Фенотипический профиль актуальных полирезистентных сиквенс-типов (ST 1167, ST 944, ST 208) Аcinetobacter baumannii

Полный текст

Введение

Микроорганизмы, обитающие в стационарах, способны формировать так называемые внутрибольничные популяции, наиболее адаптированные к условиям существования в больничной среде [1]. Широкое распространение инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), в медицинских организациях различного профиля наносит значительный ущерб здоровью населения, экономике и демографической ситуации в стране. Ежегодно в России регистрируют 26–30 тыс. случаев ИСМП, среди которых ведущее место занимают гнойно-септические инфекции (ГСИ) [2–5].

Среди возбудителей ГСИ человека наиболее значимыми являются неферментирующие глюкозу в анаэробных условиях грамотрицательные бактерии [6][7]. Ежегодно в мире регистрируют 1 млн (600 000– 1 400 000) случаев инфекций, вызванных Acinetobacter spp., что составляет 1,8% всех случаев внутрибольничных инфекций [8][9]. Наиболее клинически значимым видом рода Acinetobacter является A. baumannii, о чём свидетельствуют результаты многолетних исследований, проведённых в нашей стране и за рубежом [6][10–13].

Самая высокая частота встречаемости возбудителя наблюдается в отделениях реанимации и интенсивной терапии [14]. Основным резервуаром A. baumannii в стационаре являются колонизированные и инфицированные больные. К факторам риска развития инфекции, обусловленной данным патогеном, относят возраст пациентов, наличие онкологических заболеваний, нарушения иммунного статуса, ожоговую болезнь, сепсис [15–17]. Резистентность госпитальных штаммов A. baumannii к различным классам антибиотиков, ряду дезинфицирующих средств и антисептиков существенно снижает эффективность лечебно-профилактических мероприятий и приводит к формированию эпидемических очагов ГСИ с высокой летальностью пациентов из перечисленных групп риска [18–20].

Внутривидовая характеристика (типирование) микроорганизмов является неотъемлемой частью работы клинического микробиолога при расшифровке вспышек ГСИ в рамках эпидемиологического надзора за ИСМП. Данный метод позволяет провести сопоставление бактериальных изолятов по определённым биологическим свойствам и ответить на вопрос о внутривидовом однообразии (разнообразии) циркулирующей популяции в структурном подразделении или медицинской организации в целом [15][21].

Методы идентификации серотипов, используемые для оценки сопоставимости микроорганизмов, можно разделить на фенотипические (основанные на изучении антибиограмм, био-, серо- и фаготипировании, иммуноблоттинге и электрофорезе белков и др.) и генотипические (основанные на амплификации нуклеиновых кислот, секвенировании отдельных фрагментов генома и др.).

Приведённые методы существенно различаются по таким характеристикам, как воспроизводимость, разрешающая способность, стоимость, трудоёмкость проведения исследований и особенности интерпретации результатов. По основным приведённым выше характеристикам (за исключением высокой стоимости) генотипические методы обладают явными преимуществами. Для двух из генотипических методов (pulsed field gel electrophoresis — PFGE и multilocus sequence typing — MLST) разработаны стандартные протоколы, что позволяет получать в различных лабораториях полностью сопоставимые данные.

Вместе с тем большинство практикующих микробиологических лабораторий в стране не имеют возможности использовать генотипические методы для внутривидовой характеристики микроорганизмов в силу высоких финансовых затрат [22]. В связи с этим во многих медицинских организациях в качестве основного метода сопоставимости микроорганизмов по-прежнему используют метод оценки антибиотикограммы, что становится малоэффективным на фоне растущей резистентности к современным антимикробным препаратам [10–14][23].

В настоящее время в общедоступной базе PubMLST.org объединены данные о типировании микробных популяций, собраны более 3900 комбинаций аллелей с типом последовательности (sequence type — ST) и более 6600 изолятов, содержащих информацию о фенотипе и происхождении A. baumannii [24]. Во всём мире наиболее широко распространены штаммы, продуцирующие карбапенемазу — ключевой фактор распространения бактерий с множественной лекарственной устойчивостью. В их числе ST 208 и ST 944 определены как преобладающие последовательности типа карбапенем-резистентного A. baumannii [25–27].

Целью исследования явилась разработка диагностической панели для внутривидового типирования A. baumannii часто встречаемых сиквенс-типов ST 1167, ST 944, ST 208, основанной на изучении фенотипических признаков микроорганизмов.

Материалы и методы

Видовая идентификация 74 клинических изолятов A. baumannii из 4 многопрофильных медицинских учреждений крупного промышленного центра Приволжского федерального округа (отделений хирургии, терапии, оториноларингологии, реанимации и сомато-психиатрии) была основана на культуральных, морфологических и тинкториальных свойствах микроорганизмов [28]. Чувствительность A. baumannii к профильным антибиотикам определяли в соответствии с методическими указаниями МУ 4.2.1890-04 и рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing [29][30].

Мультилокусное секвенирование-типирование A. baumannii осуществляли с использованием наборов реагентов и оборудования фирмы «Applied Biosystems» по методике, описанной производителем [31]. Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности генов «домашнего хозяйства» обрабатывали с помощью программы «SeqMan» («DNASTAR Inс.»). Сиквенс-тип определяли, основываясь на комбинации аллелей с использованием оксфордской схемы [32]. Штаммы, находящиеся в базе данных, группировали в клональные комплексы на основании кластеризации методом eBURST для бактерий вида A. baumannii.

Для исследования биохимического профиля были использованы наборы «NEFERM test 24» («Erba Lachema»).

Оценку биоплёнкообразующей способности на твёрдой поверхности проводили путём культивирования изолятов A. baumannii в полистироловых микротитровальных 96-луночных планшетах с последующей окраской их адгезировавшейся части 1% кристаллическим фиолетовым и определением оптической плотности (ОП) на спектрофотометре «Multisсan FC» («Thermo Scientific») [33][34]. Результат определяли по критериям: ОП ≥ 4,0 — высокая биоплёнкообразующая способность, ОП ≥ 3,0 — умеренная, ОП ≥ 2,0 — низкая.

Анализ наличия (отсутствия) зон задержки роста вокруг бумажных дисков с нанесёнными антибиотиками — эритромицином (15 мкг), ванкомицином (5 мкг), рифампицином (5 мкг), клиндамицином (2 мкг), фузидином (10 мкг), линезолидом (10 мкг) — проводили диско-диффузионным методом на питательном агаре Мюллера–Хинтона [29].

Чувствительность A. baumannii к анилиновым красителям выявляли с использованием 0,1% водно-спиртовых растворов бромтимолового синего, метилового красного, фуксина основного, бромкрезолового пурпурного. Испытуемый бактериальный штамм A. baumannii в виде 18-часовой бульонной культуры распределяли по поверхности чашки Петри с питательным агаром Мюллер–Хинтона. На газон с впитавшейся культурой наносили по 5 мкл 1% водно-спиртовых растворов анилиновых красителей. После впитывания капель чашки переворачивали и инкубировали при 37 ± 1°С в течение 20–24 ч. О наличии антимикробного эффекта анилиновых красителей судили по появлению зон угнетения роста [35].

Изучение чувствительности к дезинфицирующим средствам проводили с использованием дезинфектантов «Форекс-хлор» (0,1 и 0,06%), «Амиксидин» (0,25%), «Жавель Абсолют» (0,015%), «Миродез» (2%), «Клиндезин Экстра» (0,1%) согласно Федеральным клиническим рекомендациям «Способ определения чувствительности бактерий к дезинфицирующим средствам при мониторинге устойчивости к антимикробным препаратам в медицинских организациях», а также МУ 3.5.1.3439- 17 «Оценка чувствительности к дезинфицирующим средствам микроорганизмов, циркулирующих в медицинских организациях». Штаммы считали чувствительными, если гибель тестируемого микроорганизма составляла 100% (отсутствие роста во всех пробах), устойчивыми — при наличии роста хотя бы в одной пробе.

Изучение возможности использования бактериофагов в диагностических, лечебных, противоэпидемических и профилактических мероприятиях продиктовано проблемой качественного оказания медицинской помощи на фоне высокой интенсивности лечебно-диагностического процесса. Исследование чувствительности штаммов A. baumannii к бактериофагу проводили посредством диффузионного метода [36]. Экспериментальный образец ацинетобактерного бактериофага с высокой литической и специфической активностью был получен из биологического материала пациентов и из сточных вод медицинского учреждения. По морфологическим признакам фаг относился к морфогруппе С1 семейства Podoviridae. Средний уровень литической активности фага по методу Аппельмана составил 10^{–4,62±0,18}, концентрация фаговых частиц по Грациа — 2,8 × 10⁵ БОЕ [37][38]. Испытуемый бактериальный штамм в виде 18-часовой бульонной культуры распределяли по поверхности чашки Петри с питательным агаром Мюллера–Хинтона. На газон с впитавшейся культурой наносили по 1 капле (0,03 мл) бактериофага с последующей инкубацией при 37 ± 1°С в течение 18 ч. Степень лизиса оценивали путем визуализации зоны на месте нанесения капель фага по 5-балльной шкале.

Результаты

Для внутривидовой характеристики A. baumannii были идентифицированы 74 полирезистентных штамма. Для секвенирования MLST отобраны в случайном порядке 15 (из 74) штаммов. Выявили 3 сиквенс-типа: ST 1167 — 6 изолятов, ST 944 — 5, ST 208 — 4.

С целью формирования диагностической панели были изучены фенотипические свойства ST 1167, ST 944, ST 208 с использованием общедоступных тестов, в том числе тесты по оценке биохимического профиля, биоплёнкообразующей способности, зон задержки роста вокруг дисков с непрофильными антибиотиками, чувствительности штаммов A. baumannii к анилиновым красителям и дезинфицирующим средствам, а также чувствительности к бактериофагу.

На первом этапе исследования проводили оценку штаммов A. baumannii, отнесённых к 3 сиквенс-типам по биохимическому профилю, используя наборы «NEFERM test 24».

Все штаммы ST 1167 (100%) были положительными в тестах: цитрат Симмонса, ксилоза, арабиноза, малонат, галактоза, γ-глутамилтрансфераза (ГГТ), фосфатаза. Отрицательными — по уреазе, аргинину, орнитину, лизину, ацетамиду, β-глюкозидазе, N-ацетил β-D-глюкозидазе, лактозе, маннитолу, трегалозе, α-галактозидазе, β-галактозидазе, мальтозе, целлобиозе, сахарозе, инозитолу, эскулину. Штаммы ST 944 дали положительный результат в тестах: цитрат Симмонса, арабиноза, галактоза, фосфатаза, отрицательный — уреаза, аргинин, орнитин, лизин, ацетамид, β-глюкозидаза, N-ацетил β-D-глюкозидаза, лактоза, маннитол, трегалоза, ксилоза, α-галактозидаза, β-галактозидаза, малонат, мальтоза, целлобиоза, сахароза, инозитол, ГГТ, эскулин.

Изоляты ST 208 были положительными по цитрату Симмонса, ксилозе, арабинозе, галактозе, фосфатазе, отрицательными — по уреазе, аргинину, орнитину, лизину, ацетамиду, β-глюкозидазе, N-ацетил-β-D-глюкозидазе, лактозе, маннитолу, трегалозе, α-галактозидазе, β-галактозидазе, малонату, мальтозе, целлобиозе, сахарозе, инозитолу, ГГТ, эскулину.

Штаммы A. baumannii ST 1167 отличались от ST 944 и ST 208 по малонату и ГГТ, а ST 944 от других сиквенс-типов — по ксилозе. Наибольшая биохимическая активность выявлена у представителей ST 1167 (были положительными в 7 тестах из 24), наименьшей биохимической активностью характеризовались ST 944 (положительны лишь в 4 из 24 тестов).

Таким образом, по результатам оценки биохимического профиля исследуемых сиквенс-типов (ST 1167, ST 944, ST 208) для проведения типирования были отобраны тесты: малонат, ГГТ, ксилоза.

По результатам тестирования установлено, что высокую биоплёнкообразующую активность имели штаммы ST 944 (ОП = 4,03–5,12), умеренную — ST 1167 (ОП = 2,03–3,05). Низкой плёнкообразующей способностью обладали изоляты A. baumannii ST 208 (ОП = 1,07–1,82).

В качестве эксперимента по определению зон задержки роста A. baumannii вокруг дисков с антибиотиками были использованы препараты, которые для лечения инфекционной патологии с участием A. baumannii не применяются: эритромицин (15 мкг), ванкомицин (5 мкг), рифампицин (5 мкг), клиндамицин (2 мкг), фузидин (10 мкг), линезолид (10 мкг). Оценку результатов проводили по признаку наличия (отсутствия) задержки зоны роста бактериальной культуры, выросшей на питательном агаре Мюллера–Хинтона, вокруг диска с испытуемым антибиотиком. Анализ зон задержки роста вокруг дисков с антибактериальными препаратами установил, что все штаммы, отнесенные к ST 1167, имели зону задержки роста к эритромицину, ванкомицину, рифампицину, клиндамицину и линезолиду. Исключение составил фузидин — 2 штамма из 6 дали рост вокруг диска сплошным газоном. Штаммы ST 944 имели зоны задержки роста к единственному антибиотику — рифампицину. Рост изолятов ST 208 подавляли только ванкомицин и рифампицин. Как показали результаты исследования, для внутривидового типирования 3 сиквенс типов A. baumannii можно использовать диски с 4 антибиотиками: эритромицином, ванкомицином, клиндамицином и линезолидом.

Оценка чувствительности изучаемых изолятов к анилиновым красителям (бромтимоловый синий, метиловый красный, фуксин основной, бромкрезоловый пурпурный) установила, что рост штаммов ST 1167 подавлял фуксин основной, в остальных тестах представители данного сиквенс-типа оказались невосприимчивыми к красителям. У штаммов ST 944 выявлена различная степень чувствительности к бромтимоловому синему и фуксину основному, зоны задержки роста к остальным 2 красителям не были обнаружены. Штаммы ST 208 были устойчивы ко всем тестируемым анилиновым красителям.

Исходя из представленных выше результатов, данный признак не может быть применим для типирования в силу его высокой вариабельности, в том числе внутри групп.

Анализ чувствительности выделенных изолятов A. baumannii к дезинфицирующим средствам установил, что все тестируемые штаммы были устойчивы к 0,06% раствору «Форекс-хлор». Остальные дезинфицирующие средства характеризовались значительной вариабельностью, что позволило сделать вывод о нецелесообразности их использования для внутривидового типирования ST 1167, ST 944, ST 208.

Изучение чувствительности к ацинетобактерному бактериофагу проведено диффузионным методом (спот-тест) на питательной среде Мюллера–Хинтона. Исследование фаголизабельности к бактериофагу показало, что штаммы A. baumannii ST 1167 имели высокий уровень чувствительности (5 изолятов получили оценку «++++»). Клинический изолят № 680 из этой группы отличался наличием единичных колоний вторичного роста в зоне лизиса, поэтому результат был оценен на «+++», что также относится к оценке результата как высокого. Штаммы сиквенс-типов (ST 944, ST 208) проявили устойчивость к ацинетобактерному бактериофагу (оценка «–»).

Основываясь на указанных выше данных, ацинетобактерный бактериофаг может быть применён для внутривидового типирования A. baumannii.

Таким образом, определён набор дифференцирующих тестов, позволяющих выявить внутривидовые особенности полирезистентных штаммов A. baumannii 3 сиквенс-типов (ST 1167, ST 944 и ST 208) по способности к разложению ксилозы, малоната натрия, ГГТ; наличию зон задержки роста к эритромицину, клиндамицину, линезолиду, ванкомицину; выраженности теста на плёнкообразующую способность; чувствительности к ацинетобактерному бактериофагу (таблица).

Разработанная диагностическая панель позволила осуществить внутривидовую дифференциацию оставшихся 59 из 74 штаммов A. baumannii. По результатам тестирования из 59 штаммов A. baumannii 28 были отнесены к ST 1167, 14 — к ST 944, 15 — к ST 208. Оставшиеся 2 штамма по основным признакам, входящим в панель тестирования, не подходили ни к одной из представленных групп. В дальнейшем их генетическая принадлежность была подтверждена методом MLST. Штамм A. baumannii № 80 был отнесен к ST 502, штамм № 76 — к ST 450.

Обсуждение

В ходе исследования штаммов A. baumannii 3 сиквенс-типов (ST 1167, ST 944, ST 208) сформирован оптимальный набор дифференциальных тестов, позволяющих выявить внутривидовые особенности микроорганизмов по фенотипическим признакам (отношение к ксилозе, малонату, ГГТ (биохимическим тестам), биоплёнкообразующей способности, резистентности к эритромицину, клиндамицину, линезолиду (по зонам задержки роста), чувствительности к ацинетобактерному бактериофагу.

Производство и реализация тест-системы для определения внутривидовой принадлежности штаммов A. baumannii станет эффективным и экономичным методом внутривидового типирования микроорганизмов для научных и практических целей. Затраты на проведение тестирования составят 205,5–240,8 руб., длительность проведения исследования — 24 ч. С учётом стоимости сиквенс-типирования (3000 руб.) экономия составит более 2700 руб., снижение цены произойдёт в 14,6– 12,4 раза. Метод станет доступен любой бактериологической лаборатории, осуществляющей диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний человека и животных.

По результатам проведённых нами исследований в международную базу данных PubMLST депонированы 6 сиквенс-типов (ST) A. baumannii, выделенных из медицинских организаций (№ 942 (22F); № 943 (32F); № 944 (23F); № 945 (28F); № 946 (2179F) и № 952 (31) [24].

Заключение

В рамках микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за ИСМП разработанная диагностическая панель позволит проводить внутривидовую дифференциацию 3 широко распространённых сиквенс-типов A. baumannii, характеризующихся высоким уровнем циркуляции и устойчивостью к антимикробным препаратам. Прежде всего, тест-система будет актуальна и востребована для лабораторий и научных подразделений, не имеющих возможности использовать методы секвенирования.

Об авторах

О. С. Федотова

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1928-8211

Федотова Ольга Семеновна - с.н.с., зав. лаб. клеточных культур

Екатеринбург

Россия

Ю. А. Захарова

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: zakharova_ya@eniivi.ru
ORCID iD: 0000-0003-3416-0902

Захарова Юлия Александровна - д.м.н., доц., зам. рук. по научной работе, г.н.с.

Екатеринбург

Россия

А. В. Остапчук

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8157-6866

Остапчук Анна Владимировна - магистр УрФУ им. первого Президента России Б.Н. Ельцина

Екатеринбург

Россия

У. А. Бажанова

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1730-0013

Бажанова Ульяна Александровна - зав. арбитражной лаб.

Екатеринбург

Россия

А. А. Захаров

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8573-0939

Захаров Александр Андреевич - магистр

Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы