein Ladder, 10–250 кДa («Thermo Scientific»).

Получение экспрессионного плазмидного вектора, содержащего ген Bst-полимеразы

Для амплификации гена, кодирующего Bst-полимеразу, были использованы олигонуклеотидные праймеры:

Bst-for 5’-GGTGGTCATATGCCGTCTTCTGAGGAAGAAAAGCCGCTG-3`;

Bst-rev 5’-GGTGGTTAACTCGAGTTTCGCTCATACCAAGTAGAACCGTAGT-3’,

содержащие сайты узнавания рестриктаз NdeI и XhoI соответственно (подчёркнуты).

Полученные ампликоны были обработаны эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI и клонированы в плазмидный вектор pET16b+, предварительно обработанный теми же эндонуклеазами рестрикции. В результате был получен экспрессионный вектор pET16-Bst-NHm4. Правильность нуклеотидной последовательности клонированного гена была подтверждена секвенированием.

Подбор штаммов E. coli для экспрессии гена Bst-NHm4

В качестве штаммов-носителей для созданного вектора pET16-Bst-NHm4 использовали штаммы E. coli ER2566, BL21 (De3) pLys, Rosetta (De3). Трансформированные клетки высевали на среду LB (1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) с агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина для клеток ER2566 и 20 мкг/мл хлорамфеникола для клеток BL21 (DE3) pLys и Rosetta (DE3), и выращивали в течение 14 ч при 37ºС для получения отдельных колоний. Затем несколько колоний переносили в 100 мл среды LB с 100 мкг/мл ампициллина и выращивали 16 ч при 37ºС на шейкере при перемешивании со скоростью 180 об/мин для получения ночной культуры. Полученной ночной культурой штаммов-продуцентов E. coli BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst-NHm4, ER2566/pET16-Bst-NHm4 и Rosetta (DE3)/pET16-Bst-NHm4 засевали среду LB с 100 мкг/мл ампициллина в культуральных колбах Эрленмейера (процент засева составлял 2%) и выращивали при 37ºC при перемешивании со скоростью 160 об/мин. При достижении оптической плотности культуры бактерий 0,8 о.е. вносили изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид до концентрации 0,4 мМ и выращивали при 23ºC и 37ºC в течение 4 и 24 ч. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 595 нм. Клеточную биомассу получали центрифугированием в течение 20 мин при 4ºC и 4000 об/мин на центрифуге «Avanti JXN-30» («Beckman Coulter»).

Выделение Bst-NHm4

Клеточную биомассу (2 г) штамма-продуцента E. coli BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst-NHm4 ресуспендировали в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5 с 1 мМ PMSF в соотношении 1 : 10 (w/v) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора «Branson sonifier 250» («Branson Ultrasonics») в течение 20 мин при 4ºC (цикл — 0,5 с, амплитуда — 50%). Затем центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге «Allegra X-30R» («Beckman Coulter»). После центрифугирования супернатант разбавляли в 2 раза буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5 (буферный раствор А) и наносили на хроматографический сорбент IMAC FF, предварительно уравновешенный тем же буферным раствором. Очистку от балластных белков проводили буферным раствором А. Целевой белок элюировали линейным градиентом буферного раствора А с 500 мМ имидазолом.

После металл-хелатной хроматографии элюат наносили на колонку HiTrap, содержащую 5 мл сорбента G-25 в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 20% глицерин, pH 8,5.

Определение активности Bst-NHm4

Для проверки активности полученной Bst-полимеразы в LAMP использовали реагенты набора «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» (РУ № РЗН 2021/14599), а в качестве образцов — плазмидную ДНК, содержащую целевой фрагмент генома коронавируса SARS-CoV-2. Реакционная смесь объёмом 10 мкл содержала 5 мкл IT-mix SARS-CoV-2, 4,2 мкл смеси глицерина, тиоглицерина и флуоресцентного интеркалирующего красителя и 0,8 мкл тестируемой Bst-полимеразы. В качестве фермента сравнения использовали фермент Bst 2.0 DNA Polymerase («NEB»; далее Bst 2.0), реакционная смесь содержала 5 мкл IT-mix SARS-CoV-2, 4 мкл смеси глицерина, тиоглицерина и флуоресцентного интеркалирующего красителя и 1 мкл полимеразы Bst 2.0. К полученным реакционным смесям добавляли по 10 мкл плазмидной ДНК (в концентрации 10⁴ и 10⁶ копий/мл). Каждый образец был поставлен в 2 повторениях. Реакцию проводили в амплификаторе «CFX 96» («Bio-Rad Laboratories»). Программа амплификации состояла из 50 циклов по 30 с при 65ºС в течение 25 мин с детекцией сигнала на канале FAM.

Аналитические методы

Концентрацию белка определяли с помощью «Qubit» («Thermo Scientific»), чистоту белка — с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях [20].

Петлевая изотермическая амплификация, совмещённая с обратной транскрипцией

Для оценки возможности использования полученной Bst-полимеразы в составе диагностических тест-систем проводили LAMP в реальном времени, совмещённую с обратной транскрипцией, на реагентах из наборов «АмплиСенс^® SARS-CoV-2-IT», «АмплиСенс^® IAV-IT» и «АмплиСенс^® IBV-IT», предназначенных для качественного определения РНК SARS-CoV-2, вирусов гриппа А (IAV) и В (IBV) соответственно. В качестве образцов использовали разведения препаратов выделенной РНК вирусов из образцов биологического материала (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки) с концентрацией 10⁴–10⁷ копий/мл.

Реакционная смесь объёмом 10 мкл содержала 5 мкл соответствующего определяемому возбудителю реагента IT-mix, 4,2 мкл смеси глицерина, тиоглицерина и флуоресцентного интеркалирующего красителя и 0,8 мкл Bst-полимеразы. В качестве фермента сравнения использовали полимеразу Bst 2.0, разведённую до той же рабочей концентрации, что и тестируемый фермент, — 320 ЕД/мл (1 ед. фермента катализирует включение 25 нмоль дНТФ в состав продукта за 30 мин реакции при 65ºC). К полученным реакционным смесям добавляли по 10 мкл препарата РНК. Реакцию проводили в амплификаторе «ДТпрайм» («ДНК-Технология»). Программа амплификации включала предварительную инкубацию в течение 5 мин при 37ºС и изотермическую амплификацию в течение 25 мин (50 циклов) при 65ºС с детекцией флуоресцентного сигнала каждые 30 с на канале FAM.

В качестве референтного метода анализа образцов РНК использовали зарегистрированные наборы реагентов, основанные на ПЦР, — «АмплиСенс^® COVID-19-FL» (РУ № РЗН 2021/14599) и «АмплиСенс^® Influenza virus A/B-FL» (РУ № ФСР 2009/05010) производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Результаты

Для получения рекомбинантной полимеразы Bst была разработана уникальная синтетическая последовательность гена Bst-pol. Для этого на первом этапе была проведена обратная трансляция фрагмента аминокислотной последовательности ДНК-полимеразы I из G. stearothermophilus (AAB52611) с 290 по 876 а.к. Затем был оптимизирован нуклеотидный состав последовательности с учётом частоты встречаемости кодонов для бактериальной системы экспрессии на основе клеток E. coli. Итоговая последовательность гена была получена методом сборки из длинных перекрывающихся праймеров [21]. Ген, кодирующий Bst-pol, был клонирован в плазмидный вектор pET16b+ для прокариотической экспрессии в E. coli. В ходе подбора штаммов-носителей для экспрессии гена Bst-NHm4 была исследована динамика накопления фермента Bst-NHm4 при разных температурах (23ºС и 37ºС) и времени индукции белкового биосинтеза (4 и 24 ч). В целом белок эффективно нарабатывался в штаммах-носителях E. coli BL21 (De3) pLys и Rosetta (De3) в растворимой форме, но не нарабатывался в штамме-носителе ER2566. Несколько большее содержание и съём биомассы достигались при культивировании штамма-продуцента BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst-NHm4 при 23ºC в течение 4 ч (табл. 1).

Таблица 1. Содержание фермента Bst-NHm4 в штаммах-продуцентах относительно общего белка клетки / Table 1. Content of the Bst-NHm4 enzyme in producer strains compared to total cell protein

Штамм-носитель E. coli E. coli carrier strain	Условия культивирования Culture conditions	Содержание белка, % Protein content, %	Съём клеточной биомассы, г/л Cell biomass yield, g/L
ER2566	23ºC, 4 ч \| h	Фермент Bst-NHm4 не нарабатывается Bst-NHm4 enzyme is not accumulated
	23ºC, 24 ч \| h
	37ºC, 4 ч \| h
	37ºC, 24 ч \| h
BL21 (De3) pLys	23ºC, 4 ч \| h	20,2	4,8
	23ºC, 24 ч \| h	19,8	4,5
	37ºC, 4 ч \| h	19,7	4,2
	37ºC, 24 ч \| h	18,9	4,9
Rosetta (De3)	23ºC, 4 ч \| h	19,5	5,1
	23ºC, 24 ч \| h	19,3	4,9
	37ºC, 4 ч \| h	18,8	4,5
	37ºC, 24 ч \| h	18,7	4,7

Примечание. Данные получены при использовании программы «Image Lab v. 5.2.1» («Bio-Rad»).

Note. The data were obtained using the Image Lab v. 5.2.1 software (Bio-Rad).

Для очистки фермента от клеточных белков на первом этапе использовали металл-хелатную аффинную хроматографию в градиенте имидазола (рис. 1). Фракции с чистотой более 90% (рис. 2) объединяли и проводили гель-фильтрационную хроматографию. Полученный фермент Bst-NHm4 охарактеризован с использованием электрофореза ДСН-ПААГ. По данным электрофоретического анализа чистота фермента составила не менее 95% (рис. 3) с концентрацией 0,85 мг/мл.

Рис. 1. Хроматографический профиль очистки рекомбинантного фермента Bst-NHm4 на сорбенте IMAC FF. / Fig. 1. Chromatographic profile of purification of the recombinant Bst-NHm4 enzyme using IMAC FF sorbent.

Рис. 2. Хроматографическая очистка Bst-pol на сорбенте IMAC FF. М — маркер молекулярных масс; 1 — осветлённый клеточный лизат штамма-продуцента BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst-NHm4; 2 — балластные белки; 3–14 — фракции Bst-NHm4. / Fig. 2. Chromatographic purification of Bst-pol using IMAC FF sorbent. M — molecular weight marker; 1 — clarified cell lysate of the producer strain BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst-NHm4; 2 — ballast proteins; 3–14 — Bst-NHm4 fractions.

Рис. 3. Получение и очистка Bst-NHm4. М — маркер молекулярных масс; 1 — тотальный клеточный лизат; 2 — осветлённый клеточный лизат; 3 — клеточный осадок; 4 — тотальная фракция Bst-NHm4 после металл-хелатной аффинной хроматографии; 5 — тотальная фракция Bst-NHm4 после гель-фильтрационной хроматографии. / Fig. 3. Production and purification of Bst-NHm4. M — molecular weight marker; 1 — total cell lysate; 2 — clarified cell lysate; 3 — cell sediment; 4 — total fraction of Bst-NHm4 after metal-chelate affinity chromatography; 5 — total fraction of Bst-NHm4 after gel-filtration chromatography.

Для подтверждения активности выделенного фермента Bst-NHm4 проводили LAMP в реальном времени на образцах плазмидной ДНК, содержащей фрагмент генома SARS-CoV-2.

В реакции использовали ферменты с концентрацией 320 ЕД/мл. В эксперименте также использовались две концентрации ДНК-матрицы: 10² и 10⁴ копий в реакции (табл. 2). На рис. 4 хорошо видно, что полученная полимераза Bst-NHm4 показывает более высокую активность (меньшие значения пороговых циклов Ct) в реакции LAMP на образцах ДНК, чем фермент сравнения Bst 2.0.

Таблица 2. Значения пороговых циклов при использовании Bst-NHm4 в реакции LAMP / Table 2. Cycle threshold values using Bst-NHm4 in the LAMP reaction

№ пробы \| Sample No.	Тип пробы \| Sample type	Bst-полимераза \| Bst polymerase	Значения Ct (FAM) \| Ct values (FAM)
1	Контроль \| Control	Bst 2.0	–
2	Контроль \| Control	Bst-NHm4	–
	Число копий \| Number of copies
3	10²	Bst 2.0	30,1
4	10²	Bst 2.0	32,3
5	10²	Bst 2.0	31,0
6	10²	Bst 2.0	33,4
7	10²	Bst-NHm4	22,0
8	10²	Bst-NHm4	22,4
9	10²	Bst-NHm4	24,1
10	10²	Bst-NHm4	24,9
11	10⁴	Bst 2.0	22,2
12	10⁴	Bst 2.0	22,8
13	10⁴	Bst 2.0	24,0
14	10⁴	Bst 2.0	24,3
15	10⁴	Bst-NHm4	20,2
16	10⁴	Bst-NHm4	19,8
17	10⁴	Bst-NHm4	20,9
18	10⁴	Bst-NHm4	22,1

Рис. 4. Оценка активности полимеразы Bst-NHm4 в модельной системе. а — кривые накопления продукта реакции; б — среднее значение порогового цикла. / Fig. 4. Assessment of Bst-NHm4 polymerase activity in the model system. a — product accumulation curves; b — mean cycle threshold value.

Для подтверждения активности фермента Bst-NHm4 был проведён анализ проб РНК вирусов SARS-CoV-2, IAV и IBV, выделенных из образцов биологического материала (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки), методом LAMP с обратной транскрипцией с использованием реагентов, входящих в состав наборов «АмплиСенс^® SARS-CoV-2-IT», «АмплиСенс^® IAV-IT» и «АмплиСенс^® IBV-IT» в сравнении с ферментом Bst 2.0. В качестве контроля образцы РНК анализировали методом ПЦР с обратной транскрипцией с помощью набора реагентов «АмплиСенс^® COVID-19-FL» или методом ПЦР с использованием набора реагентов «АмплиСенс^® Influenza virus A/B-FL», предварительно получив кДНК с помощью набора реагентов «РЕВЕРТА-L».

Полимераза Bst-NHm4 демонстрирует сопоставимую активность с полимеразой Bst 2.0 в реакции LAMP на образцах РНК SARS-CoV-2, но меньшую активность (бóльшие значения порогового цикла Ct) на образцах РНК IAV и IBV с использованием соответствующих наборов реагентов (рис. 5). Несмотря на более позднее прохождение образцов РНК IBV в реакции с полимеразой Bst-NHm4 в сравнении с Bst 2.0, исследованные образцы РНК были определены как «положительные», что является достаточным для диагностических систем с качественным определением.

Рис. 5. Анализ проб РНК вирусов SARS-CoV-2 (а), IAV (б) и IBV (в), выделенных из образцов биологического материала (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки), методом LAMP с обратной транскрипцией. / Fig. 5. Analysis of SARS-CoV-2 (a), IAV (b), and IBV (c) RNA samples isolated from biological material (nasopharyngeal and oropharyngeal swabs) using reverse transcription LAMP.

Согласно инструкциям к наборам реагентов «АмплиСенс^® SARS-CoV-2-IT», «АмплиСенс^® IAV-IT» и «АмплиСенс^® IBV-IT», они имеют предел обнаружения не более 10⁴ копий/мл при экстракции РНК из биологического материала с использованием реагентов комплекта «РИБО-преп» и высокую специфичность, обусловленную использованием 4–6 диагностических праймеров, комплементарных 6–8 участкам ДНК мишени.

Полученные нами результаты подтверждают высокую диагностическую специфичность наборов реагентов на основе LAMP (100%) в сравнении с ПЦР-тест-системами при анализе образцов РНК с концентрацией не ниже 10⁴ копий/мл. Основным преимуществом использования наборов реагентов на основе LAMP является значительное сокращение времени анализа (31 мин) по сравнению с ПЦР с наборами реагентов «АмплиСенс^® COVID-19-FL» (103 мин) «АмплиСенс^® Influenza virus A/B-FL» (150 мин) за счёт сокращения продолжительности программы амплификации.

Полученные данные показывают перспективность созданной конструкции и разработанного протокола выделения и очистки фермента Bst-полимеразы Bst-NHm4 для дальнейшего изучения и внедрения в разрабатываемые и существующие наборы реагентов для диагностики различных инфекций методом LAMP.

Заключение

Разработанный протокол выделения и очистки фермента позволяет получать рекомбинантную Bst-полимеразу в растворимой форме с выходом до 19–20% белка от всей клеточной массы. Таким образом, Bst-NHm4, учитывая быстрый и эффективный способ очистки и получения фермента, пригодна в дальнейшем для применения в диагностических целях в методе LAMP.

Источник финансирования. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета (федеральный проект «Санитарный щит страны — безопасность для здоровья (предупреждение, выявление, реагирование)»).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.