ПЕРСПЕКТИВНАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ КОНТРОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНТЕРФЕРОНОВ ЧЕЛОВЕКА

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Препараты интерферонов получили чрезвычайно широкое применение в медицинской практике для лечения онкологических, аутоиммунных и многих других заболеваний человека. Отмечено также, что эффективность лечения зависит от активности ИФН, контроль которых затруднен из-за их видовой специфичности, а также несовершенства метода оценки качества целевого продукта. Для контроля активности ИФН человека из-за видоспецифичности, как правило, рекомендуют использовать клеточные линии человека или приматов. Вопросы видоспецифичности ИФН изучены многими исследователями [5 - 9]. Показано, что клеточная линия MDBK (почка была) оказалась наиболее чувствительной к ИФН человека и в последние годы используется для титрования коммерческих препаратов ИФН. Также было установлено, что ИФН морской свинки проявляет свою биологическую активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭМК) как на клетках человека НЕр-2, так и на клетках приматов Vero. Однако биологическая активность образца лимфобластоидного альфа ИФН человека оказалась в 15 - 30 раз выше в гомологичной культуре клеток, чем на макрофагах морской свинки. В то же время, генноинженерный альфа ИФН человека проявляет практически одинаковую антивирусную активность на клетках морской свинки, человека и обезьян в отличие от лейкоцитарного интерферона человека альфа и гамма [3]. Однако испытания активности in vivo вновь созданных интерфероновых препаратов затрудняются из-за видоспецифичности интерферонов. В последние годы в качестве биологической модели для решения медикобиологических и биотехнологических исследований рекомендуется несколько пород миниатюрных свиней. Это обусловлено как генетическим родством и чувствительностью к возбудителям вирусных и бактериальных инфекций, так и их сходством с человеком по целому набору анатомо-физиологических характеристик и биологических свойств. С учетом представленных данных представляло интерес оценить возможность и перспективность различных культуральных моделей, в том числе перевиваемых линий клеток свиного происхождения, для контроля активности лейкоцитарного альфа ИФН человека. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы перевиваемые линии клеток Vero (почка обезьяны), НЕК 293Т (почка эмбриона человека), MDBK (почка быка), СПЭВ (почка эмбрионов свиньи), ПК-15 (почка свиньи), ПТП (тестикулы свиньи), MDCK (почка собаки), RK-13 ( почка кролика), полученные из коллекции НИИВС им. И.И. Мечникова. Тест- культуры выращивали на питательной среде ДМЕМ (ПанЭко, США) с 5% эмбриональной сыворотки с добавлением 2 мМ глутамина и 40 мкг/мл гентамицина. Вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана) выращивали на монослойных культурах клеток Vero, ПТП, ПК-15 и НЕК 293Т в течение 2 - 3 суток. Множественность заражения тест-культур составляла 0,02 ТЦД 50/клетку. При поражении 70 - 80% монослоя клетки двукратно замораживали при минус 70°С и размораживали при плюс 4°С, вируссодержащую жидкость осветляли центрифугированием при 1500 об/мин и и хранили при минус 70°С. Активность вируса оценивали на клеточных культурах, выращенных на 24-луноч-ных планшетах. Готовили десятикратные разведения вируссодержащей жидкости (с 10-1 до 10-9) и по 0,5 мл вносили в лунки планшета с клеточными тест-культурами. Результаты титрования вируса учитывали на 2 - 3 сутки с момента инфицирования тест-культуры. За титр вируса принимали макимальное разведение вируса, вызывающее поражение 50% инфицированных культур. Активность вируса выражали в lg ТЦД50/0,5 мл. Использовали интерферон лейкоцитарный человеческий жидкий (интерферон альфа) фирмы Биомед им. И.И.Мечникова (1000 МЕ/мл), титрованный на клетках MDBK. Плазму крови человека получали при выделении лимфоцитов в среде для разделения лимфоцитов (ПанЭко, США). Венозную кровь с гепарином (20 ед./мл) разводили в два раза питательной средой RPMI-1640 с 2 мМ глутамина и 40 мкг/мл гентамицина. По 2 мл крови осторожно вносили в центрифужную пробирку и наслаивали на 4 мл среды для разделения лимфоцитов (раствор фиколла плотностью 1,077 г/см3). Образцы крови на фиколле центрифугировали при 1500 об/мин в течение 25 минут. Плазму из верхнего слоя пробирки осторожно собирали, не затрагивая слой из лимфоцитов. Антивирусную активность интерферона определяли на клеточных культурах, выращенных в 24-луночных культуральных планшетах (Costar, США). В качестве индикатора использовали штамм Индиана вируса везикулярного стоматита (VSV). За титр ИФН-альфа принимали максимальное разведение, ингибирующее цитопатическое действие вируса в 50% лунках с зараженными клеточными культурами. Активность чИФН-альфа выражали в единицах активности - ЕД 50/ о,5 мл. Статистическую обработку данных проводили по Стьюденту при уровне достоверности р<0,05 и с помощью компьютерной программы Microsoft Office Excel. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ VSV предварительно адаптировали к 4 линиям клеток (Vero, HEK 293T, ПТП и ПК-15) в течение 2 пассажей. Репродуктивность адаптированных вирусов оценивали на 6 клеточных линиях, из которых три (СПЭВ, ПТП и ПК-15) были свиного происхождения. Установлено (табл. 1) , что штамм Индиана VSV, адаптированный к клеткам Vero, наименее активно репродуцировался в гомологичной клеточной культуре Vero и в гетерологичной клеточной культуре MDBK. На 0,75 lg ТЦД50 более высокое накопление вируса регистрировали в клетках свиного происхождения (СПЭВ, ПТП, ПК-15). В то же время, вирус, адаптированный к клеткам свиного происхождения, накапливался на 2, 0 - 3, 0 lg выше как в гомологичной, так и в гетерологичной клеточных культурах. VSV, адаптированный к трансформированным клеткам почки человека HEK 293T, по репродуктивности занимал промежуточное положение. Антивирусную активность лейкоцитарного ИФН человека оценивали на 8 клеточных культурах различного видового происхождения. Анализ представленных в табл. 2 данных свидетельствует о том, что результаты контроля активности лейкоцитарного ИФН-альфа зависят от культуральной модели (КМ). На клетках MDCK, RK-13 и НЕК 293Т не выявлена антивирусная активность альфа ИФН человека, по-видимому, это обусловлено тем, что указанные культуральные модели не имеют рецепторов для альфа ИФН человека. Максимальная антивирусная активность лейкоцитарного интерферона выявлена на клетках MDBK, наименьшая - на клетках Vero. Промежуточные титры лейкоцитарного ИФН установлены на перевиваемых линиях клеток свиного происхождения. Необходимо также отметить, что защитный эффект ИФН в течение 5 суток (период наблюдения) сохраняется на клетках MDBK, СПЭВ, ПТП, ПК-15 и Vero, причем снижение защитного эффекта альфа ИФН человека на 5 сутки наблюдения был ниже на клетках свиного происхождения, чем на клетках MDBK. Таблица 1. Инфекционная активность вируса везикулярного стоматита, адаптированного к различным клеточным линиям Тест-культуры для титрования вируса Активность вируса в ТЦД50/0,5 VSV Vero VSV ПТП VSV HK-15 VSV HEK 293T Vero 4,75±0,25 6,75±0,25 7,50±0,32 6,75±0,32 MDBK 4,25±0,25 6,50±0,25 7,25±0,27 6,50±0,27 HEK 293T 5,0±0,32 7,25±0,32 8,0±0,43 7,0±0,43 СПЭВ 5,50±0,27 7,0±0,27 8,0±0,5 6,50±0,5 ПТП 5,50±0,32 7,50±0,32 7,75±0,32 6,75±0,32 ПК-15 5,50±0,5 7,50±0,5 7,50±0,5 7,0±0,5 Таблица 2. Антивирусная активность лейкоцитарного альфа интерферона человека на различных клеточных культурах Линии клеток для титрования вируса Антивирусная активность в ЕД 50/0,5 мл Сроки наблюдения (сутки) 2 5 Vero 1: 32 1: 16 MDBK 1: 512 1: 128 HEK293T 0 0 СПЭВ 1: 256 1: 128 ПК-15 1: 128 1: 64 ПТП 1: 128 1: 64 MDCK 0 0 RK-13 0 0 Примечание. 0 - отсутствие защиты. Известно, что в плазме человека обнаруживают так называемый сывороточный интерферон. У здорового человека содержится более низкая концентрация сывороточного альфа ИФН, в отличие от больного [1, 2, 4]. Представляло интерес оценить возможность контроля активности сывороточного ИФН на клетках свиного происхождения. Трудность оценки сывороточного ИФН в плазме связана с тем, что обнаружить минимальные дозы препарата в плазме удается только при использовании небольших доз индикаторного вируса (5 или 10). Для контроля активности сывороточного ИНФ использовали плазму 2 пациентов. Титрование чИФН альфа фирмы Биомед проводили на 5 тест-культурах с использованием двух малых доз штамма Индиана вируса везикулярного стоматита. Учет результатов проведен на 3 сутки с момента инфицирования клеточных культур. Установлено, что титр ИФН у пациента № 1 в пределах 1:4 - 1:8, что соответствует нормальным значениям показателя, а у пациента № 2 на этих же клетках выявлены более высокие титры сывороточного ИФН, что объясняется заболеванием пациента острым респираторным заболеванием за 3 - 4 дня до забора венозной крови. В то же время, не удалось определить титры сывороточных ИФН на клетках Vero и MDBK при использовании малых доз индикаторного вируса даже на 3 сутки с момента инфицирования клеточных культур. Это объясняется низкой репродуктивной активностью индикаторного вируса в этих тест-культурах. По результатам опыта видно, что при 5 дозах VSV не установлено наличие ИФН на клетках Vero и MDBK, а при использовании 10 доз вирус VSV вызвал поражение только в одной из 4 лунок с инфицированными клетками. Не представляется возможным протитровать лейкоцитарный ИФН человека фирмы «Биомед» с установленной производителем активностью равной 1000 МЕ/мл при использовании малых доз вируса на клетках Vero и MDBK. Эти клеточные культуры, как правило, используются для титрования как коммерческих препаратов ИФН, так и лабораторных. Все три типа клеточных культур свиного происхождения позволяют определить титры любых интерферонов и при использовании малых доз вирусов в связи с высокой репродуктивной активностью индикаторного вируса на этих клетках. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что перевиваемые линии клеток свиного происхождения (СПЭВ, ПТП, ПК-15) являются высоко чувствительными культуральными моделями для размножения VSV и рекомендуются для контроля активности ИФН человека. Показана также возможность выявления минимальных доз ИФН человека в плазме крови пациентов при использовании минимальных доз VSV (5 и 1), что позволяет судить об одном из важных показателей интерферонового статуса пациента и при необходимости его коррекции. В заключение необходимо отметить, что наши эксперименты по определению антивирусной активности человеческого интерферона альфа на клетках свиного происхождения позволяют не только увеличить спектр клеточных линий для титрования человеческих интерферонов, но и расширяют область использования мини-свиней как модельных объектов для оценки эффективности вновь созданных цитокиновых препаратов, включая и последние разработки, касающиеся оценки «гуманизированных» или «химерных» антител, обладающих интерфероноподобной биологической активностью.

Об авторах

Ф. Г Нагиева

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Е. П Баркова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

А. Ю Федотов

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Л. А Гайдерова

НЦ экспертизы средств медицинского применения

А. Н Лисаков

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

В. Т Ночевный

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Список литературы

Дополнительные файлы