СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫМИ (ГИБРИДНЫМИ) ВАРИАНТАМИ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА БИОВАРА ЭЛЬ ТОР

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Эволюция возбудителя VII пандемии холеры за более чем 50-летний период привела к возникновению в 90-е годы прошлого столетия его генетически измененных вариантов, в геноме которых помимо генов биовара Эль Тор (ctxBEl, rstREl, rstC) содержатся гены классического биовара -профага CTXClph; - ctxBCl и rstRCl, о чем стало известно лишь в 2002 - 2007 гг. [5, 6, 8, 9, 11, 13]. К настоящему времени эти геноварианты биовара Эль Тор стали доминирующими возбудителями холеры в странах Африки и Азии [7, 10, 13, 15], а в октябре 2010 г., вследствии выноса инфекции из Азии в страны Карибского бассейна, вызвали на Гаити крупную по охвату территории и числу заболевших и умерших эпидемию холеры в мире, сравнимую с эпидемией холеры в странах Латинской Америки в 1991 г. [16]. В Российской Федерации подобная эпидемия зарегистрирована в Республике Дагестан в 1994 г., вспышка 1998 г., возбудитель которой в момент выделения был идентифицирован как V cholerae O1 biotype El Tor, Ogawa (ctx+), а в 2010 г. - как гибридный вариант биовара Эль Тор [2]. Лабораторная диагностика холеры преследует цель выделить возбудитель в чистой культуре и идентифицировать по морфологическим, биохимическим, серологическим тестам, определяющим принадлежность к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio, виду Vibrio сholerae О1 или О139 серогрупп, к классическому или Эль Тор биовару, сероварам Ogawa, Inaba, Hikoshima. Определяется антибиотикограмма и токсигенность (эпидемичность) по наличию в геноме возбудителя холеры гена ctxA, кодирующего биосинтез энтеротоксина. Однако данный алгоритм лабораторной диагностики холеры, направленный на выделение и идентификацию типичного токсигенного холерного вибриона биовара Эль Тор, обусловившего эпидемиологические осложнения по холере в шестидесятые - начале девяностых годов ХХ столетия, оказался в настоящее время несовершенным в плане дифференциации типичных токсигенных и появившихся генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, морфологические, биохимические и серологические свойства которых, определяющие семейство, род, вид, серогруппу, идентичны типичным токсигенным холерным вибрионам Эль Тор [3]. Цель работы - разработка диагностических подходов для идентификации типичных токсигенных и гибридных вариантов биовара Эль Тор, совершенствование лабораторной диагностики современной холеры. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использован 151 штамм типичных токсигенных холерных вибрионов Эль Тор, выделенных от людей в Азербайджане (1970 - 1989 гг.), Грузии (1970 г.), Дагестане (1970 - 1973 гг.), Ставропольском крае (1970 - 1990 гг.), и 102 клинических изолята генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, выделенных в Дагестане (1993, 1994, 1998 гг.) и в Ставропольском крае (1994 г.). Морфологические, биохимические, серологические свойства, гемолитическую активность, подвижность данных штаммов холерных вибрионов изучали общепринятыми методами [1]. Детекцию фрагментов ДНК генов токсигенности и генов, присущих биоварам Эль Тор или классическому, осуществляли соответственно в ПЦР тест-системе «Ген хол ctxA» (Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб») и с помощью разработанного нами набора реагентов для детекции V. cholerae O1 c определением Эль Тор или классического биовара и дифференциации на типичные токсигенные и генетически измененные Эль Тор биовары методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электорофорезным учетом результатов («Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ»). РЕЗУЛЬТАТЫ Из полученных данных следовало, что независимо от места и времени изоляции штаммы микроорганизмов, выделенные на Кавказе, являются грамотри-цательными, аспорогенными, полиморфными прямыми или слегка изогнутыми палочками, активно подвижными с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительными, ферментирующими глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющими маннозу, сахарозу, маннит, не активными в отношении лактозы, арабинозы, дульцита, инозита, декарбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающими аргининдегидролазой, агглютинирующимися холерной сывороткой О1 серогруппы и О-типовой Ogawa. И, таким образом, таксономически относятся к роду Vibrio семейства Vibrionaceae, виду Vibrio choleraе О1 серологической группы серовару Ogawа. Вместе с тем, оказалось, что, если типичные токсигенные холерные вибрионы О1 серологической группы (выделенные в 1970 - 1990 гг.) фенотипически относились к биовару Эль Тор (устойчивы к 50 ЕД полимиксина В, агглютинировали эритроциты морской свинки, образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра, лизировались диагностическим монофагом Эльтор II), то часть генетически измененных вариантов имели смешанные фенотипические свойства биовара Эль Тор и классического (табл. 1). Из данных, представленных в табл. 1, следует, что гибридные штаммы холерных вибрионов Эль Тор по фенотипическим свойствам, определяющим биовар, подразделяются на варианты с типичными фенотипическими свойствами био-вара (40 штаммов, или 41,3%) и варианты с атипичными по тому или иному фенотипическому признаку биовара (58 штаммов, или 48,7%). В настоящее время в лабораторной диагностике холеры все определеннее приобретают вес молекулярно-генетические методы исследования, в частности, ПЦР, позволяющая детектировать фрагменты ДНК ключевых генов патогенности Таблица 1. Фенотипические свойства, определяющие биовар, у токсигенных типичных и гибридных вариантов Эль Тор Год, место выделения штаммов Фенотипические тесты Биовар Эль Тор % штаммов Vibrio сholerae O1 (n) PB ЭМС VP ЭИ C 1970-1989, Азербайджан (50) R + + + - типичный 100 1970, Грузия (10) R + + + - типичный 100 1970-1973, Дагестан (35) R + + + - типичный 100 1970-1975, Ставропольский край (56) R + + + - типичный 100 1993, 1994, 1998, Дагестан из них: (98) (40) R + + + типичный 41,3 (58) RS + - + - - - смешанный 48,7 Пакистан (5) S - - - + классический 100 П ;чание. PB - полимиксин В, 50 ЕД; ЭМС - эритроциты морской свинки, 2,5%; VP- реакция Фогес-Проскауэра; Э11 - диагностический бактериофаг эльтор II в ДРТ; С - диагностический бактериофаг классический в ДРТ. Таблица 2. Результаты ПЦР-анализа при использовании набора реагентов «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» штаммов V. cholrae O1, выделенных от больных холерой на Кавказе с 1970 по 1998 гг. Реакционная смесь Результат Год, место выделения штаммов Vibrio с^Ьгае O1 (n) № 1 № 2 ctxBEl 186 п.н. rstREl 501 п.н. rstC 224 п.н. ctxBGl 186 п.н. rstRCl 501 п.н. Вариант Генотип ОК - - - - - - - - ПК +классика - - - + + БК I (ctxBCl, rstRCl) ПК +Эль Тор + + + - - БЭТ II (ctxBEl, rstREl, rstC) 1970-1989, Азербайджан (50) + + + - - »-« II (ctxBEl, rstREl, rstC) 1970, Грузия (10) + + + - - »-« II (ctxBEl, rstREl, rstC) 1970-1973, Дагестан (35) + + + - - »-« II (ctxBEl, rstREl, rstC) 1970-1990, Ставроп. край (56) + + + - - »-« II (ctxBEl, rstREl, rstC) 1993, 1994, 1998, Дагестан из них: (102) (77) + + + БЭГ III (ctxBCl, rstRCl, rstREl, rstC) (11) - - + + - »-« IV (ctxBCl, rstREl, rstC) (5) - - + + + »-« V (ctxBCl, rstRCl, rstC) (9) - - - + + »-« VI (ctxBCl, rstRCl, rstREl) П римечание. БК - биовар классический, БЭТ - биовар Эль Тор типичный, БЭГ - биовар Эль Тор гибридный. типичного или гибридного варианта холерного вибриона в биоматериале больного или в объектах окружающей среды и охарактеризовывать (идентифицировать) выделенный микроорганизм на уровне генома. Эволюционные преобразования типичного токсигенного биовара Эль Тор в гибридный вариант сопровождались изменениями структуры генов коровой области профага СТХры и профага RS1. В одном случае в геноме типичного биовара Эль Тор произошла замена гена ctxBEl на ctxBGl и появилась новая аллель гена rstR-rstRCl при сохранении генов rstREl и rstC. Так появился вариант биовара эльтор, геном которого имеет профаги СТХиры и СТХары. В другом случае в структуре СТХиры произошла замена ctxBEl на ctxBGl при сохранении генов rstREl и rstC или замена ctxBEl на ctxBCl при сохранении гена rstC, что свидетельствует об образовании варианта биовара Эль Тор с гибридным профагом СТХ^ры. Так образовались генотипы с различными комбинациями генов патогенности типичного Эль Тор и классического биоваров: rstREl, rstC, ctxBGl, rstRCl(III генотип); rstREl, rstC, ctxBGl (IV генотип); rstC, ctxBGl,rstRCl (V генотип); ctxBGl, rstRCl, rstREl (VI генотип). Следует отметить, что геномы названных вариантов биовара Эль Тор обязательно содержат ген ctxBCl, кодирующий биосинтез энтеротоксина классического типа (СТ-1), что подтверждается результатами секвенирования: нуклеотидная последовательность этого гена в положениях 115 и 203 содержит цитозин, а аминокислотная последовательность В субъединицы энтеротоксина в положениях 39 и 68 содержит, соответственно, гистидин и треонин. Учитывая вышеизложенное, мы провели ПЦР-анализ штаммов V. choKrae O1, выделенных от больных холерой на Кавказе с 1970 по 1998 гг. с использованием набора реагентов «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ», результаты которого представлены в табл. 2. Из данных табл. 2 следует, что штаммы изучаемых микроорганизмов, выделенные в 1970 - 1990 годах на Кавказе, в геноме содержат только гены ctxBEl, rstREl, rstC, то есть являются типичными токсигенными холерными вибрионами биовара Эль Тор генотип II, а выделенные в 1993,1994 и 1998 гг. в Дагестане содержат в своем геноме гены биовара Эль Тор и классического биовара, то есть являются генетически измененными (гибридными) вариантами биовара Эль Тор (генотипы III, IV, V, VI). ОБСУЖДЕНИЕ Анализ фенотипических свойств генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, выделенных на Кавказе, показал, что гибридные варианты биовара Эль Тор по своим морфологическим, биохимическим, серологическим и гемолитическим свойствам не отличимы от таковых у типичных холерных вибрионов биовара Эль Тор, обусловивших эпидемиологические осложнения по холере в шестидесятые - начале девяностых годов ХХ столетия. Вместе с тем, у части гибридных штаммов фенотипические свойства, определяющие биовар, являются смешанными, т.е. характерными для биовара Эль Тор и классического, что делает невозможным отнести изучаемые штаммы холерных вибрионов ни к одному из них. Подобные штаммы с неопределенным биоваром обнаруживали в Индии и Бангладеш [12], Тайланде [9]. Таким образом, фенотипические тесты, традиционно применяющиеся для дифференциации V. cholerae O1 на классический или Эль Тор биовары, не позволяют идентифицировать штаммы гибридных вариантов биовара Эль Тор. С учетом генетических особенностей и гибридных вариантов Эль Тор специалистами Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» предложен набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О1 классического и Эль Тор биоваров и дифференциации Эль Тор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофорезным учетом результатов «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ» [4]. С помощью указанного набора при идентификации выделенной культуры холерного вибриона определяется О1 серогруппа (по гену гАЪО1, 638 п.н.); биовар (классический по гену cas3, 415 п.н.; Эль Тор по гену rtxC, 265 п.н.); токсигенность (по генам rtxB0,189 п.н. или ctxBEl, 189 п.н.); типичность (типичный биовар Эль Тор - по сочетанию генов гАЪО1,638 п.н.+ rtxC, 265 п.н.+ ctxBEl, 189 п.н.); измененный биовар Эль Тор - rtxB0,189 п.н.+ гАЪО1,638 п.н.+ rtxC, 265 п.н.). Таким образом, данная мультилокусная ПЦР обеспечивает определение серогруппы и дифференциацию биовара Эль Тор на типичные токсигенные и генетически измененные (гибридные) варианты. Однако тест-система лишь констатирует факт типичности или гибридности идентифицируемого штамма холерного вибриона, но никак не определяет генотип измененного варианта биовара Эль Тор, что снижает ее диагностическую ценность при эпидемиологическом отслеживании появления новых геновариантов в период течения эпидемии [4]. Наша разработка набора реагентов для выявления типичных токсигенных и гибридных вариантов биовара ЭльТор и генотипирования Vibrio cholerae O1 в биологическом и из объектов окружающей среды материале методом полимеразной цепной реакции «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» основана на детекции фрагментов ДНК ключевых генов патогенности, специфичных для биовара Эль Тор - ctxBEl , кодирующего биосинтез СГ-2; rstREl (репрессор репликации фаговых частиц), rstC (антирепрессор rstR, генетический маркер биовара Эль Тор) и классического биовара (ctxBCl, кодирующего биосинтез СГ-1), rstRCl (репрессор репликации фаговых частиц), т.е. тех генов, которые претерпели изменения в процессе эволюционных преобразований генома типичного холерного вибриона биовара Эль Тор. С помощью этого набора впервые в России были обнаружены гибридные варианты биовара Эль Тор, явившиеся этиологическим фактором холеры Эль Тор в Дагестане в 1993, 1994, 1998 гг. [2]. Набор реагентов «Гены Vibrio choleraе вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» позволяет не только констатировать типичность или гибридность холерных вибрионов, но и определять генотип измененного варианта биовара Эль Тор, что позволяет отслеживать динамику появления новых генотипов измененных вариантов биовара Эль Тор в период течения эпидемии холеры. Проведенные исследования показали, что лабораторная диагностика холеры, обусловленной генетически измененными (гибридными) вариантами холерного вибриона биовара Эль Тор, должна основываться на комплексном исследовании материала от людей или из объектов окружающей среды бактериологическим (в соответствие с действующей инструкцией) и генетическим методом с использованием ПЦР- анализа с целью детекции в биологическом материале и пробах из объектов окружающей среды фрагментов ДНК генов, определяющих биовар (классический или Эль ^р), идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О1 с дифференциацией Эль Тор вибрионов на типичные и измененные, а также определения типа энтеротоксина, продуцируемого конкретным штаммом холерного вибриона (по наличии фрагменов ДНК генов ctxBEl или ctxBa, кодирующих, соответственно, биосинтез СТ- 2 или СТ-1).

Об авторах

И. В Савельева

Ставропольский противочумный институт

К. Х Хацуков

Ставропольский противочумный институт

Е. И Савельева

Ставропольский противочумный институт

С. И Москвитина

Ставропольский противочумный институт

Д. А Ковалев

Ставропольский противочумный институт

В. Н Савельев

Ставропольский противочумный институт

А. Н Куличенко

Ставропольский противочумный институт

А. Д Антоненко

Ставропольский противочумный институт

Б. В Бабенышев

Ставропольский противочумный институт

Список литературы

Дополнительные файлы