ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА (TLR2, HBD-2, TNF-a, TGF-P) В ПАТОГЕНЕЗЕ ПАРОДОНТИТА

Полный текст

Общемедицинская значимость воспалительных заболеваний пародонта определяется их значительной распространенностью в мире, большим процентом связанной с ними потери зубов и отрицательным влиянием пародонтальных очагов инфекции на организм в целом [1]. Хронический пародонтит представляет собой воспалительный процесс в тканях пародонта, вызываемый микроорганизмами, присутствующими в зубном налете. При хроническом генерализованном пародонтите (ХГП) у взрослых людей может иметь место прогрессирующее ухудшение состояния с неизбежной потерей зубов, несмотря на интенсивное лечение [6]. Известно, что одним из основных этиологических факторов пародонтита является инфекция. Врожденный иммунитет представляет первую линию защиты организма от патогенов [5]. Среди распознающих рецепторов врожденного иммунитета ключевая роль принадлежит Toll-подобным рецепторам (TLRs), которые распознают консервативные молекулярные структуры патогенных микроорганизмов [4]. В сформировавшемся зубодесневом кармане под действием патогенной микрофлоры происходит активация TLRs, присутствующих на различных клетках пародонта, таких как макрофаги, фибробласты, остеобласты и др. Сигналы с TLRs индуцируют выработку провоспалительных цитокинов и противомикробных пептидов (Р-дефенсинов) эпителиальными клетками пародонта. Известно, что Р-дефенсин-1 (HBD-1) вырабатывается конститутивно, выработка HBD-2, HBD-3, HBD-4 индуцируется действием микробных компонентов, цитокинов и др. факторов [15]. Сигнальная функция Toll-подобных рецепторов на участке соединения эпителия десны с зубом имеет важнейшее значение как для поддержания здорового состояния пародонта, так и для развития пародонтита. Однако в настоящее время существуют значительные пробелы в понимании механизмов, посредством которых TLRs могут участвовать в развитии патологического процесса в тканях пародонта. Цель настоящего исследования - изучение факторов врожденного иммунитета (TLR2, HBD-2 и цитокинов TNF-a, TGF-P) у больных хроническим генерализованным пародонтитом. В исследование были включены 59 пациентов в возрасте от 24 до 65 лет (31 мужчина и 28 женщин), обратившихся в ФКУ «стоматологическая поликлиника» в период 2012 - 2014 гг. Группа сравнения представлена 15 здоровыми донорами (24 - 54 лет). Постановка диагноза проводилась согласно классификации заболеваний парод онта, принятой на заседании Президиума секции пародонтологии Стоматологической ассоциации России (2001) на основе МКБ-10 (ВОЗ, 1997) и с использованием рентгенологических критериев оценки тяжести заболевания по Н.А.Рабухиной, А.П.Аржанцеву (2003). Всем включенным в исследование были определены: индекс налета (IPL, SilnessandLoe, 1964); индекс кровоточивости десневой борозды (PBI, Muhleman, 1975);пародонтальный индекс (CPITN, ВОЗ,1978) [1, 11]. Критерии включения в исследование для пациентов с ХГП: минимум 18 сохранившихся зубов; отсутствие системных заболеваний; отсутствие системной антибактериальной и противовоспалительной терапии в течение 6 месяцев перед данным исследованием. После измерения глубины пародонтальных карманов (ПК), клинической потери прикрепления, получения рентгенологических данных о деструкции альвеолярной кости (использован метод панорамной рентгенографии на ортопантомографе Othophos 3, Sirona, Germany, рентгенологическая нагрузка 0,07 мЗв) пациенты были разделены по степени тяжести на три группы: 1 - с пародонтитом тяжелой степени проявления (13 пациентов в возрасте от 34 до 57 лет с глубиной ПК 5,94±0,39 мм); 2 - с пародонтитом средней степени тяжести (23 пациента в возрасте от 30 до 49 лет с глубиной ПК 4,34±0,43 мм); 3 - с пародонтитом легкой степени тяжести (8 пациентов в возрасте от 21 до 61 года с глубиной ПК 3,3±0,23 мм). Анализ микрофлоры из пародонтального кармана определяли в лаборатории Инвитро (Москва). В посеве у всех пациентов определяли Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forythus; у 34% пациентов определены Haemophilus parainfluenzae, у 22% - Neisseria flavescens. Для получения биологического материала проводился соскоб эпителиальных клеток из пародонтального кармана у каждого пациента в группах с ХГП. Для определения уровня экспрессии генов в группе здоровых доноров забор эпителиальных клеток проводился из зубодесневой борозды во время стоматологического приема. Образцы клеток были собраны браншами (Dispodent, Франция) в 1,5 мл пробирки типа эппендорф с содержащимся в них физиологическим раствором. Образцы хранили при температуре минус 70°C. Материал эпителиальных клеток использовали для определения уровня экспрессии исследуемых показателей. Зубодесневую жидкость из пародонтального кармана использовали для определения концентрации цитокинов TNF-a и TGF-p. Выделение РНК для определения уровня экспрессии генов TLR2 и HBD-2 проводили с использованием набора RNeasyMiniKit (Quagen, Германия). Далее проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР. ОТ-реакцию проводили с компонентами из набора ОТ-1 (Синтол, РФ). Праймеры и зонды для ОТ-реакции и ПЦР были моделированы в компьютерной программе \fector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями ДНК исследуемых генов (последовательности были взяты в базе GenBank) и синтезированы на фирме Синтол (РФ). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали HotStartTaq DNA Polymerase (Синтол, РФ), а также наборы «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)» (Синтол, РФ). ПЦР-РВ проводили в амплификаторе ДТ-96 (ДНК-технология, РФ) с заданной программой: 95°C - 10 минут (95°C - 20 сек, 60°C - 40 секунд) 40 циклов. Программное обеспечение прибора ДТ-96 позволяет получить данные по пороговому циклу. Системы для определения уровня экспрессии генов TLR2 и HBD-2 были отработаны ранее [2, 13]. Определение уровня экспрессии генов проводилось относительно экспрессии гена Р -актина [13]. Данные по экспрессии исследуемых генов представлены в виде десятичного логарифма от числа копий соответствующего гена относительно 106 копий гена актина. Концентрацию цитокинов TNF-a и TGF-P в зубодесневой жидкости из пародонтального кармана определяли с помощью метода иммуноферментного анализа, применяя коммерческие тест-системы «Biosource». Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов. Полученные данные обрабатывали с помощью программ Excel и Statistica. Для оценки достоверности различий между группами применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Различие показателей считали достоверным при уровне значимости менее 0,05 [3]. На первом этапе работы проводили исследование уровня экспрессии генов TLR2 и HBD-2 в эпителиальных клетках пародонта у здоровых доноров и у пациентов с ХГП. Показано, что в клетках пародонта в норме экспрессируются гены распознающего рецептора TLR2 и Р-дефенсина 2 (HBD-2), средние показатели которых составили 585х105 и 175х105 копий мРНК относительно 1 млн копий гена актина, соответственно. В группе пациентов с ХГП показатели врожденного иммунитета менялись неоднозначно. У больных пародонтитом средней степени тяжести экспрессия гена TLR2 увеличивалась в 32,7 раза на фоне снижения экспрессии гена HBD-2 в 3,7 раза по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). Не выявлено достоверных отличий в уровне экспрессии генов TLR2 и HBD-1 у пациентов с тяжелой и легкой степенью пародонтита. Таким образом, у больных пародонтитом наблюдался дисбаланс в экспрессии рецепторов врожденного иммунитета и противомикробных пептидов. В нашем исследовании было выявлено достоверное повышение TNF-a в зубодесневой жидкости больных с пародонтитом средней степени тяжести, по сравнению с группой контроля. Концентрация TNF-a составила 17,97+1,93 пг/мл в группе с ХГП и 12,76+2,48 пг/мл - в группе сравнения. В группе с тяжелой формой пародонтита наблюдается тенденция к повышению продукции TNF-a, однако статистическая достоверность, по сравнению с группой контроля, отсутствует (p=0,21). Содержание TGF-P в зубодесневой жидкости у больных пародонтитом также существенно повышено по сравнению с группой контроля (p<0,01) (10 747+1661 пг/мл в группе с ХГП и 4550±362пг/мл - в группе сравнения). При этом достоверное повышение уровня TGF-P наблюдалось в группах со средней и тяжелой формой заболевания. В норме система Toll-подобных рецепторов обеспечивает распознавание компонентов микроорганизмов и адекватную реакцию на них преимущественно в виде продукции противомикробных пептидов и цитокинов как провоспалительных, так и противовоспалительных. Как показали наши исследования, у больных хроническим генерализованным пародонтитом развивается дисбаланс, проявляющийся в снижении экспрессии гена противомикробного пептида HBD-2 и гиперэкспрессии гена паттернраспознающего рецептора TLR2. Гиперэкспрессия TLR совместно с повышенной микробной нагрузкой приводит к увеличению продукции цитокинов и хемокинов, что обеспечивает развитие хронического воспаления и повреждение тканей пародонта [12]. Анализ цитокинов в зубодесневой жидкости у больных пародонтитом показал увеличение концентрации провоспалительного цитокина TNF-a и TGF-p. TGF-P является противовоспалительным цитокином, его действие приводит к снижению активности воспалительных факторов, разрушению соединительной ткани [7, 8]. Однако в литературе есть сведения, свидетельствующие о значимой роли TGF-P в развитии хронического воспаления. Показана его потенциальная возможность стимулировать хемотаксис нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов благодаря усилению экспрессии интегринов на их поверхности, что может приводить к хронизации воспалительных процессов [14]. Кроме того, есть сведения, что повышенная продукция TGF-P способствует разрастанию тканей десны, в том числе развитию фиброза [9], увеличивающего тяжесть течения заболевания. Известно, что повышенная продукция TNF-a, также как и других провоспалительных цитокинов, у больных пародонтитом может способствовать активации матриксных металлопротеиназ, выработке простагландинов, активации остеокластов [5]. Эти факторы вызывают усиление деструкции межклеточного матрикса, в том числе соединительной ткани, формирующей пародонт, а также резорбцию костной ткани [10]. Вместе с тем, известно, что активация TLR способна индуцировать выработку и противовоспалительных цитокинов. В частности, взаимодействие ЛПС возбудителя пародонтита P. gingivalis с TLR2 приводит к индукции синтеза противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-13, TGF-P) и хемокина ИЛ-8. Такая комбинация медиаторов, вырабатываемых при активации TLR2, вызывает развитие длительного хронического процесса в тканях пародонта с умеренным проявлением воспалительных явлений [12]. Это подтверждают результаты, полученные нами: у больных пародонтитом средней степени тяжести выявлена гиперэкспрессия гена TLR2, сочетающаяся с повышенной продукцией противовоспалительного цитокина TGF-P и сниженной экспрессией гена противомикробного пептида HBD-2. Проведенное исследование доказывает, что в патогенезе пародонтита важное место занимает нарушение механизмов системы врожденного иммунитета (дисбаланс экспрессии генов TLR2 и HBD-2, а также цитокинов TNF-a и TGF-P). Это позволяет по-новому взглянуть на подходы к лечению ХГП. Данный подход дает возможность разработать алгоритм оценки показателей врожденного иммунитета в слизистой пародонта, позволяющий выявить дефекты иммунной защиты при различных заболеваниях пародонта.

Об авторах

Л. В Ганковская

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Н. М Хелминская

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

О. А Свитич

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Е. А Молчанова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

В. В Греченко

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Е. В Соколова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

К. В Русанова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Список литературы

Дополнительные файлы