Effect of antibodies to agglutinogens 1 and 2, filamentous hemagglutinin and pertussis toxin on formation of Bordetella pertussis biofilms on abiotic substrate

E. M. Zaytsev; Зайцев Е. М.; M. V. Britsina; Брицина М. В.; M. N. Ozeretskovskaya; Озерецковская М. Н.; N. U. Mertsalova; Мерцалова Н. У; I. G. Bazhanova; Бажанова И. Г.

doi:10.36233/0372-9311-110

Влияние антител к агглютиногенам 1 и 2, филаментозному гемагглютинину и коклюшному токсину на формирование биоплёнок Bordetella pertussis на абиотическом субстрате

Авторы: Зайцев Е.М.¹, Брицина М.В.¹, Озерецковская М.Н.¹, Мерцалова Н.У¹, Бажанова И.Г.¹
Учреждения:
1. НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Выпуск: Том 98, № 3 (2021)
Страницы: 283-289
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1037
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-110
ID: 1037

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Изучение влияния антител к агглютиногенам (АГ) -1 и -2, филаментозному гемагглютинину (ФГА) и коклюшному токсину (КТ) на формирование биоплёнок штаммами Bordetella pertussis на абиотическом субстрате.

Материалы и методы. Использованы вакцинные и свежевыделенные штаммы B. pertussis. В качестве инокулята для получения биоплёнок использовали культуры штаммов, выращенных на плотной питательной среде. Интенсивность образования биоплёнок в присутствии сывороток к АГ-1 и -2, ФГА и моноклональных антител (МКА) к S1-, S2- и S3-субъединицам КТ в круглодонных полистироловых 96-луночных планшетах оценивали окрашиванием 0,1% раствором генцианового фиолетового.

Результаты. Большинство исследованных штаммов были чувствительны к антителам, что проявлялось в полном подавлении образования биоплёнок. Все штаммы были чувствительны к сыворотке к АГ-1, сыворотке к ФГА, МКА к S2-субъединице КТ. К сыворотке к АГ-2 были чувствительны 3 из 4 исследованных штаммов, имеющих этот АГ в своем составе: № 475 (серовар 1.2.3), № 317 (серовар 1.2.3) и № 178 (серовар 1.2.0). Относительная устойчивость к сыворотке была выявлена только у штамма № 305 серовара 1.2.0, однако при минимальном её разведении интенсивность образования биоплёнки была в 1,8 раза ниже, чем в контроле. Штаммы № 703 (серовар 1.0.3) и № 287 (серовар 1.0.3), не имеющие АГ-2, были устойчивы к сыворотке. К МКА к S1- и S3-субъединицам КТ были чувствительны, соответственно, 4 и 5 из 6 использованных штаммов. Штамм № 305 был устойчив к МКА к S1- и S3-субъединицам, а штамм № 287 — к МКА к S1-субъединице. При этом при минимальном разведении МКА интенсивность образования биоплёнок была, соответственно, в 2 и 1,8 раза ниже, чем в контроле.

Заключение. Приведённые данные свидетельствуют о подавлении роста биоплёнок штаммов B. pertussis антителами как к поверхностным структурам микробной клетки (АГ-1 и -2, ФГА), так и к S1-, S2- и S3-субъ- единицам КТ.

Ключевые слова

штаммы B. pertussis, биоплёнки, сыворотка к агглютиногену, сыворотка к филаментозному гемагглютинину, моноклональные антитела, коклюшный токсин

Полный текст

Введение

Эпидемический процесс коклюшной инфекции продолжается во всем мире, в том числе в странах с высоким уровнем вакцинации. Заболеваемость коклюшем в последние годы составляет 10–40 случаев на 100 тыс. жителей в год и наиболее высока у детей младшего возраста. Рост заболеваемости регистрируется также среди подростков и взрослых, являющихся источником передачи инфекции неиммунизированным младенцам, которые подвергаются риску тяжелых форм заболевания и смерти [1][2][3].

Рост заболеваемости коклюшем связывают с рядом факторов, среди которых выделяют недостаточную эффективность существующих бесклеточных коклюшных вакцин, а также мутации в генах возбудителя, кодирующих основные факторы вирулентности Bordetella pertussis, что привело к появлению циркулирующих штаммов, отличающихся повышенной вирулентностью [4][5]. Одной из вероятных причин продолжающегося эпидемического процесса коклюшной инфекции также могут быть биоплёнки B. pertussis.

Согласно современным представлениям, биоплёнки представляют собой сообщества бактериальных клеток, прикреплённых к поверхности и друг к другу и заключённых в полимерный матрикс. Компоненты матрикса защищают бактерии в биоплёнке от повреждающих факторов внешней среды [6]. Этапы формирования биоплёнок включают начальное прикрепление к поверхности отдельных клеток, их рост с образованием монослоя с последующим образованием микроколоний и полимерного матрикса. Первичное прикрепление планктонных бактерий к абиотическим поверхностям является обратимым процессом, в реализации которого принимают участие физико-химические взаимодействия, в частности, электростатические и гидрофобные. Переход к необратимой связи происходит с участием адгезинов, расположенных на поверхности микробных клеток и специфичных для каждого вида бактерий [7].

Микробы рода Bordetellа, как и другие бактерии, обладают способностью к формированию биоплёнок на абиотических и биотических поверхностях. B. pertussis продуцирует ряд вирулентных факторов, определяющих патогенез коклюшной инфекции. Условно их можно разделить на адгезины (фимбрии, пертактин, фактор колонизации трахеи, филаментозный гемагглютинин (ФГА)) и токсины (коклюшный токсин (КТ), дермонекротический токсин, трахеальный цитотоксин, аденилатциклаза, липополисахарид).

Имеются данные о значении адгезинов B. pertussis и КТ для прикрепления к клеткам респираторного тракта. Однако значение этих факторов для формирования биоплёнок на биотических и абиотических поверхностях, а также чувствительность биоплёнок B. pertussis к иммунным факторам пока изучена недостаточно, по данной проблеме имеются лишь единичные публикации [8].

Цель работы — изучение влияния антител к агглютиногенам (АГ) -1 и -2, ФГА и КТ на формирование биоплёнок B. pertussis на абиотическом субстрате.

Материалы и методы

В опытах использовали «вакцинные» штаммы B. pertussis, выделенные от больных коклюшем в 1950–1960-е гг., использующиеся в России для изготовления корпускулярных коклюшных вакцин: штамм № 475 (серовар 1.2.3), штамм № 305 (серовар 1.2.0), штамм № 703 (серовар 1.0.3), а также выделенные в России от больных коклюшем в 2001–2010 гг.: штамм № 178 (серовар 1.2.0), штамм № 287 (серовар 1.0.3) и штамм № 317 (серовар 1.2.3). В опытах использовали сыворотки диагностические коклюшные к АГ-1 и -2 (Филиал «Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), мышиную сыворотку к ФГА (кат. номер JNIH-11), мышиные моноклональные антитела (МКА) к субъединицам S1 (кат. номер 99/506), S2 (кат. номер 99/538) и S3 (кат. номер 99/542) КТ (National Institute for Biological Standards and Control, Великобритания). Контроль морфологических, серологических и культуральных свойств штаммов проводили в соответствии с методическими указаниями¹.

В качестве инокулята для получения биоплёнок использовали ночные культуры штаммов, выращенных на плотной питательной среде («Бордетелагар» — питательная среда для культивирования и выделения коклюшного микроба сухая, ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск). Cуспензию бактерий культивировали в 96-луночных пластиковых планшетах («Nunc») в жидкой синтетической питательной среде в соответствии с ранее описанным методом [9]. Культуры штаммов в жидкой синтетической питательной среде в концентрации 10 МОЕ в объёме 100 мкл вносили в лунки планшетов. После этого в лунки добавляли по 100 мкл антител. Сыворотки к АГ-1 использовали в разведениях 1 : 5000, 1 : 10 000, 1 : 20 000, 1 : 4000, к АГ-2 — 1 : 2500, 1 : 5000, 1 : 10 000, 1 : 20 000. Сыворотку к ФГА и МКА к субъединицам КТ использовали в разведениях 1 : 20, 1 : 200, 1 : 400 и 1 : 800. Отрицательным контролем служили сыворотки неиммунных мышей и кроликов в разведениях 1 : 20 и 1 : 2500 соответственно.

Планшеты накрывали крышкой и помещали в термостат при 37ºС в горизонтальном положении на ровную поверхность на 24 ч. Интенсивность образования биопленок (ИОБ) в планшетах оценивали по окрашиванию 0,1% раствором генцианового фиолетового по показателям оптической плотности (ОП) окрашенного растворителя по отношению к негативному контролю (ОП_К = 0,047) как плотные (ОП ≥ 0,188), умеренные (0,094 ≤ ОП < 0,188), слабые (0,078 ≤ ОП < 0,094), отсутствие биопленок (ОП < 0,078).

Результаты оценивали по значениям титра сывороток, которые определяли как наибольшие их разведения, подавляющие рост биоплёночных культур по сравнению с контролем (слабые биоплёнки или их отсутствие). Формирование плотных и умеренных биоплёнок в присутствии антител рассматривали как устойчивость к антителам. Для достоверного обсчёта результатов использовали 5 лунок на один опытный образец и рассчитывали среднюю величину ОП опытного образца и удвоенную ошибку. Сравнения проводили по критерию t Стьюдента [10].

Результаты

Результаты исследования чувствительности вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к антителам к антигенам возбудителя коклюша приведены в таблице.

Чувствительность вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к антителам к антигенам коклюшного микроба
Sensitivity of vaccine and freshly isolated B. pertussis strains to antibodies to antigens of pertussis microbe

		Штаммы (серовар) / Strains (serotype)
Параметр Parameter		вакцинные / vaccine			свежевыделенные / freshly isolated
		№ 475 (1.2.3)	№ 305 (1.2.0)	№ 703 (1.0.3)	№ 317 (1.2.3)	№ 178 (1.2.0)	№ 287 (1.0.3)
Контроль Control	ОП optical density	0,138 ± 0,020	0,242 ± 0,031	0,232 ± 0,042	0,195 ± 0,012	0,193 ± 0,021	0,192 ± 0,013
	ИОБ intensity of biofilm formation	Умеренная Medium	Плотная Dense	Плотная Dense	Плотная Dense	Плотная Dense	Плотная Dense
Сыворотка к АГ-1 Antiserum to agglutinogen 1	ОП optical density ИОБ intensity of biofilm formation	0,072 ± 0,006 Нет No	0,089 ± 0,010 Слабая Weak	0,066 ± 0,005 Нет No	0,089 ± 0,003 Слабая Weak	0,087 ± 0,009 Слабая Weak	0,093 ± 0,004 Слабая Weak
	титр антител serum dilution	1 : 20 000‘	1 : 10 000‘	1 : 10 000‘	1 : 5000‘	1 : 10 000‘	1 : 5000‘
Сыворотка к АГ-2 Antiserum to agglutinogen 2	ОП optical density ИОБ intensity of biofilm formation	0,076 ± 0,005 Нет No	134 ± 0,013 Умеренная Medium	0,212 ± 0,032 Плотная Dense	0,092 ± 0,004 Слабая Weak	0,098 ± 0,011 Слабая Weak	0,174 ± 0,013 Умеренная Medium
	титр антител serum dilution	1 : 10 000‘	1 : 2500‘‘	‘‘	1 : 2500‘	1 : 2500‘	‘‘
Сыворотка к ФГА Antiserum to FHA	ОП optical density	0,056 ± 0,003	0,053 ± 0,002	0,054 ± 0,009	0,0052 ± 0,002	0,054 ± 0,007	0,062 ± 0,003
	ИОБ intensity of biofilm formation	Нет No	Нет No	Нет No	Нет No	Нет No	Нет No
	титр антител serum dilution	1 : 200‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘
МКА к Si-субъединице КТ MCA to the Si subunit of PT	ОП optical density ИОБ intensity of biofilm formation	0,082 ± 0,006 Слабая Weak	0,121 ± 0,006 Умеренная Medium	0,060 ± 0,002 Нет No	0,075 ± 0,001 Нет No	0,077 ± 0,019 Нет No	0,105 ± 0,007 Умеренная Medium
	титр антител MCA dilution	1 :200‘	1 : 20‘‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘‘
МКА к S2-субъединице КТ MCA to the S2 subunit of PT	ОП optical density ИОБ intensity of biofilm formation	0,073 ± 0,002 Нет No	0,080 ± 0,004 Слабая Weak	0,055 ± 0,001 Нет No	0,056 ± 0,002 Нет No	0,059 ± 0,003 Нет No	0,071 ± 0,002 Нет No
	титр антител MCA dilution	1 :200‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘
МКА к SS-субъединице КТ MCA to the S3 subunit of PT	ОП optical density ИОБ intensity of biofilm formation	0,079 ± 0,005 Нет No	0,119 ± 0,013 Умеренная Medium	0,058 ± 0,002 Нет No	0,056 ± 0,002 Нет No	0,055 ± 0,002 Нет No	0,065 ± 0,003 Нет No
	титр антител MCA dilution	1 :200‘	1 : 20‘‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘	1 : 20‘

Примечание. *Подавление роста биоплёнок (различия между опытными образцами и контролем статистически достоверны (р < 0,05); **отсутствие подавления роста биоплёнок.
Note. *Suppression of biofilm growth (differences between experimental samples and control are statistically significant (p < 0.05); **no suppression of biofilm growth.

Контрольные культуры (не содержавшие антител) исследованных штаммов отличались по ИОБ. Штамм № 475 формировал умеренные биоплёнки, а штаммы № 305, 703, 317, 178 и 287 — плотные.

Все исследованные штаммы проявляли чувствительность к антисыворотке к АГ-1. Титры антисыворотки к АГ-1, подавлявшие рост биоплёнок со штаммом № 475, составляли 1 : 20 000, со штаммами № 305, 703 и 178 — 1 : 10 000, а со штаммами № 287 и 317 — 1 : 5000.

К сыворотке к АГ-2 были чувствительны 3 штамма: № 475 (серовар 1.2.3), 317 (серовар 1.2.3) и 178 (серовар 1.2.0). Вакцинный штамм № 475 отличался высокой чувствительностью к сыворотке, титр которой составлял 1:10 000. Титры сыворотки со штаммами № 317 и 178 составляли 1 : 2500. Штамм № 305 (серовар 1.2.0) проявлял устойчивость к сыворотке и формировал умеренные или плотные биоплёнки в зависимости от её разведения, однако при разведении 1 : 2500 ИОБ была в 1,8 раза ниже, чем в контроле. Штаммы № 703 (серовар 1.0.3) и 287 (серовар 1.0.3) были устойчивыми к сыворотке и формировали умеренные или плотные биоплёнки.

Все штаммы были чувствительны к антисыворотке к ФГА, титр которой со штаммом № 475 составлял 1 : 200, а с остальными штаммами — 1 : 20.

МКА к S1-субъединице КТ подавляли рост биоплёнок штамма № 475 в разведении 1 : 200, а штаммов № 703, 317 и 178 — в разведении 1 : 20. Штаммы № 305 и 287 были устойчивы к МКА к S1-субъединице и формировали умеренные или плотные биоплёнки, однако при разведении МКА 1 : 20 ИОБ была в 2 раза ниже, чем в контроле культуры.

Все штаммы были чувствительны к МКА к S2-субъединице КТ. Титр МКА со штаммом № 475 составлял 1 : 200, а с остальными штаммами — 1 : 20.

К МКА к S3-субъединице КТ были чувствительны у 5 из 6 исследованных штаммов. Титр МКА со штаммом № 475 составлял 1 : 200, а со штаммами № 703, 317, 178 и 287 — 1 : 20. Штамм № 305 был устойчив к МКА и формировал умеренные или плотные биоплёнки. При разведении МКА 1 : 20 ИОБ была в 2 раза ниже, чем в контроле.

Обсуждение

Механизмы образования биоплёнок B. pertussis и влияние на этот процесс иммунных факторов мало изучены и могут быть связаны с эффекторными механизмами клеточного и гуморального иммунитета [8]. Нами исследована чувствительность биоплёнок основных сероваров (1.0.3, 1.2.0 и 1.2.3) вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к сывороткам к АГ-1 и -2, ФГА и МКА к S1-, S2- и S3-субъединицам КТ. Результаты опытов показали, что большинство исследованных штаммов были чувствительными к антителам, что проявлялось в полном подавлении образования биоплёнок. Все штаммы были чувствительными к сыворотке к АГ-1 и ФГА, МКА к S2-субъединице КТ. К сыворотке к АГ-2 были чувствительными 3 из 4 исследованных штаммов, имеющих этот АГ в своем составе: № 475 (серовар 1.2.3), № 317 (серовар 1.2.3) и № 178 (серовар 1.2.0). Относительная устойчивость к сыворотке была выявлена только у штамма № 305 серовара 1.2.0, однако при минимальном её разведении ИОБ была в 1,8 раза ниже, чем в контроле культуры. Штаммы № 703 (серовар 1.0.3) и 287 (серовар 1.0.3), не имеющие АГ-2, были устойчивы к сыворотке. К МКА к S1- и S3-субъединицам КТ были чувствительны, соответственно, 4 и 5 из 6 использованных штаммов. Штамм № 305 был устойчив к МКА к S1- и S3-субъединицам, а штамм № 287 — к МКА к S1-субъединице. При этом при минимальном разведении МКА ИОБ была в 2 и 1,8 раза соответственно ниже, чем в контроле культуры.

По отношению ко всем штаммам выявлена зависимость ИОБ от разведения антител. Увеличение разведения антител сопровождалось усилением роста биоплёнок. Относительная устойчивость штамма № 305 к сыворотке к АГ-2 и к МКА к S1- и S3-субъединицам КТ, а штамма № 287 к S1-субъединице КТ может быть обусловлена различным соотношением между уровнем экспрессии этих факторов и уровнем антител в составе использованных препаратов.

В целом мы не обнаружили существенных различий между исследованными вакцинными и свежевыделенными штаммами по чувствительности к противококлюшным антителам. Исключение составил вакцинный штамм № 475, отличавшийся более высокой, по сравнению с другими штаммами, чувствительностью к антителам. Высокую чувствительность штамма № 475 к антителам можно объяснить относительно низкой, в отличие от остальных штаммов, ИОБ.

Результаты опытов позволяют сделать определённые выводы о значении АГ-1 и -2, ФГА и S1-, S2- и S3-субъединиц КТ для биоплёнкообразования B. pertussis на абиотическом субстрате. Подавление образования биоплёнок сыворотками к АГ-2 и ФГА согласуется с современными представлениями о их значении в патогенезе коклюша. Основным адгезином B. pertussis является ФГА, участвующий в процессах адгезии и колонизации респираторного тракта. В адгезии B. pertussis на клетках респираторного тракта принимают участие также фимбриальные белки, состоящие из двух основных субъединиц — Fim2 и Fim3, соответствующих АГ-2 и -3. Подавление образования биоплёнок сыворотками к ФГА и АГ-2 подтверждает их значение как адгезинов и согласуется с данными других авторов [11]. Влияние сывороток к ФГА на рост биоплёнок может быть связано не только с подавлением адгезии планктонных клеток на субстрате, но также с их прикреплением к формирующейся биоплёнке [12].

АГ-1 является поверхностной структурой микробной клетки, однако, в отличие от АГ-2 и -3, не ассоциирован с фимбриями. Значение этого антигена для патогенеза коклюша не вполне ясно, однако известно его значение как протективного антигена. В частности, было показано, что защитная активность цельноклеточных коклюшных вакцин коррелирует с содержанием в клетке АГ-1, -2, -3 [13]. Полученные нами данные указывают на значение АГ-1 для формирования биоплёнок и могут предполагать его роль в качестве адгезина.

Интерес представляют результаты влияния МКА к субъединицам КТ на образование биоплёнок. КТ является одним из основных факторов патогенности B. pertussis и обусловливает значительную часть симптомов заболевания у больных коклюшем. КТ является экзотоксином, секретируемым микробной клеткой, представляет собой белок с молекулярной массой 117 кДа. Молекула токсина состоит из двух функциональных частей (А и В) и 5 структурных единиц (S1, S2, S3, S4 и S5). Фрагмент А токсина соответствует структурной S1-субъединице, которая обладает ферментативной активностью и катализирует АДФ-зависимое рибозилирование белка клеточной мембраны трансдуцина. Последнее приводит к нарушению контроля функционирования аденилатциклазы, накоплению цАМФ и нарушению функции клеток. Фрагмент В молекулы КТ состоит из S2-, S3-, S4- и S5-субъединиц и отвечает за связывание с рецепторами клеток-мишеней [14][15]. Подавление роста биоплёнок МКА к S2- и S3-субъединицам КТ может указывать на их роль в качестве факторов адгезии. Однако МКА к S1-субъединице также подавляли рост биоплёнок. В связи с этим нельзя исключить роль КТ в формировании биопленок как фактора «поверхностного кондиционирования». По данным ряда авторов, «поверхностное кондиционирование» является одним из факторов образования биоплёнок и заключается в адсорбции на субстрате белков, липидов, полисахаридов и других молекул внеклеточного матрикса, что приводит к модификации его поверхности и влияет на процессы адгезии микроорганизмов [7]. Можно предположить, что связывание МКА к S1-субъединице с молекулой КТ может приводить к конформационным изменениям его молекулы, меняющих его способность к связыванию с субстратом.

В целом приведённые данные указывают на значение в формировании биоплёнок как поверхностных структур микробных клеток (ФГА, АГ-1 и -2), так и секретируемого ими КТ. Полученные результаты свидетельствуют о сложности процесса образования и иммунного подавления биоплёнок B. pertussis и целесообразности дальнейших исследований этой области, в частности изучение значения других патогенных факторов коклюшного микроба.

1. МУК 4.2.2317-08. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. М.; 2009.