ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ НА ФАГОЦИТАРНУЮ И ЦИТОКИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ IN VITRO И В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Бактериальные экзополисахариды (ЭПС) являются объектом интенсивных исследований, так как они играют важную роль в строении и метаболизме микроорганизмов. К настоящему времени известно достаточно много микроорганизмов, обладающих способностью синтезировать полисахариды, в том числе экзополисахариды. Среди бактерий менее изученными в этом плане являются молочнокислые бактерии, выполняющие важную роль в метаболизме организма животных и человека и способные оказывать непосредственное воздействие на организм в целом [3, 4, 6]. Однако роль экзополисахаридов молочнокислых бактерий в организме животных изучена недостаточно. Имеются работы свидетельствующие о том, что ЭПС Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1, L. rhamnosus, L. kefiranofaciens и др. обладают способностью стимулировать иммунную систему путем индукции ИФН-у, ФНО-a, ИЛ-1а и других цитокинов, а также активацией макрофагов и лимфоцитов [1, 5 - 7]. Целью настоящей работы явилось изучение влияния ЭПС Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z) на фагоцитарную активность и способность альвеолярных и перитонеальных макрофагов экспериментальных животных продуцировать цитокины в процессе фагоцитоза in vitro Staphylococcus aureus 209-Р, а также на содержание цитокинов в организме животных при стафилококковой инфекции. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали ЭПС, выделенные из культуральной жидкости молочнокислых бактерий: Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (лаксаран 1596), L. delbrueckii B-1936 (лаксаран 1936) и L. delbrueckii ssp. bulgaricus (лаксаран Z). Культуры L. delbrueckii B-1596 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1936 были получены из Российской коллекции микроорганизмов (Пущино-на-Оке), L. delbrueckii ssp. bulgaricus - из Государственного унитарного предприятия производственноэкспериментального завода РАСХН (Москва). Лаксараны 1596, 1936 и Z - это экзополисахариды с молекулярными массами 1700, 220 и 140 кДа соответственно, состоящие из одной нейтральной фракции, имеющие одинаковый моносахаридный состав, состоящий из глюкозы [7]. При моделировании инфекционного процесса использовали суточную культуру S. aureus 209-P. Бактерии вводили беспородным мышам (самцы массой 18 - 22 г) по 0,2 мл внутрибрюшинно в дозе 5 млн кл./мл. ЭПС в концентрации 0,0012 г/мл вводили мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно через 1 час после заражения. Через 1 и 6 часов мышей умерщвляли транслокацией шейных позвонков, брали кровь из сердца, получали сыворотку по общепринятой методике и определяли содержание цитокинов в сыворотке. При изучении влияния лаксаранов на цитокинсинтезирующую и фагоцитарную активность ЭПС в концентрации 0,0012 г/мл вводили мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно. Через 1, 3, 5 и 7 суток после введения лаксаранов альвеолярные макрофаги (АМФ) выделяли из легких, а перитонеальные (ПМФ) - из брюшной полости мышей по общепринятым методикам. В качестве объекта фагоцитоза использовали суточную культуру бактерий S. аureus 209-P. Средой для моделирования процесса фагоцитоза являлась среда 199. Бактериальные клетки добавляли во взвесь макрофагов в соотношении 50:1 и инкубировали при 37°С. При исследовании фагоцитарной активности предметные стекла с макрофагами через 30 минут, 1 и 6 часов окрашивали по Романовского-Гимзе. Подсчитывали индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) и индекс активации киллинга (ИАК) по [2]. ИЗФ определяли по формуле: ИЗФ=(ФИ - ФИ2):ФИь где ФИ - фагоцитарный индекс, число макрофагов, захвативших бактерии, ФИ1 - число активных макрофагов через 1 час, ФИ2 - число активных макрофагов через 6 часов после инкубации. С помощью ИЗФ определяли завершенный или незавершенный фагоцитоз. Если ИЗФ>1 - фагоцитоз завершенный, если 0<ИЗФ<1 - частичное переваривание микробных клеток, если ИЗФ<0 - фагоцитарный процесс не завершен. ИАК рассчитывали по формуле: ИАК= ИЗФ(оп.) - ИЗФ(к.), где ИЗФ(оп.) - индекс завершенности фагоцитоза в опыте, ИЗФ(к.) - индекс завершенности фагоцитоза в контроле. Провоспалительные цитокины (ИЛ-1а, ФНО-а) определяли в суперантантах альвеолярных и перитонеальных макрофагов через 30 минут, 1 час и 6 часов процесса фагоцитоза in vitro S. aureus 209-P. Макрофаги выделяли на 1, 3, 5 и 7 сутки после введения мышам лаксаранов. Цитокины ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-4 определяли в сыворотке крови и супернатантах макрофагов постановкой ИФА с тест-системами на основе моноклональных антител (наборы реактивов «Цитокиновый тест», АО «Иммунодиагностика», Санкт-Петербург и тест-системы «ИФА-БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-БЕСТ», Новосибирск). Определение каждого цитокина осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя тест-систем, результаты учитывали на Multiskan Plus version 2.01. По значениям оптической плотности стандартных образцов строили калибровочные кривые и с учетом оптической плотности определяли концентрации цитокинов. Статистический анализ результатов проводили по стандартным методикам. Использовали параметрический t-критерий Стьюдента, достоверными считали различия при вероятности ошибки р<0,05. Вычисления проводили с использованием программы StatPlus 2007 Professional 4.9.4.1. РЕЗУЛ ЬТАТЫ При изучении влияния лаксаранов на процесс фагоцитоза бактерий S. aureus 209P in vitro было показано, что в контрольной группе животных (которым не вводили лаксараны) при определении числа активных АМФ максимальное увеличение наблюдали к 6 часам процесса фагоци- Таблица 1. Влияние лаксарана 1596 на завершенность тоза S. aureus 209-Р. ИЗФ был равен пРоцесса фагоцит<т S. aureus 2°9-р Срок исследования (сут) Фагоцитарный индекс (М+m), % Макрофаги с S. aureus 209-P 30 мин 1ч 6 ч Контроль (без ЭПС) АМФ ПМФ 8,00+0,15 6,00+0,18 19,00+1,22 25,13+2,00 24,13+2,13 9,51+1,00 1 АМФ ПМФ 63,11+4,25* 72,32+5,82* 43,23+4,12* 47,51+3,53 29,23+2,21 46,31+3,01* 3 АМФ ПМФ 72,31+5,14* 81,13+6,01* 13,32+1,00* 8,00+0,43* 60,24+5,02* 35,41+3,13* 5 АМФ ПМФ 43,25+4,32* 52,11+4,15* 27,60+2,21 37,32+3,41 78,13+5,22* 46,22+4,22* 7 АМФ ПМФ 46,22+4,23* 43,13+4,15* 20,11+2,21 13,23+1,23 27,41+2,31 5,31+0,53* Примечание. * Достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05. Таблица 2. Влияние лаксарана Z на завершенность процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р Срок исследования (сут) Фагоцитарный индекс, (М+m), % Макрофаги с S. aureus 209-P 30 мин 1ч 6 ч Контроль (без ЭПС) 1 АМФ ПМФ АМФ ПМФ АМФ ПМФ АМФ ПМФ АМФ ПМФ 19,00+1,22 24,13+2,13 25,13±2,00 9,51+1,00 13,15+2,36 17,23+2,34 12,41+2,00 8,00+0,15 6,00+0,18 47,12+4,42* 19,31+2,44 41,21+4,21* 15,42+1,26 41,33+4,23* 18,14+1,30 81,34+6,01* 62,41+5,01* 30,22+2,13* 80,43+6,00* 31,46+2,31 19,16+2,41 70,21+5,32* 42,31+3,00 41,32+3,42* -0,26, фагоцитарный процесс был не завершен, в то время, как наибольшая активность ПМФ у контрольной группы мышей была отмечена через 1 час фагоцитоза S. aureus 209-Р. ИЗФ был равен 0,64, что позволило говорить о частичном переваривании микробных клеток (табл. 1). 3 В группе животных, которым вводили лаксаран 1596, было обнаружено, что активность АМФ была максимальной через 1 час фагоцитоза S. aureus 209-Р на 1 и 3 сутки эксперимента и через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р на 5 и 7 сутки. На 1 и 3 сутки ИАК был равен 0,85 и 0,52 соответственно, скорость фагоцитоза АМФ была выше, чем в контроле; на 5 и 7 сутки - ниже (ИАК равен -0,11 и -0,09). Число активных ПМФ при определении фагоцитарного индекса в опытной группе животных в течение всего процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р составляло около 45%. На 3 сутки после введения лаксарана 1596 наибольшая активность ПМФ отмечена через 6 часов процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р, 22,43+2,11* 10,42+0,14 5,21+0,21* 31,47+3,25* 28,34+2,17 18,44+1,18* П римечание. * Достоверные различия по сравнению с контролем при p<0,05. ИЗФ составил 35% (табл. 1). Активность ПМФ на 5 сутки эксперимента у мышей была на всех этапах процесса фагоцитоза достоверно выше контрольных значений. При изучении активности макрофагов, выделенных из организма мышей, которым вводили лаксаран 1936, показано, что наибольшая активность АМФ, выделенных на 3, 5 и 7 сутки, наблюдалась через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р. Активность ПМФ у данной группы животных, выделенных на 1 и 3 сутки, достигла максимума через 30 минут процесса фагоцитоза S. aureus 209-Р; на 5 и 7 сутки через 1 час составляла 42 и 28%, соответственно. На 5 сутки скорость фагоцитоза была выше, чем в контроле (ИАК равен 0,21). Во все сроки исследования после введения животным лаксарана Z максимальное число активных АМФ наблюдали через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р, к 6 часам фагоцитоза S. aureus 209-Р количество активных АМФ снижалось, что говорило о частичном переваривании микробных клеток (табл. 2). Активность ПМФ у мышей этой группы была максимальной через 30 минут фагоцитоза S. aureus 209-Р во все сроки исследования. ИЗФ на 1 сутки эксперимента имел отрицательные значения, фагоцитоз был не завершен. На 3, 5 и 7 сутки наблюдали частичное переваривание микробных клеток. По оценке активации киллинга показано, что скорость фагоцитоза АМФ была выше, чем ПМФ. При изучении влияния лаксаранов на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе S. aureus 209-P in vitro было установлено, что под влиянием лаксарана 1596 синтез ИЛ-1а достоверно превышал контрольные значения через 6 часов в АМФ на 1, 3, 7 сутки после введения лаксарана 1596 и в течение всего процесса фагоцитоза - на 5 сутки. После введения мышам лаксарана 1596 синтез ИЛ-1а ПМФ во все сроки исследования и в течение всего процесса фагоцитоза S. aureus 209-P был выше контрольных значений. На 1 и 7 сутки после введения мышам лаксарана 1596 продукция ФНО-а АМФ была на уровне контрольных значений. Содержание ФНО-а ПМФ на 7 сутки после внутрибрюшинного введения лаксарана 1596 составляло 180 пг/мл, что в 1,7 раза выше контрольных значений. Такое позднее воздействие лаксарана 1596 на фагоциты можно объяснить, очевидно, тем, что именно на этом этапе биологический эффект лаксарана 1596 в отношении продукции макрофагами ФНО-а начинает проявляться. Сходную тенденцию в продукции провоспалительных цитокинов макрофагами Рис. 1. Влияние лаксаранов на содержание ИЛ-1а в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции. 1 - контроль, 2 - S. aureus 209-P, 3 - S. aureus 209-P + лаксаран Z, 4 - S. aureus 209-P + лаксаран 1936, 5 - S. aureus 209-P + лаксаран 1596. Рис. 2. Влияние лаксаранов на содержание ФНО-а в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции. 1 - контроль, 2 - S. aureus 209-P, 3 - S. aureus 209-P + лаксаран Z, 4 - S. aureus 209-P + лаксаран 1936, 5 - S. aureus 209-P + лаксаран 1596. мышей in vitro при фагоцитозе S. aureus 209-P наблюдали при изучении влияния лаксарана 1936. После введения мышам лаксарана Z содержание ИЛ-1а, продуцируемого АМФ и ПМФ, в процессе фагоцитоза S. aureus 209-P незначительно отличалось от контрольных значений. Количество ФНО-а, продуцируемого АМФ, было достоверно ниже контроля во время всего процесса фагоцитоза S. aureus 209-P. Продукция ФНО-а ПМФ, выделенными из организма животных на 3, 5 и 7 сутки процесса фагоцитоза S. aureus 209-P in vitro, была ниже контрольных значений, в отличие от 1 суток, где количество ФНО-а через 30 минут, 1 час и 6 часов было в 1,3; 1,4 и 1,4 раза соответственно выше контрольных значений. Ранее нами было показано, что лакса-раны оказывают влияние на продукцию цитокинов [1]. В настоящей работе представляло интерес посмотреть, как влияют лаксараны на цитокиновый статус мышей при моделировании стафилококковой инфекции. Было установлено, что введение лак-саранов 1936 и Z через 1 час после заражения мышей не изменяет достоверно содержание ИЛ-1а в сыворотке крови по сравнению с контролем 2 (содержанием цитокина в сыворотке крови зараженных мышей без введения им лаксаранов), а через 6 часов повышается до значений концентрации этого цитокина в сыворотке крови здоровых животных (контроль 1) (рис. 1), тогда как у зараженных мышей его содержание достоверно увеличивалось в 2,7 раза по отношению к контролю 1. Лаксаран 1596 не оказывал существенного влияния на содержание ИЛ-1а в сыворотке крови инфицированных стафилококком мышей. Рис. 3. Влияние лаксаранов на содержание ИФН-у в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции. 1 - контроль, 2 - S. aureus 209-P, 3 - S. aureus 209-P + лаксаран Z, 4 - S. aureus 209-P + лаксаран 1936, 5 - S. aureus 209-P + лаксаран 1596. На фоне действия лаксаранов 1936 и 1596 через 6 часов отмечено достоверное снижение уровня ФНО-а в сыворотке крови зараженных мышей по сравнению со значениями в контроле 2. Лаксаран Z не оказывал существенного влияния на содержание ФНО-а в сыворотке крови зараженных мышей (рис. 2). Лаксараны 1936 и Z достоверно снижали содержание ИФН-у в сыворотке крови лабораторных мышей при моделировании стафилококковой инфекции, через 6 часов концентрация данного цитокина достоверно не отличалась от контроля 2. Тогда как под влиянием лаксарана 1596 содержание ИФН-у в сыворотке крови зараженных мышей незначительно увеличивалось через 1 и 6 часов по сравнению со значениями для инфицированных животных (рис. 3). Показано, что все исследованные ЭПС лактобацилл не вызывали достоверных изменений в содержании ИЛ-4 в сыворотке крови экспериментальных животных, инфицированных стафилококком, через 1 и 6 часов по отношению к контролю 1 и контролю 2. ОБСУЖДЕНИЕ В последние годы появились работы, свидетельствующие о воздействии ЭПС бактерий на иммунную систему животных [1, 5, 8]. Полученные в данной работе результаты согласуются с исследованиями некоторых авторов, которые показывают, что ЭПС, синтезируемые молочнокислыми бактериями (B. adolescentis, L. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1, L. rhamnosus, L. kefiranofaciens) обладают иммуностимулирующим эффектом [Hosono J.L. et al., 1997], [7]. ЭПС этих бактерий способны индуцировать такие цитокины, как ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у, которые играют важную роль в активации макрофагов и лимфоцитов [8]. Однако работы по влиянию ЭПС молочнокислых бактерий при моделировании какого-либо инфекционного процесса нам не известны. Было установлено, что наибольший эффект, направленный на усиление продукции ИЛ-1, оказывали лаксараны Z и 1936 через 6 часов после заражения. Отсутствие достоверного влияния ЭПС изучаемых нами лактобацилл на продукцию ИЛ-4 в организме мышей при моделировании стафилококковой инфекции объясняется тем, что основным продуцентом ИЛ-4 являются Т-клетки, а временной отрезок в 6 часов является недостаточным, чтобы активировать Т-клеточное звено иммунитета, и синтез данного противовоспалительного цитокина Т-клетками происходит на более поздних стадиях иммунного ответа. Проведенные нами исследования показывают, что лаксараны 1596, 1936 и Z оказывают не однозначное влияние на активность процесса фагоцитоза и продукцию цитокинов in vitro. Наибольшее воздействие на макрофаги (как альвеолярные, так и перитонеальные) оказывал лаксаран Z. Он приводил к увеличению числа активных макрофагов как АМФ, так и ПМФ, способствовал увеличению переваривания микробных клеток и повышению индекса активации киллинга. Вполне возможно предположить, что лаксаран Z влияет на активность макрофагов через стимуляцию продукции цитокинов и, тем самым, приводит к увеличению поглотительной функции макрофагов, то есть лаксаран Z способен увеличивать продукцию основных провоспалительных цитокинов в процессе фагоцитоза бактериальных клеток и тем самым способствовать укреплению иммунной системы при воспалительном процессе в организме животных. Полученные результаты позволяют говорить о возможности использования ЭПС лактобацилл в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при некоторых инфекционных заболеваниях. ЛИТЕРАТУРА

Об авторах

Е. А Горельникова

Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова

Л. В Карпунина

Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова

Список литературы

Дополнительные файлы