Assessment of antibacterial activity of vinyltriphenylphosphonium hexabromoplatinate

N. M. Shlepotina; Шлепотина Н. М.; O. L. Kolesnikov; Колесников О. Л.; Yu. S. Shishkova; Шишкова Ю. С.; E. V. Kolbina; Колбина Е. В.; M. V. Peshikova; Пешикова М. В.; A. S. Kameneva; Каменева А. С.; Yu. V. Loginova; Логинова Ю. В.; A. R. Zykova; Зыкова А. Р.; O. K. Sharutina; Шарутина О. К.; V. V. Sharutin; Шарутин В. В.

doi:10.36233/0372-9311-205

Исследование антибактериального действия гексабромоплатината винилтрифенилфосфония

Авторы: Шлепотина Н.М.¹, Колесников О.Л.¹, Шишкова Ю.С.¹, Колбина Е.В.¹, Пешикова М.В.¹, Каменева А.С.¹, Логинова Ю.В.¹, Зыкова А.Р.², Шарутина О.К.², Шарутин В.В.²
Учреждения:
1. Южно-Уральский государственный медицинский университет
2. Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский университет)
Выпуск: Том 99, № 3 (2022)
Страницы: 336-342
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 31.05.2022
Дата принятия к публикации: 31.05.2022
Дата публикации: 27.07.2022
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1231
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-205
ID: 1231

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Одним из биологических эффектов комплексов платины является антибактериальное действие в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Так, известно, что некоторые соединения платины способны ингибировать синтез ДНК, РНК и белка в бактериальных клетках кишечной палочки.

Цель — изучить антибактериальное действие гексабромоплатината винилтрифенилфосфония (ГВ) в отношении кишечной палочки и золотистого стафилококка с установлением минимальной подавляющей концентрации.

Материалы и методы. Антибактериальный эффект ГВ был изучен путём количественного учёта выросших колоний Escherichia coli штамм ATCC 25922 и Staphylococcus aureus штамм ATCC 6538 на плотной питательной среде в опыте (взвесь микроорганизмов, раствор исследуемого вещества) и контроле (взвесь микроорганизмов). Достоверность полученных результатов была оценена с помощью двустороннего точного критерия Фишера.

Результаты. Минимальная подавляющая концентрация раствора ГВ в отношении E. coli штамм ATCC 25922 составила 14,0625 мкг/мл, в отношении S. aureus штамм ATCC 6538 — 225 мкг/мл.

Заключение. ГВ проявляет антибактериальный эффект в большей степени по отношению к E. coli, чем к S. aureus — установленная для кишечной палочки минимальная подавляющая концентрация ГВ (14,0625 мкг/мл, 11,17 мкМ) оказалась сопоставимой с эффективными концентрациями противоопухолевых препаратов платины, поэтому проведение дальнейших исследований, в том числе in vivo, с участием данной бактерии является перспективным.

Ключевые слова

гексабромоплатинат винилтрифенилфосфония, антибактериальное действие, кишечная палочка, золотистый стафилококк

Полный текст

Введение

Бактерии в процессе своего существования и взаимодействия с условиями окружающей среды смогли приобрести устойчивость к многим антибактериальным средствам. При этом наряду с устойчивостью к антибиотикам [1] описана также резистентность к дезинфектантам [2] и антисептикам [3] — даже несмотря на то, что действие дезинфектантов и антисептиков описывается как неизбирательное, зависит от структуры химического соединения и обычно имеет несколько точек приложения. К подобным механизмам можно отнести повреждение клеточной стенки и цитоплазмы прокариотической клетки; нарушение синтеза белка; взаимодействие с жизненно важными для клетки ферментами; разрушение рибосом и так далее [4]. Поскольку соединения с антибактериальными свойствами применяются в медицинской практике почти повсеместно, проблема устойчивости штаммов бактерий приобретает широкие масштабы. В частности, это касается хирургических специальностей (кардиохирургия, онкология, травматология и ортопедия, гинекология и так далее), где необходимо предотвратить развитие инфекций в области хирургического вмешательства, а также лечить уже развившийся гнойно-воспалительный процесс [5–9]. Таким образом, врачу важно знать не только анатомические особенности конкретной области, но и особенности микробиоценоза этой области, спектр чувствительности населяющих ее микроорганизмов, а также владеть необходимым арсеналом эффективных антибактериальных средств для возможности реализации комплексного подхода к терапии [10–13]. Именно для этого следует постоянно пополнять реестр уже имеющихся антибактериальных препаратов новыми, которые можно было бы применить в случае имеющейся резистентности причинной флоры.

Одними из таких перспективных соединений являются комплексы платины. Среди биологических эффектов соединений платины хорошо известно противоопухолевое действие. Тем не менее, внимание исследователей уже достаточно давно сосредоточено и на изучении антибактериальной активности комплексов платины, в частности, в отношении кишечной палочки [14][15]. Также было изучено влияние соединений платины на другие микроорганизмы. Например, в работе K. Joyce и соавт. показано, что цисплатин обладает широким спектром действия в отношении ряда грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибковой флоры [16]. Еще в исследовании B. Rosenberg и соавт. было обнаружено, что воздействие платины более эффективно подавляет процессы деления грамотрицательных палочек (Escherichia coli), чем грамположительных палочек и кокков [17]. M.Y. Vaidya и соавт. определили наличие антибактериальных свойств у ионов металлов, в том числе у платины, в отношении Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae и Acinetobacter baumannii. Антибактериальное действие платины было выявлено как в отношении планктонных бактерий, так и в отношении бактерий, формирующих биопленки [18]. В другой работе было обнаружено наличие антибактериальной активности у триазиновых комплексов платины (IV) в отношении кишечной палочки и золотистого стафилококка [19].

Стоит отметить, что большинство описанных исследований по теме изучения биологической активности комплексов платины представлены на примерах молекулярных соединений. Подобные исследования для ионных комплексов платины описаны в меньшей степени, хотя эти вещества также являются перспективными в отношении обнаружения биологической активности. Так, гексахлороплатинаты (IV) бипиридиния и бензимидазолия продемонстрировали противоопухолевое действие in vitro на двух клеточных линиях [20]. Гексабромоплатинаты являются малоизученными соединениями, и сведения об их биологической активности в литературе отсутствуют.

Таким образом, представляется актуальным изучить антибактериальное действие нового ионного соединения платины — гексабромоплатината винилтрифенилфосфония (ГВ), начав исследования на E. coli и Staphylococcus aureus.

Цель исследования: изучить антибактериальное действие ГВ в отношении кишечной палочки и золотистого стафилококка с установлением минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Материалы и методы

ГВ получили взаимодействием гексабромоплатината калия с бромидом винилтрифенилфосфония в ацетонитриле. Синтез и особенности строения представлены в работе А.Р. Зыковой и соавт. [21]. Тест-микроорганизмы E. coli штамм ATCC 25922 и S. aureus штамм ATCC 6538, используемые в данном исследовании, получили из государственной коллекции патогенных микроорганизмов Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Для определения антимикробного действия использовали взвесь суточной культуры тест-штамма E. coli в 0,9% растворе хлорида натрия с содержанием КОЕ 0,93 × 10⁵ в 1 мл. Аналогичная взвесь, приготовленная из тест-штамма S. aureus, имела такие же показатели оптической плотности при измерении на денситометре, как и взвесь из тест-штамма кишечной палочки. Также непосредственно перед исследованием приготовили раствор ГВ в 0,9% растворе NaCl в концентрации 500 мкг/мл, из которого были приготовлены последующие двукратные разведения: 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,8125 мкг/мл. Для исключения контаминации раствора изучаемого вещества провели его стерилизацию через фильтрационную насадку с диаметром пор 0,2 мкм. В опытные пробирки вносили по 0,2 мл взвеси микроорганизмов и по 1,8 мл раствора ГВ в вышеуказанных концентрациях. Таким образом, рабочая концентрация ГВ в опытных пробирках составила 450; 225; 112,5; 56,25; 28,125; 14,0625 и 7,03125 мкг/мл соответственно. В контрольные пробирки внесли по 0,2 мл взвеси бактерий и по 1,8 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Следовательно, содержание микроорганизмов (КОЕ/мл) в каждой из пробирок снизилось на два порядка, до 10³. Затем пробирки поместили в термостат (37°C). Спустя 60 мин инкубации произвели высев содержимого опытных и контрольных пробирок в объёме 0,05 мл на чашки Петри с мясо-пептонным агаром (Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, серия О1-К-194). Распределение материала по поверхности среды осуществляли с помощью шпателя Дригальского. Высевы из каждой пробирки проводили пятикратно. Через 24 ч инкубирования выполнили подсчет выросших колоний.

Для учёта результатов по каждому из штаммов бактерий сформировали по 8 групп: контрольная группа — чашки Петри с материалом из контрольной пробирки (группа 1), а также 7 опытных групп — чашки с материалом из опытных пробирок с раствором ГВ в концентрации 450 мкг/мл (группа 2), 225 мкг/мл (группа 3), 112,5 мкг/мл (группа 4), 56,25 мкг/мл (группа 5), 28,125 мкг/мл (группа 6); 14,0625 мкг/мл (группа 7) и 7,03125 мкг/мл (группа 8). По количеству колоний на чашках Петри вычислили содержание КОЕ/мл (n × 20) в контрольных и опытных пробирках для E. coli и S. aureus. Для каждой группы определили медиану (Me). Достоверность различий между группами оценили с использованием двустороннего точного критерия Фишера, который был рассчитан с помощью программы, разработанной Dr. Haseeb A. Khan¹. Также вычислили индекс бактерицидности (ИБ) по следующей формуле:

Результаты

Рост колоний эталонного штамма E. coli отсутствовал на чашках в опытных группах 2–7 и присутствовал на чашках в группе 1 с контролем роста тест-культуры и на чашках опытной группы 8 (табл. 1). В отношении бактерий E. coli значимость различий исходов оказалась статистически достоверной при использовании раствора ГВ в концентрациях 450; 225; 112,5; 56,25; 28,125; 14,0625 и 7,03125 мкг/мл (p = 0,004, вероятность безошибочного суждения 99,6%). ИБ для изучаемого вещества в этих концентрациях при времени экспозиции 60 мин варьировал в пределах 98,2–100% (табл. 1). МПК в отношении эталонного штамма E. coli составила 14,0625 мкг/мл.

Таблица 1. Влияние ГВ на рост Е. соН (КОЕ х 10³/мл в контрольной и опытных пробирках, вычисленное по количеству колоний на плотной питательной среде)

Table 1. Effect of VH on the growth of E. coli (CFU x 10³/ml in control and test tubes, calculated from the number of colonies on nutrient medium)

Высев Seeding	Группа (концентрация раствора ГВ, мкг/мл) / Group (VH concentration, μg/ml)
Высев Seeding	1 (контроль) 1 (control)	2 (450)	3 (225)	4 (112,5)	5 (56,25)	6(28,125)	7 (14,0625)	8(7,03125)
1	0,62	0	0	0	0	0	0	0,02
2	1,14	0	0	0	0	0	0	0,02
3	1,32	0	0	0	0	0	0	0,06
4	1,22	0	0	0	0	0	0	0,04
5	0,88	0	0	0	0	0	0	0,02
Me	1,14	0*	0*	0*	0*	0*	0*	0,02*
ИБ, % Bactericidal index, %	-	100	100	100	100	100	100	98,2

Примечание. *p = 0,004 по сравнению с контролем. Note. *p = 0.004 compared to control.

Рост колоний тест-штамма S. aureus отсутствовал на чашках в опытных группах 2 и 3, в остальных группах рост колоний наблюдался (табл. 2). Для эталонного штамма S. aureus статистически достоверная значимость различий результатов наблюдалась при использовании раствора изучаемого вещества в концентрациях 450; 225; 112,5; 56,25; 28,125; 14,0625 (p = 0,004, вероятность безошибочного суждения 99,6%) и 7,03125 мкг/мл (p = 0,02, вероятность безошибочного суждения 98%), где ИБ находился в диапазоне 38,5–100% (табл. 2). МПК для S. aureus штамм ATCC 6538 составила 225 мкг/мл.

Таблица 2. Влияние ГВ на рост S. aureus (КОЕ х 10³/мл в контрольной и опытных пробирках, вычисленное по количеству колоний на плотной питательной среде)

Table 2. Effect of VH on the growth of S. aureus (CFU x 10³/ml in control and test tubes, calculated from the number of colonies on nutrient medium)

Высев Seeding	Группа (концентрация раствора ГВ, мкг/мл) / Group (VH concentration, μg /ml)
Высев Seeding	1 (контроль) 1 (control)	2 (450)	3 (225)	4 (112,5)	5 (56,25)	6(28,125)	7 (14,0625)	8 (7,03125)
1	3,10	0,0	0,0	0,0	0,12	1,24	1,88	2,58
2	4,26	0,0	0,0	0,0	0,10	1,02	1,90	2,54
3	4,54	0,0	0,0	0,0	0,02	1,36	1,54	3,50
4	4,96	0,0	0,0	0,0	0,10	1,04	1,66	2,62
5	3,58	0,0	0,0	0,02	0,02	1,74	1,56	3,08
Me	4,26	0*	0*	0*	0,10*	1,24*	1,66*	2,62**
ИБ, % Bactericidal index, %	-	100	100	100	97,7	70,9	61,0	38,5

Примечание. *p = 0,004, **p = 0,02 по сравнению с контролем. Note. *p = 0.004, **p = 0.02 compared to control.

Обсуждение

Известно, что соединения платины проявляют антибактериальное действие. Ранее антибактериальная активность в отношении бактерий E. coli была выявлена у других соединений платины — гексахлороплатинатных комплексов тетраорганиламмония [22][23]. Еще H.H. Kohl и соавт. показали, что некоторые соединения платины могут подавлять процессы синтеза ДНК, РНК и белка в бактериальных клетках E. coli [24].

В настоящем исследовании антибактериальный эффект в виде отсутствия роста колоний при взаимодействии между бактериями кишечной палочки и изучаемым веществом в большинстве концентраций, который развивался в течение относительно короткого времени (60 мин), позволяет предположить, что ГВ в соответствующих концентрациях может влиять на поверхностные структуры бактериальных клеток, такие как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана. Выявленные МПК раствора ГВ в отношении E. coli штамм ATCC 25922 (14,0625 мкг/мл) и S. aureus штамм ATCC 6538 (225 мкг/мл) в целом оказались сопоставимы с эффективными концентрациями, найденными другими исследователями для подобных соединений [25]. Установление МПК для соединений платины является необходимым и целесообразным, поскольку известно, что препараты данной фармакологической группы применяются для терапии онкологических заболеваний и являются токсичными [26]. МПК раствора ГВ для E. coli — 14,0625 мкг/мл (11,17 мкМ) — близка к концентрациям, ингибирующим рост опухолевых клеток на 50% (IC₅₀) и выявленным in vitro, у известных противоопухолевых препаратов платины, таких как цисплатин (IC₅₀ = 8,74 ± 1,37 мкМ [27]; IC₅₀ = 11,0 ± 4,6 мкМ; IC₅₀ = 16,3 ± 1,5 мкМ [28]), карбоплатин (IC₅₀ = 19,95 ± 2,03 мкМ; IC₅₀ = 50,90 ± 7,15 мкМ [27]) и недаплатин (IC₅₀ = 14,91 ± 0,91 мкМ [27]). Очевидно, что антибактериальное действие ГВ в отношении S. aureus является менее выраженным, и столь высокая величина МПК в отношении этого штамма бактерий вряд ли является практически значимой для клинической медицины. Следовательно, проведение дальнейших исследований, в том числе in vivo, с участием E. coli является целесообразным и перспективным.

Заключение

ГВ проявляет антибактериальный эффект в большей степени по отношению к E. coli, чем к S. aureus, — установленная для E. coli МПК ГВ (14,0625 мкг/мл, 11,17 мкМ) оказалась сопоставимой с эффективными концентрациями противоопухолевых препаратов платины. Представляется перспективным проведение дальнейших исследований, в том числе in vivo, с участием данной бактерии. Также представляет научный интерес изучение механизма антибактериального действия ГВ.

1. Биометрика. URL: http://www.biometrica.tomsk.ru/programm_stat.htm