Роль полиморфизма гена eNOS в иммунопатогенезе первичной открытоугольной глаукомы

Полный текст

Введение

Глаз обладает системой местного иммунитета, которая обеспечивается несколькими феноменами «иммунной привилегированности»: иммунное отклонение, связанное с передней камерой (anterior chamber associated immune deviation — ACAID) или с задней камерой, феномен субретинального пространства. Наиболее изучен феномен ACAID [1].

Антигенные материалы в передней камере глаза генерируют системный иммунный ответ, который сохраняет первичные клонально расширенные цитотоксические предшественники Т-клеток и В-клетки, секретирующие большие концентрации IgG₁, который является антителом, не фиксирующим комплемент. С другой стороны, ACAID ингибирует CD4⁺ Th1и Th2-клетки и В-клетки, секретирующие антитела, фиксирующие комплемент [2].

Антигены из передней камеры глаза, попав в селезёнку, приобретают три типа антигенспецифических Treg, которые опосредуют ACAID. Одна из этих популяций состоит из CD4⁺-Т-клеток, которые известны как афферентные регуляторы. CD4⁺-Тклетки способны подавлять начальную активацию и дифференцировку наивных Т-клеток в эффекторные клетки Th1. Вторая популяция состоит из CD8⁺-Т-клеток, которые известны как эфферентные регуляторы. CD8⁺-Т-клетки снижают экспрессию Th1-иммунных реакций, при этом тормозят развитие замедленной гиперчувствительности. Третья популяция состоит из CD8⁺-Т-клеток, которые препятствуют В-клеткам переключаться на изотип IgG. Эфферентные CD8⁺-Tregs в ACAID действуют на периферии, в том числе в глазу, тогда как афферентные CD4⁺-Tregs действуют во вторичных лимфоидных органах. В ACAID антигенпрезентирующие клетки индуцируют экспансию толерогенных В-клеток, чтобы индуцировать антигенспецифичные Treg и инвариантные естественные Т-клетки-киллеры, которые дополнительно необходимы для генерации ACAID [2][3].

Появляется всё больше доказательств того, что резидентные клетки глаза, которые включают эндотелиальные клетки роговицы (CE-клетки) и клетки пигментного эпителия глаза (PE-клетки), могут способствовать развитию и поддержанию иммуносупрессивного внутриглазного микроокружения посредством генерации Treg. В дополнение к глазным PE-клеткам глаз содержит резидентные популяции миелоидных клеток, таких как макрофаги и микроглиальные клетки. Однако большинство макрофагов ограничено роговицей и увеальным трактом, где они отвечают за поддержание гомеостаза путём удаления мусора и мёртвых клеток [2]. Микроглиальные клетки также играют важную роль в развитии/гомеостазе сетчатки и могут опосредовать местные нейровоспалительные реакции [4].

Treg, индуцируемые PE-клетками глаза, которые конститутивно экспрессируют фактор транскрипции Foxp3, необходимы для иммунной толерантности и гомеостаза, поскольку они подавляют чрезмерные иммунные реакции. Таким образом, Foxp3⁺-Tregs, а также Tregs, участвующие в АСАID, считаются ключевыми регуляторами иммунной привилегированности глаза [5].

CE-клетки являются частью внутренней поверхности передней камеры глаза и вступают в контакт с водянистой влагой. CE-клетки человека способствуют местной иммунной толерантности в человеческом глазу, поскольку активированные Т-клетки, подвергшиеся воздействию CE-клеток, не приобретают эффекторную функцию Т-клеток [3]. Кроме того, известно, что CE-клетки конститутивно экспрессируют различные иммуномодулирующие молекулы, такие как Fas-лиганд, лиганд 1 программируемой смерти (PD-L1/CD274) и лиганд белка, связанный с рецептором фактора некроза опухоли, индуцированный глюкокортикоидами, что приводит к апоптозу эффекторных Т-клеток [2][6].

Совокупность перечисленных механизмов позволяет органу зрения противостоять подавляющему большинству тканеспецифических антител, способных вызвать «на себя» иммунные реакции аутоагрессии и привести к потере зрения [7]. Нарушение баланса иммунологических факторов в глазу может привести к развитию различной патологии этого органа, в том числе глаукомебактериальном кератите, катаракте [1].

Бактериальный кератит — острое воспаление роговой оболочки глаза бактериального генеза. Клинически проявляется острой болью в глазу, отёком, корнеальным синдромом, выраженной воспалительной инъекцией глазного яблока, наличием слизисто-гнойных выделений и др. Одним из основных механизмов борьбы макроорганизма с бактериальной инфекцией является активация кислородного взрыва. При бактериальном кератите данный механизм активируется и в итоге защищает орган зрения от распространения инфекции. При других офтальмопатологиях механизмы кислородного взрыва изучены недостаточно, особенно в аспекте предрасположенности (иммуногенетические маркеры). В настоящей работе будет акцентирована роль этих механизмов в патогенезе глаукомы. Являясь одним из наиболее распространённых заболеваний глаза, глаукома имеет высокую медико-социальную значимость, нередко приводит к слепоте и слабовидению и лидирует среди причин инвалидности вследствие офтальмопатологии. В России насчитывается около 1,3 млн больных глаукомой [9][10].

В настоящее время выделяют основные теории развития ПОУГ:

• сосудистая дисфункция (дисрегуляция), приводящая к ишемии диска зрительного нерва [11];
• механическое поражение решетчатой мембраны склеры;
• компрессия аксонов зрительного нерва [12].

Важными факторами развития и прогрессирования глаукомы являются недостаточное кровоснабжение сетчатки и зрительного нерва вследствие нарушения глазного кровотока [4]. Многие авторы отмечают ухудшение показателей артериального кровотока, при этом роль венозного орбитального кровотока в развитии глаукомной оптической нейропатии отражена в единичных работах [11]. Изменения внутрисосудистой микроциркуляции развиваются на фоне нарушения функционирования системы гемостаза, в частности, патологии сосудисто-тромбоцитарного, или первичного, гемостаза [13]. Одной из причин нарушения регионарного кровообращения и микроциркуляции является дисфункция эндотелия, которая может приводить к вазоспазму, усиленному тромбообразованию и усиленной адгезии лейкоцитов к эндотелию [11]. Сосудистый эндотелий играет ключевую роль в регуляции тонуса сосудов сетчатки, зрительного нерва и хориоидеи [14–16].

Оксид азота (NO) играет ключевую роль в регуляции сосудистого гомеостаза и участвует в различных физиологических процессах. Известно, что NO выполняет защитную функцию при повреждении тканей или гибели клеток, вызванном окислительным стрессом [17]. Прогрессирование глаукомы ассоциируется с изменением синтеза NO. В результате постоянного воздействия окислительного стресса, приводящего к недостаточности NO, запускается каскад патологических процессов [18]. Во многих исследованиях сообщается о связи между полиморфизмами гена eNOS и риском развития ПОУГ [11][19][20]. Среди нуклеотидных полиморфизмов, зарегистрированных в локусе NOS3, особенно значимыми являются rs2070744, вариант промотора TC ( T786C) и rs1799983, вариант GT (G894T) в кодоне 298 в экзоне 7 (Glu298Asp). Недавний метаанализ также показал, что полиморфизмы rs1799983 и rs2070744 в NOS3 играют значительную роль в модуляции риска ПОУГ [19]. Однако функциональная роль rs1799983 ( Glu298Asp) является спорной. Существуют исследования in vivo и in vitro, которые предоставили противоположные доказательства того, что Glu298Asp не влияет на биологическую активность или функцию eNOS. Также сообщается об отрицательной ассоциации полиморфизмов в TMTC2 (rs7961953) [20], PLXDC2 (rs7081455) [21], ATOH7 (rs7916697) [22] и в локусе 1q43 [23].

Для оценки состояния эндотелия у пациентов с глаукомой проводилось исследование уровня циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников, показавшее его снижение у пациентов с ПОУГ, и предполагается его взаимосвязь с изменением глазной гемоперфузии [18]. Одним из наиболее информативных методов диагностики эндотелиальной дисфункции является исследование интегрального маркера эндотелиальной дисфункции — фактора Виллебранда. В работе P.L. Lip и соавт. выявлено повышение уровня фактора Виллебранда при глаукоме [24]. Однако, исходя из данных литературы, взаимосвязь изменений сосудистого эндотелия с риском развития глаукомной оптической нейропатии всё ещё недостаточно изучена [15].

Целью настоящего исследования стало изучение ассоциации полиморфных маркеров T786C (rs2070744), C774T (rs1549758), Glu 298 Asp (rs1799983) гена eNOS, а также их гаплотипов с риском развития ПОУГ у жителей Пермского края.

Материалы и методы

Для изучения роли полиморфных маркеров в гене eNOS были изучены данные 188 пациентов в возрасте 39–89 лет. В основную группу были включены 90 человек, у которых была диагностирована ПОУГ. При этом у 67 (74%) человек в качестве сопутствующей патологии диагностирована гипертоническая болезнь. В группу сравнения включены 98 человек, у которых была диагностирована возрастная катаракта различной степени зрелости, при этом гипертоническая болезнь в качестве сопутствующей патологии была у 54 (55%) человек. Все пациенты — жители Пермского края, проходившие лечение в Центре микрохирургии глаза Пермской краевой клинической больницы по поводу катаракты или глаукомы. При поступлении на стационарное обследование и лечение всем больным разъяснялась суть проводимого исследования, ими подписывалось добровольное согласие на участие в нём. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ПМГМУ им. И.М. Сеченова (протокол № 17-19 от 11.12.2019).

В качестве материала для исследования использовалась периферическая кровь, из которой выделялась ДНК с помощью набора «К-СОРБ» («Синтол»), согласно протоколу, затем проводили полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием наборов для определения полиморфных маркеров T786C, C774T, Glu298Asp в гене eNOS («Синтол»).

Построение прогностической модели вероятности определённого исхода выполняли при помощи метода логистической регрессии. Мерой определённости, указывающей на ту часть дисперсии, которая может быть объяснена с помощью логистической регрессии, служил коэффициент R² Найджелкерка.

Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определённого исхода применяли метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определяли по наивысшему значению индекса Юдена.

Результаты

В основной группе средний возраст пациентов составил 71 ± 7 лет, по полу пациенты были распределены равномерно. В группе сравнения средний возраст составил 69 ± 9 лет, пациенты женского пола составили 58%, мужского — 42%. Статистически значимые различия по возрасту и по соотношению полов между основной группой и группой сравнения не выявлены (р = 0,36 и р = 0,42 соответственно).

При исследовании частоты встречаемости аллелей гена eNOS по полиморфному локусу T786C установлены процентные доли аллелей: в основной группе для аллеля Т — 67,5%, для аллеля С — 32,5%; в группе сравнения для аллеля Т — 43,31%, для аллеля С — 31,5%.

При исследовании распределения аллеля Т по полиморфному локусу С774Т гена eNOS в группе пациентов с глаукомой наблюдалось снижение встречаемости в 1,067 раза по сравнению с группой сравнения, различия шансов не были статистически значимыми (ОШ = 0,937; 95% ДИ 0,325–2,707).

При исследовании распределения аллеля С по полиморфному локусу С774Т гена eNOS в группе пациентов с глаукомой наблюдалось снижение встречаемости в 1,186 раза относительно группы сравнения, различия шансов не были статистически значимыми (ОШ = 0,843; 95% ДИ 0,466–1,525).

При исследовании распределения генотипов по полиморфному локусу C774T гена eNOS среди пациентов с ПОУГ встречаемость по гомозиготному генотипу ТТ была выше в 1,329 раза относительно группы сравнения, различия шансов не были статистически значимыми (95% ДИ 0,733–2,409). Частота встречаемости генотипов СС, ТС была ниже в 1,067 и 1,290 раза соответственно. При сопоставлении данных показателей различия шансов не были статистически значимыми: ОШ = 0,938; 95% ДИ 0,333–2,640 и ОШ = 0,775; 95% ДИ 0,421–1,426.

При исследовании распределения аллелей Glu298Asp частота встречаемости аллеля Т была выше в 1,211 раза, аллеля С — ниже в 1,018 раза по сравнению с группой контроля, различия шансов не были статистически значимыми: 95% ДИ 0,519–2,828; 95% ДИ 0,554–1,745.

При исследовании распределения генотипов по полиморфному локусу Glu298Asp гена eNOS частота встречаемости генотипов ТТ, ТС была выше в 1,011 и 1,055 раза соответственно. Частота встречаемости генотипа СС была ниже в 1,014 раза по сравнению с группой контроля, различия шансов не были статистически значимыми: 95% ДИ 0,569– –1,797; 95% ДИ 0,586–1,898; 95% ДИ 0,412–2,363.

Для выявления влияния взаимодействия генотипов на наличие у пациента ПОУГ рассматривалось попарное влияние генотипов и влияние сразу 3 генотипов на наличие глаукомы. В табл. 2 представлены р-значения при сравнении шансов для различных комбинаций генотипов относительно референсного генотипа.

С помощью метода бинарной логистической регрессии нами была построена прогностическая модель, позволяющая определить вероятность выявления ПОУГ в зависимости от различных факторов риска. Факторы для модели отбирали методом исключения по методу Вальда. Получена регрессионная функция:

P = 1 / (1 + e^–z) × 100%,
z = –0,312 + 0,201X_Т – 0,513X_С + 0,680X_ГБ,

где P — вероятность наличия глаукомы; X_Т — eNOS T786 (0 — отсутствие гомозиготы по аллелю Т гена eNOS, 1 — наличие гомозиготы по аллелю Т гена eNOS); X_С — eNOS T786C (0 — отсутствие аллеля С, 1 — наличие аллеля С), X_ГБ — ГБ (0 — отсутствие гипертонической болезни, 1 — наличие гипертонической болезни).

Полученная регрессионная модель является статистически значимой (p = 0,010). Исходя из значения коэффициента детерминации Найджелкерка, модель объясняет 7,9% наблюдаемой дисперсии глаукомы.

В соответствии с полученными значениями коэффициентов регрессии, наличие таких факторов, как гипертоническая болезнь, гомозигота по аллелю Т гена eNOS, увеличивало вероятность выявления ПОУГ. Наличие аллеля С T786C гена eNOS снижало вероятность выявления глаукомы. Характеристики отдельных факторов, вошедших в модель, представлены в табл. 3.

Пороговое значение логистической функции P в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 0,639. Наличие глаукомы прогнозировалось при значении логистической функции P выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность модели составили 42,2 и 80,4% соответственно.

Обсуждение

Из данных литературы известно, что эндотелиальная дисфункция участвует в патогенезе нейродегенеративных изменений при ПОУГ [7]. Среди различных популяций проводилось исследование роли полиморфизма гена eNOS rs2077044, rs1799983. Так, среди китайской популяции не выявлено ассоциаций, в то время как европейской популяции у пациентов с мигренью генотип ТТ по полиморфному локусу Т786C ассоциирован с риском развития глаукомы. В бразильской популяции генотип rs2070744 ассоциирован с ПОУГ у пациентов женского пола. Среди жителей Саудовской Аравии rs1799983 (и гаплотип rs2070744), ассоциированы с ПОУГ у мужчин [16].

В нашем исследовании установлено, что в группе пациентов с ПОУГ генотип ТТ по полиморфному локусу T786C гена eNOS ассоциирован с риском развития глаукомы, при этом аллель С по полиморфному локусу T786C гена eNOS выполняет протективную роль. При исследовании совместного влияния генотипов полиморфных маркеров гена eNOS на развитие ПОУГ у исследуемых больных статистически значимое влияние не выявлено. При этом замечено, что гипертоническая болезнь усиливала негативное влияние повышенного внутриглазного давления на глаукомную оптическую нейропатию.

Проведённый A.A. Kondkar и соавт. анализ гаплотипов показал противоречивые результаты, но в большинстве из них rs2070744 и rs1799983 в группе пациентов с ПОУГ и в группе контроля не были связаны с риском развития глаукомы, как и в нашем исследовании [16]. Таким образом, генотип ТТ по полиморфному локусу T786C гена eNOS является прогностическим маркером, повышающим вероятность развития ПОУГ, при этом аллель С T786C гена eNOS выполняет протективную роль при том же заболевании среди жителей Пермского края.

Об авторах

О. А. Свитич

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

Свитич Оксана Анатольевна — д.м.н., член-корреспондент РАН, профессор каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии Института общественного здоровья им. Ф.Ф. Эрисмана;
директор НИИВС им. И.И. Мечникова,

Москва

А. Р. Кинкулькина

Email: princes111@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4473-0577

Кинкулькина Алия Ряшидовна — аспирант каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии Института общественного здоровья им. Ф.Ф. Эрисмана;

м.н.с.,

Москва

А. С. Авагян

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5642-7092

Авагян Асмик Самсоновна — студентка;

лаборант,

Москва

Т. В. Гаврилова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2071-9322

Гаврилова Татьяна Валерьевна — д.м.н., профессор, зав. каф. офтальмологии,

Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы