Фавипиравир: скрытая опасность мутагенного действия

Полный текст

Введение

Хорошо известно, что вирусы являются облигатными паразитами, полностью зависимыми от организма-хозяина. Это свойство вирусов существенно затрудняет создание и поиск лекарственных средств, которые способны специфически ингибировать вирус, но при этом не оказывать вредного воздействия на биохимические процессы макроорганизма-хозяина. Данное обстоятельство является главной причиной ограниченности арсенала активных противовирусных препаратов. Пандемия COVID-19 еще раз обнажила данную медицинскую проблему, поскольку на сегодня в медицинской практике практически отсутствуют специфические лекарства против данного коронавируса.

На текущий момент можно выделить 6 главных направлений разработки лекарств в отношении коронавирусов:

1) ингибиторы вирусной полимеразы;

2) ингибиторы вирусной протеазы Мpro, участвующей в формировании активной полимеразы вируса;

3) ингибиторы клеточных протеаз, участвующих в активации вирусного белка S, регулирующего вход вируса в клетку-мишень;

4) ингибиторы депротеинизации вируса в клеточных эндосомах;

5) препараты, полученные на основе рекомбинантных интерферонов-α2 и -β1;

6) препараты, созданные на основе противовирусных антител [1][2].

В каждом из перечисленных направлений ведутся интенсивные исследования по поиску и созданию эффективных лекарств противовирусного действия.

В последний год в связи с поиском и созданием химиопрепаратов против COVID-19 пристальное внимание обращено на лекарства из первой группы — ингибиторы вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RNA dependent RNA polymerase — RdRp). В частности, надежды возлагают на вещество, получившее название фавипиравир (ФП) — 6-фтор-3-гидрокси-пиразинкарбоксамид [3][4]. Данное вещество было синтезировано и запатентовано японскими учеными Y. Furuta и H. Egawa в конце 1990-х гг. [5]. Последующие исследования показали, что данное соединение обладает высокой активностью в отношении большой группы вирусов, включая РНК-содержащие вирусы, такие как вирусы гриппа, бунья-, арена-, флави-, пикоранавирусы и др. Серьёзным недостатком ФП является его выраженная побочная токсичность для реципиентного макроорганизма, которая обусловлена тератогенными и эмбриотоксическими свойствами препарата [6][7]. По этой причине в мировой практике ФП разрешён к ограниченному применению при строгом врачебном контроле при угрожающем течении гриппа или COVID-19.

По структуре ФП имеет заметное сходство с нуклеозидами и функционально конкурирует с гуанозином и аденозином (рис. 1), обладая способностью связываться с вирусными РНК-полимеразами и ингибировать их функцию [8]. Поскольку РНК-полимеразы многих вирусов имеют консервативную структуру и сходный механизм катализа [9][10], ФП, нарушая специфическую функцию RdRp, обладает активностью в отношении широкого круга РНК-содержащих вирусов [4][8][11]. Однако в последнее время появились сообщения о наличии вирус-специфичных различий связывания ФП в области нуклеотид акцепторного центра у РНК-полимераз различных вирусов [12].

Рис. 1. Структура и внутриклеточная модификация ФП.
а — ФП; б — ФП-рибозилмонофосфат; в — ФП-рибозилтрифосфат. КДГ — клеточная ксантиндегидрогеназа.
Fig. 1. Structure and intracellular modification of favipiravir.
а — favipiravir; b — favipiravir ribofuranosyl monophosphate; c — favipiravir ribofuranosyl triphosphate. XDG — cellular xanthine dehydrogenase.

ФП как аналог гуанозина эффективно распознается и модифицируется клеточными ферментами, в частности гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазой (HGPRT), посредством присоединения остатка рибозы (рибозилирования) [13–15]. Образовавшийся ФП-рибозилфосфат претерпевает дополнительное фосфорилирование рибозильного остатка, приобретая свойства нуклеозидтрифосфата (ФП-рибозилтрифосфата — ФПРТФ) и способность встраивания в цепочку вновь синтезируемой молекулы вирусной РНК посредством вирусной RdRp [16][17]. Встраивание нуклеозидных аналогов в вирионную РНК затрудняло и нарушало комплементарное спаривание оснований при матричном синтезе цепочек РНК вирусной полимеразой.

Во-первых, ФП-зависимое затруднение спаривания оснований вызывало преждевременную терминацию синтеза цепей РНК и образование коротких дефектных фрагментов вирусных РНК [18][19].

Во-вторых, встраивание ФП в синтезируемую новую цепь РНК происходило с нарушением уотсон-криковского спаривания и приводило к мутациям (транзициям), преимущественно двух типов: G→A и C→U [8][16][20–22]. Частота таких ошибок в вирусных РНК в инфицированных клетках возрастала с увеличением концентрации ФП в питательной среде. При этом уровень мутаций, особенно транзиций G→A и C→U, в вирусных РНК возрастал в 3–12 раз в инфицированных клетках, инкубируемых с ФП, и достигал уровня 10–1 мутаций/нуклеотид в вирусном геноме при концентрации ФП 500 мкМ [23]. Подавляющая часть мутированных молекул РНК была нефункциональной, что оказывало летальное мутагенное действие на размножение вируса, т.к. нарушало образование полноценного инфекционного вируса и приводило к формированию неинфекционной вирусной популяции и заметному снижению инфекционного процесса [24][25]. В результате ФП-индуцированного мутагенного действия развивался так называемый абортивный тип вирусной инфекции. При этом важно иметь в виду, что мутагенное действие ФП не приводило к полному подавлению размножения вируса. Так, при концентрации ФП в среде 500 мкМ, которая рассматривается как эффективная терапевтическая [3, 26–30], урожай инфекционных вирусных частиц снижался лишь в 100–1000 раз до уровня около 10³ инфекционных частиц в 1 мл питательной среды [23][31].

На рис. 2 схематически проиллюстрировано трехстороннее соотношение: (1) нарастание мутаций (транзиций) в геноме вируса по мере (2) снижения количеств вновь синтезируемого инфекционного вируса в популяции, формирующейся (3) при увеличении концентрации ФП в инкубационной среде заражённых клеточных культур. Наиболее опасной в плане появления вирусных мутантов служит зона средних концентраций ФП (отмечена штриховкой на рис. 2), когда при наличии относительно высокого уровня мутаций вирус еще сохранял инфекционность и способность к размножению. Вполне очевидно, что сохранившийся остаточный пул мутированных и инфекционных вирионов формировал основу для отбора мутантных вариантов вируса с непредсказуемыми и опасными свойствами, включая приобретение резистентности к химиопрепарату, расширение органного пантропизма и усиления его патогенности для людей.

Рис. 2. Динамика соотношения уровня мутаций в геноме вируса и его инфекционности при изменении концентрации ФП в инкубационной среде.
Представлены обобщённые концептуальные параметры, полученные на культурах инфицированных вирусами клеток, которые оказались сходными для вирусов COVID-19, гриппа, Коксаки, Эбола и др. [8][16][21][22].
По осям ординат: слева — количество инфекционных вирионов в 1 мл культуральной среды (кривая 1); справа — число мутаций на 1 нуклеотид в геноме вируса (кривая 2).
По оси абсцисс — концентрация ФП (мкМ) в культуральной среде инфицированных клеток.
Fig. 2. Dynamics of the correlation between the virus genome mutations and virus infectivity developing under increasing concentrations of FP in the incubation medium in cell culture experiments.
Consolidated conceptual parameters obtained on cultures of cells infected with viruses are presented, which appeared to be similar for the SARS-CoV-2, influenza, Coxsackie, Ebola viruses, etc. [8][16][21][22].
The left Y-axis shows the number of infectious virions per 1 ml of the culture medium (curve 1); the right Y-axis shows the number of mutations per nucleotide in the virus genome (curve 2). The X-axis shows the concentration of FP (μM) in the culture medium of infected cells.

Мишени противовирусного действия фавипиравира

Противовирусное действие ФП складывается из трех главных механизмов, которые обусловлены его структурными свойствами аналога пиримидинового нуклеозида. Благодаря такому сходству молекулы рибозилированного ФП функционально конкурируют с гуанозином и аденозином и их РТФ в биосинтетических путях (каскадах) в инфицированных клетках, происходящих с участием вирусной RdRp. В результате такой интерференции ФП нарушает процесс синтеза полноценных молекул вирусных РНК, что приводит к подавлению репродукции вируса [8][16][21][22]. Известны три главные мишени противовирусного действия ФП.

1. Прямое ингибирование вирусных полимераз

Это действие ФП обусловлено прямым узнаванием и связыванием нуклеозидной формы ФП-РТФ вирусными РНК-полимеразами, включая полимеразу коронавирусов, и блокированием её полимеразной функции. В результате замедляется и снижается синтез вирусных молекул в инфицированных клетках [4]. Эти исследования наиболее широко проведены на вирусах гриппа. Но поскольку механизмы каталитического действия вирусных РНК-полимераз имеют значительное структурное и функциональное сходство, есть все основания полагать, что они имеют общие параметры и характерны для полимераз большинства семейств РНК-содержащих вирусов, включая вирусы гриппа, коронавирусы, пикорна-, арена-, рабдо-, парамиксо-, флави-, гепадно-, норовирусы и др. [10][23][32]. Следует отметить, что среди РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза COVID-19 по скорости присоединения нуклеотидов в 10 раз превосходит РНК-полимеразы вирусов гриппа, ящура и Эбола [23]. Такая быстрота коронавирусной полимеразы, необходимая коронавирусам для транскрипции гигантского генома около 30 × 10³ нуклеотидов, делает РНК полимеразу (белок nsp12) наименее точной и допускающей в несколько раз больше ошибок (мутаций), чем РНК-полимеразу других вирусов. Мутагенное действие ФП усугубляет эту особенность полимеразы коронавируса COVID-19 и дополнительно повышает уровень мутаций в 3–12 раз, что способствует эффективности его летального мутагенеза на коронавирусы.

Вместе с тем коронавирусы, в отличие от других РНК-вирусов, имеют белок nsp14, который обладает функцией уточнения матричного считывания для исправления части сделанных ошибок и компенсации действия ФП [33]. Важная особенность ФП состоит в том, что его эффектор ФП-РТФ обладает высокой избирательностью на вирусный синтез и практически не влияет на клеточный метаболизм, поскольку такого класса ферментов, как RdRp, нет в клетках млекопитающих. Так, сравнение RdRp вируса гриппа с ДНК-зависимой РНК-полимеразой клеток млекопитающих показало, что 50% ингибирующая концентрация активного вещества для ФП в отношении указанных РНК-полимераз составляла 0,3 мкМ и более 950 мкМ соответственно [3].

2. Преждевременная терминация синтеза вирусных РНК

ФП, имея лишь частичное сходство с пуриновым основанием гуанина и в некоторой степени аденина, не может обеспечить полноценную комплементарность его спаривания с цитозином и урацилом при синтезе дочерних молекул РНК [11]. Отсутствие полной комплементарности затрудняет работу полимеразы и вызывает ее остановку на матрице РНК, что приводит к преждевременному обрыву синтеза РНК и формированию коротких молекул РНК [18][19]. Важно отметить, что доля гуанина в геноме SARS-CoV-2 невысока (около 17,5%), поэтому терминирующее действие ФП, направленное на это основание, может дополнительно усиливать летальный эффект на данный вирус [23]. Феномен образования преждевременно терминированных дефектных вирусных РНК, интерферирующих с полноценными вирусными молекулами РНК, приводит к ингибированию размножения вируса [8][16][21][22].

3. Встраивание ФП-РТФ в молекулы РНК и образование мутантных форм вируса

ФП-РТФ способен встраиваться в синтезирующиеся молекулы вирусных РНК и вызывать мутации в геномной или субгеномной РНК, которая входит в состав синтезируемых вирионов. В результате этого механизма формируется вирусная популяция дефектных неинфекционных вирионов, которые составляют подавляющую часть вирусной популяции при высоких концентрациях ФП (250 мкМ и более) [8][16][20][21][22]. Такие мутантные вирионы не способны поддерживать полноценное многоцикловое размножение вируса, но могут инициировать так называемую абортивную инфекцию клеток-мишеней без образования полноценного инфекционного вируса. Данный механизм получил название мутагенного действия химиопрепарата на вирусное потомство. Поскольку ФП-РТФ является аналогом (конкурентом) гуанозина и частично аденозина (A/G), его мутагенное действие в инфицированных вирусом клетках приводит к заменам (так называемым транзициям) в вирусном геноме главным образом двух типов: G→A и C→U [31]. Это структурно-функциональное свойство ФП лежит в основе его мутагенного действия.

Особенности и последствия мутагенного действия фавипиравира

В результате мутагенного действия ФП его применение приводит к значительному повышению частоты мутаций в геноме синтезируемых вирионов. Прирост таких мутаций имеет дозозависимый характер: при более высоких концентрациях препарата (> 100 мкМ) частота составляет 10^–1–10^–2 мутаций на 1 нуклеотид в геноме, тогда как при пониженных концентрациях эта величина находится на уровне 10^–3 (рис. 2) [16][26][31]. Такой эффект мутагена порождает два важных последствия. При высоких концентрациях ФП количество мутаций чрезмерное, что несовместимо с жизнеспособностью образующегося вирусного потомства, — так называемое летальное действие. При низких концентрациях количество мутаций заметно снижается, но остается достаточным для обеспечения заметного повышения генетического разнообразия вирусного потомства на фоне сохранения его жизнеспособности [23][31].

Стимулирование мутагенеза вирусного генома приводит к ускорению микроэволюции вируса. Во-первых, при усиленном мутагенезе возрастает частота возникновения мутантных форм вируса, устойчивых к самому мутагенному препарату, так называемых ускользающих вирусных мутантов [8][11][22]. Во-вторых, за счет возникающих мутантных форм вируса возрастает общее генетическое разнообразие вирусной популяции, что заметно увеличивает вероятность появления опасных вирусных вариантов, обладающих повышенной контагиозностью и патогенностью для человека и расширенным кругом хозяев, создающим предпосылки перехода таких мутантных вариантов на домашних и сельскохозяйственных животных и формирования новых связей в круге хозяев вируса между человеком и животными. В результате могут возникать новые миграционные потоки вируса между различными видами животных, а также человеком.

Усиление процесса появления мутантных форм вируса в результате широкого лечебного применения мутагенного препарата(ов) может спровоцировать опасную эпидемическую проблему. Эта проблема возникновения опасных вирусных мутантов представляется особенно реальной в случае бессистемного применения химиопрепаратов мутагенного типа, особенно в случае свободного доступа к лекарству при отсутствии эффективного врачебного контроля его применения и мониторинга используемых терапевтических доз.

Пути снижения рисков появления опасных вирусных мутантов при применении химиопрепаратов мутагенного типа действия

При применении химиопрепаратов, обладающих мутагенным действием на вирус, для повышения мутагенного порога, затрудняющего возникновение генетического разнообразия инфекционного вируса и появление опасных вирусных мутантов, логично предложить три основных и практически реализуемых пути.

Первый путь для минимизации угрожающего мутагенного эффекта на вирус состоит в усовершенствовании структуры химиопрепарата. Модификация структуры мутагенного химиопрепарата, в частности ФП, должна заключаться в том, чтобы устранить его способность встраиваться в синтезируемую цепочку РНК и тем самым вызвать терминацию её элонгации и обрыв последующего синтеза полноценной молекулы. Достижение такой цели возможно, с одной стороны, путём заметного усиления аффинности нуклеозидной части препарата к полимеразе, чтобы сделать необратимым их комплексирование. С другой стороны — путём изменения структуры рибозил-трифосфатной группы, чтобы заблокировать и сделать невозможным образование фосфодиэфирной связи между химиопрепаратом и последующим нуклеотидным основанием, что остановит элонгацию и вызовет обрыв синтезируемой молекулы РНК.

Второй путь, затрудняющий появление опасных мутантов вируса, состоит в использовании комбинаций химиопрепаратов с различным механизмом действия, направленных на различные вирусные и/или клеточные мишени. Имеются многочисленные данные для многих химиопрепаратов, действующих на различные вирусные белки (ферменты), включая вирусную полимеразу, о том, что пассирование вирусов в присутствии одного химиопрепарата (так называемая монотерапия) приводит к быстрому формированию вирусных мутантов, устойчивых к данному химиопрепарату [8][11][22]. Как правило, устойчивый штамм имел мутацию в вирусном гене белка, против которого был направлен химиопрепарат. Однако в случае совместного (параллельного) применения 2 и более химиопрепаратов, действующих на различные вирусные и/или клеточные мишени, не удается наблюдать формирования мутантных штаммов даже после длительного пассирования вируса в присутствии комбинации химиопрепаратов [34–37]. На основании этих данных представляется рациональным и оправданным применение противовирусных химиопрепаратов, включая ФП, в комбинациях, в которых химиопрепараты имеют различные мишени противовирусного действия. Более того, такое комбинированное применение противовирусных лекарств имеет, как правило, значительно более высокую терапевтическую эффективность и синергидный противовирусный эффект [38–42].

Третий путь, позволяющий предотвратить опасные последствия мутагенного эффекта ФП, заключается в соблюдении диапазона оптимальных высоких доз препарата в организме реципиента. Таким ориентиром диапазона можно считать уровень перманентной концентрации в организме не менее 75 мкМ (~30 мг/кг массы) [23][26]. Оценка мутагенных концентраций ФП в культуре инфицированных вирусом гриппа клеток показывает, что концентрация 125 мкМ и выше обеспечивает эффективную терминацию синтеза вирусных РНК и их летальный мутагенез, что заметно тормозит образование жизнеспособных вирионов [8][16][21][22][26][43]. Экстраполяция этой концентрации с учетом биодоступности в организме человека даёт поддерживающую терапевтическую дозу химиопрепарата 20–50 мг/кг массы пациента в сутки и выше [44]. При снижении лечебных концентраций ФП в организме инфицированного пациента будут синтезироваться значительные количества угрожающих мутантных форм вируса разной степени инфекционности и с непредсказуемыми свойствами.

Заключение

Усиление синтеза мутантных форм вирионов под действием ФП несет угрозу появления новых опасных вирусных штаммов с повышенной патогенностью для человека и животных и приобретенной устойчивостью к химиопрепарату. Для минимизации мутагенного эффекта ФП возможны синтез новых модификаций ФП, лишённых способности встраиваться в молекулу синтезированной РНК; комбинированное применение ФП с противовирусными химиопрепаратами иного механизма и направленными на различные вирусные и/или клеточные мишени; непрерывное применение при строгом врачебном контроле высоких терапевтических доз ФП для усиления летального мутагенного эффекта на инфекционный вирус в организме-реципиенте для предотвращения размножения его мутантных форм.

Об авторах

О. П. Жирнов

Автор, ответственный за переписку.
Email: zhirnov@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-3192-8405

Жирнов Олег Петрович — доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, рукководитель лабораторией вирусного патогенеза Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; рукководитель лабораторией вирусного патогенеза Русско-немецкой академии медико-социальных и биотехнологических наук

Москва

А. И. Чернышова

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1290-4042

Чернышова Алёна Игоревна — младший научный сотрудник лаборотории иммунологии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; научный сотрудник Русско-немецкой академии медико-социальных и биотехнологических наук

Москва

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Структура и внутриклеточная модификация ФП. а — ФП; б — ФП-рибозилмонофосфат; в — ФП-рибозилтрифосфат. КДГ — клеточная ксантиндегидрогеназа.

Скачать (14KB)

Метаданные

3. Рис. 2. Динамика соотношения уровня мутаций в геноме вируса и его инфекционности при изменении концентрации ФП в инкубационной среде. Представлены обобщённые концептуальные параметры, полученные на культурах инфицированных вирусами клеток, которые оказались сходными для вирусов COVID-19, гриппа, Коксаки, Эбола и др. [8, 16, 21,22]. По осям ординат: слева — количество инфекционных вирионов в 1 мл культуральной среды (кривая 1); справа — число мутаций на 1 нуклеотид в геноме вируса (кривая 2). По оси абсцисс — концентрация ФП (мкМ) в культуральной среде инфицированных клеток.

Скачать (14KB)

Метаданные