ПЕРСПЕКТИВНАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ КОНТРОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНТЕРФЕРОНОВ ЧЕЛОВЕКА


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Изучение in vitro видовой специфичности лимфоцитарного человеческого интерферона альфа в отношении клеточных культур свиного происхождения для расширения спектра клеточных линий для титрования интерферона и контроля вновь созданных интерферонов и интерфероноподобных препаратов in vivo на модели мини-свиней. Материалы и методы. Использовали клеточные культуры различного видового происхождения: Vero (почка обезьяны), MDBK (почка быка), НЕК 293Т ( почка эмбриона человека), ПК-15 (почка свиньи), СПЭВ (почка эмбрионов свиньи), ПТП (тестикулы свиньи), MDCK ( почка собаки), RK-13 (почка кролика). Испытывали лимфоцитарный человеческий альфа интерферон (чИНФ-альфа) фирмы «Биомед» (1000 МЕ /мл), установленный на клетках MDBK. Использовали вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана). Плазму человека получали из гепаринизированной венозной крови в процессе выделения лимфоцитов периферической крови человека в среде для разделения лимфоцитов (фиколл с плотностью 1,077 г/см3). Результаты. Установлено, что вирус везикулярного стоматита, адаптированный к клеткам \fero, наименее активно репродуцируется на клетках \ёго и MDBK и на 0,25 - 0,75 lg ТЦД50 репродуцируется активнее на клетках свиного происхождения. В то же время, вирус, адаптированный к клеткам свиного происхождения, на 2 - 3 lg ТЦД50 активней репродуцируется как в клетках свиного происхождения, так на клетках Vero и MDBK. Заключение. Показана возможность титрования чИФН-альфа на клетках свиного происхождения как в отношении 100 доз индикаторного вируса, так и малых доз вируса (5 и 10) . Это позволяет определять низкие титры чИФН-альфа в плазме крови как одного из важного показателя интерферонового статуса - сывороточного чИФН-альфа.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Препараты интерферонов получили чрезвычайно широкое применение в медицинской практике для лечения онкологических, аутоиммунных и многих других заболеваний человека. Отмечено также, что эффективность лечения зависит от активности ИФН, контроль которых затруднен из-за их видовой специфичности, а также несовершенства метода оценки качества целевого продукта. Для контроля активности ИФН человека из-за видоспецифичности, как правило, рекомендуют использовать клеточные линии человека или приматов. Вопросы видоспецифичности ИФН изучены многими исследователями [5 - 9]. Показано, что клеточная линия MDBK (почка была) оказалась наиболее чувствительной к ИФН человека и в последние годы используется для титрования коммерческих препаратов ИФН. Также было установлено, что ИФН морской свинки проявляет свою биологическую активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭМК) как на клетках человека НЕр-2, так и на клетках приматов Vero. Однако биологическая активность образца лимфобластоидного альфа ИФН человека оказалась в 15 - 30 раз выше в гомологичной культуре клеток, чем на макрофагах морской свинки. В то же время, генноинженерный альфа ИФН человека проявляет практически одинаковую антивирусную активность на клетках морской свинки, человека и обезьян в отличие от лейкоцитарного интерферона человека альфа и гамма [3]. Однако испытания активности in vivo вновь созданных интерфероновых препаратов затрудняются из-за видоспецифичности интерферонов. В последние годы в качестве биологической модели для решения медикобиологических и биотехнологических исследований рекомендуется несколько пород миниатюрных свиней. Это обусловлено как генетическим родством и чувствительностью к возбудителям вирусных и бактериальных инфекций, так и их сходством с человеком по целому набору анатомо-физиологических характеристик и биологических свойств. С учетом представленных данных представляло интерес оценить возможность и перспективность различных культуральных моделей, в том числе перевиваемых линий клеток свиного происхождения, для контроля активности лейкоцитарного альфа ИФН человека. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы перевиваемые линии клеток Vero (почка обезьяны), НЕК 293Т (почка эмбриона человека), MDBK (почка быка), СПЭВ (почка эмбрионов свиньи), ПК-15 (почка свиньи), ПТП (тестикулы свиньи), MDCK (почка собаки), RK-13 ( почка кролика), полученные из коллекции НИИВС им. И.И. Мечникова. Тест- культуры выращивали на питательной среде ДМЕМ (ПанЭко, США) с 5% эмбриональной сыворотки с добавлением 2 мМ глутамина и 40 мкг/мл гентамицина. Вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана) выращивали на монослойных культурах клеток Vero, ПТП, ПК-15 и НЕК 293Т в течение 2 - 3 суток. Множественность заражения тест-культур составляла 0,02 ТЦД 50/клетку. При поражении 70 - 80% монослоя клетки двукратно замораживали при минус 70°С и размораживали при плюс 4°С, вируссодержащую жидкость осветляли центрифугированием при 1500 об/мин и и хранили при минус 70°С. Активность вируса оценивали на клеточных культурах, выращенных на 24-луноч-ных планшетах. Готовили десятикратные разведения вируссодержащей жидкости (с 10-1 до 10-9) и по 0,5 мл вносили в лунки планшета с клеточными тест-культурами. Результаты титрования вируса учитывали на 2 - 3 сутки с момента инфицирования тест-культуры. За титр вируса принимали макимальное разведение вируса, вызывающее поражение 50% инфицированных культур. Активность вируса выражали в lg ТЦД50/0,5 мл. Использовали интерферон лейкоцитарный человеческий жидкий (интерферон альфа) фирмы Биомед им. И.И.Мечникова (1000 МЕ/мл), титрованный на клетках MDBK. Плазму крови человека получали при выделении лимфоцитов в среде для разделения лимфоцитов (ПанЭко, США). Венозную кровь с гепарином (20 ед./мл) разводили в два раза питательной средой RPMI-1640 с 2 мМ глутамина и 40 мкг/мл гентамицина. По 2 мл крови осторожно вносили в центрифужную пробирку и наслаивали на 4 мл среды для разделения лимфоцитов (раствор фиколла плотностью 1,077 г/см3). Образцы крови на фиколле центрифугировали при 1500 об/мин в течение 25 минут. Плазму из верхнего слоя пробирки осторожно собирали, не затрагивая слой из лимфоцитов. Антивирусную активность интерферона определяли на клеточных культурах, выращенных в 24-луночных культуральных планшетах (Costar, США). В качестве индикатора использовали штамм Индиана вируса везикулярного стоматита (VSV). За титр ИФН-альфа принимали максимальное разведение, ингибирующее цитопатическое действие вируса в 50% лунках с зараженными клеточными культурами. Активность чИФН-альфа выражали в единицах активности - ЕД 50/ о,5 мл. Статистическую обработку данных проводили по Стьюденту при уровне достоверности р<0,05 и с помощью компьютерной программы Microsoft Office Excel. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ VSV предварительно адаптировали к 4 линиям клеток (Vero, HEK 293T, ПТП и ПК-15) в течение 2 пассажей. Репродуктивность адаптированных вирусов оценивали на 6 клеточных линиях, из которых три (СПЭВ, ПТП и ПК-15) были свиного происхождения. Установлено (табл. 1) , что штамм Индиана VSV, адаптированный к клеткам Vero, наименее активно репродуцировался в гомологичной клеточной культуре Vero и в гетерологичной клеточной культуре MDBK. На 0,75 lg ТЦД50 более высокое накопление вируса регистрировали в клетках свиного происхождения (СПЭВ, ПТП, ПК-15). В то же время, вирус, адаптированный к клеткам свиного происхождения, накапливался на 2, 0 - 3, 0 lg выше как в гомологичной, так и в гетерологичной клеточных культурах. VSV, адаптированный к трансформированным клеткам почки человека HEK 293T, по репродуктивности занимал промежуточное положение. Антивирусную активность лейкоцитарного ИФН человека оценивали на 8 клеточных культурах различного видового происхождения. Анализ представленных в табл. 2 данных свидетельствует о том, что результаты контроля активности лейкоцитарного ИФН-альфа зависят от культуральной модели (КМ). На клетках MDCK, RK-13 и НЕК 293Т не выявлена антивирусная активность альфа ИФН человека, по-видимому, это обусловлено тем, что указанные культуральные модели не имеют рецепторов для альфа ИФН человека. Максимальная антивирусная активность лейкоцитарного интерферона выявлена на клетках MDBK, наименьшая - на клетках Vero. Промежуточные титры лейкоцитарного ИФН установлены на перевиваемых линиях клеток свиного происхождения. Необходимо также отметить, что защитный эффект ИФН в течение 5 суток (период наблюдения) сохраняется на клетках MDBK, СПЭВ, ПТП, ПК-15 и Vero, причем снижение защитного эффекта альфа ИФН человека на 5 сутки наблюдения был ниже на клетках свиного происхождения, чем на клетках MDBK. Таблица 1. Инфекционная активность вируса везикулярного стоматита, адаптированного к различным клеточным линиям Тест-культуры для титрования вируса Активность вируса в ТЦД50/0,5 VSV Vero VSV ПТП VSV HK-15 VSV HEK 293T Vero 4,75±0,25 6,75±0,25 7,50±0,32 6,75±0,32 MDBK 4,25±0,25 6,50±0,25 7,25±0,27 6,50±0,27 HEK 293T 5,0±0,32 7,25±0,32 8,0±0,43 7,0±0,43 СПЭВ 5,50±0,27 7,0±0,27 8,0±0,5 6,50±0,5 ПТП 5,50±0,32 7,50±0,32 7,75±0,32 6,75±0,32 ПК-15 5,50±0,5 7,50±0,5 7,50±0,5 7,0±0,5 Таблица 2. Антивирусная активность лейкоцитарного альфа интерферона человека на различных клеточных культурах Линии клеток для титрования вируса Антивирусная активность в ЕД 50/0,5 мл Сроки наблюдения (сутки) 2 5 Vero 1: 32 1: 16 MDBK 1: 512 1: 128 HEK293T 0 0 СПЭВ 1: 256 1: 128 ПК-15 1: 128 1: 64 ПТП 1: 128 1: 64 MDCK 0 0 RK-13 0 0 Примечание. 0 - отсутствие защиты. Известно, что в плазме человека обнаруживают так называемый сывороточный интерферон. У здорового человека содержится более низкая концентрация сывороточного альфа ИФН, в отличие от больного [1, 2, 4]. Представляло интерес оценить возможность контроля активности сывороточного ИФН на клетках свиного происхождения. Трудность оценки сывороточного ИФН в плазме связана с тем, что обнаружить минимальные дозы препарата в плазме удается только при использовании небольших доз индикаторного вируса (5 или 10). Для контроля активности сывороточного ИНФ использовали плазму 2 пациентов. Титрование чИФН альфа фирмы Биомед проводили на 5 тест-культурах с использованием двух малых доз штамма Индиана вируса везикулярного стоматита. Учет результатов проведен на 3 сутки с момента инфицирования клеточных культур. Установлено, что титр ИФН у пациента № 1 в пределах 1:4 - 1:8, что соответствует нормальным значениям показателя, а у пациента № 2 на этих же клетках выявлены более высокие титры сывороточного ИФН, что объясняется заболеванием пациента острым респираторным заболеванием за 3 - 4 дня до забора венозной крови. В то же время, не удалось определить титры сывороточных ИФН на клетках Vero и MDBK при использовании малых доз индикаторного вируса даже на 3 сутки с момента инфицирования клеточных культур. Это объясняется низкой репродуктивной активностью индикаторного вируса в этих тест-культурах. По результатам опыта видно, что при 5 дозах VSV не установлено наличие ИФН на клетках Vero и MDBK, а при использовании 10 доз вирус VSV вызвал поражение только в одной из 4 лунок с инфицированными клетками. Не представляется возможным протитровать лейкоцитарный ИФН человека фирмы «Биомед» с установленной производителем активностью равной 1000 МЕ/мл при использовании малых доз вируса на клетках Vero и MDBK. Эти клеточные культуры, как правило, используются для титрования как коммерческих препаратов ИФН, так и лабораторных. Все три типа клеточных культур свиного происхождения позволяют определить титры любых интерферонов и при использовании малых доз вирусов в связи с высокой репродуктивной активностью индикаторного вируса на этих клетках. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что перевиваемые линии клеток свиного происхождения (СПЭВ, ПТП, ПК-15) являются высоко чувствительными культуральными моделями для размножения VSV и рекомендуются для контроля активности ИФН человека. Показана также возможность выявления минимальных доз ИФН человека в плазме крови пациентов при использовании минимальных доз VSV (5 и 1), что позволяет судить об одном из важных показателей интерферонового статуса пациента и при необходимости его коррекции. В заключение необходимо отметить, что наши эксперименты по определению антивирусной активности человеческого интерферона альфа на клетках свиного происхождения позволяют не только увеличить спектр клеточных линий для титрования человеческих интерферонов, но и расширяют область использования мини-свиней как модельных объектов для оценки эффективности вновь созданных цитокиновых препаратов, включая и последние разработки, касающиеся оценки «гуманизированных» или «химерных» антител, обладающих интерфероноподобной биологической активностью.
×

Об авторах

Ф. Г Нагиева

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Е. П Баркова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

А. Ю Федотов

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Л. А Гайдерова

НЦ экспертизы средств медицинского применения

А. Н Лисаков

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

В. Т Ночевный

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Список литературы

  1. Ершов Ф.И. Анализ интерферонового статуса и цитокинового профиля у больных с генитальным герпесом. Иммунология. 2002, 2: 167-174.
  2. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. М., 1966.
  3. Нагиева Ф.Г., Баркова Е.П., Никулина В.Г., Краснова Н.И., Анджапаридзе О.Г. Протективный эффект моноклональных антиидиотипических антител при экспериментальной герпетической инфекции. Вопр. вирусол. 1995, 2: 70-72.
  4. Тазулахова Э.Б., Сорокин А.М. Взаимоотношения между системами интерферона и иммунитета. В: Система интерферона в норме и при патологии. М., 1996, с. 88-98.
  5. Chany C. Membrane-bound interferon specific cell receptor system: Role in the establishment and amplification of the antiviral state. Biomedicine. 1976, 24: 148-157.
  6. Overall J.C. Jr., Tze-JouYen, Kern E.R. Activity of human recombinant and lymphoblastoid interferons in human and heterologous cell lines. J. Interferon Res. 1984, 4: 529-533.
  7. Revel M., Bash D., Ruddle F.H. Antibodies to a cell-surface component coded by human chromosome 21 inhibit action of interferon. Nature. 1976, 260: 139-141.
  8. Sakaguchi Y., Stevenson D., Gordon I. Species specificityof interferon action: a functioning homospecific nucleus is required for induction of antiviral activity in heterocaryons. Virology. 1982, 116: 441-458.
  9. Samuel C.E., Farris D.A. Mechanism of interferon action. Species specificity of interferon and of the interferon-mediated inhibitor of translationfrom mouse, monkey and human cells. Virology. 1977, 77: 556-565

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Нагиева Ф.Г., Баркова Е.П., Федотов А.Ю., Гайдерова Л.А., Лисаков А.Н., Ночевный В.Т., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах